Anàlisi fitoquímica, antiproliferativa in vitro, antioxidant part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Antecedents:Rumex rothschildianus és l'únic membre d'una secció única del gènere Rumex, a la família Polygonaceae. Aquesta espècie és un petit dioic anual molt rar, endèmic de Palestina que s'utilitza tradicionalment com a aliment i per al tractament de diverses malalties. Per tant, la investigació actual tenia com a objectiu examinar els components químics, antioxidants, anti-amilasa, anti-a-glucosidasa, efectes anticipats i citotòxics de quatre fraccions de dissolvents de fulles de R. rothschildianus.

Mètodes:La pols seca de fulles de R. rothschildianus es va extreure en quatre dissolvents amb polaritats diferents. Es van realitzar diverses proves fitoquímiques qualitatives i quantitatives per determinar els components dels extractes. L'anàlisi colorimètrica es va utilitzar per a la determinació quantitativa de fenols, flavonoides i tanins. Es van realitzar assajos in vitro per avaluar els extractes d'antioxidants, anti-a-amilasa, anti-a-glucosidasa i anticipar activitats inhibidores, així com la citotoxicitat mitjançant assaig MTS contra la línia de cèl·lules de carcinoma cervical (HeLa) i la línia cel·lular de càncer de mama. (MCF7).

Feu clic aquí per saber-ne més

Resultats:La fracció d'acetona de les fulles de R. rothschildianus va mostrar la més significativaantioxidantactivitat, pel fet de tenir el contingut més alt de flavonoides i fenòlics, amb un valor ICso de 6,3±0,4 ug/ml, en comparació amb 3,1±{0},9 ug/ml per a Trolox, i pel que fa a Activitat d'inhibició de la lipasa, la fracció d'acetona va mostrar l'activitat més potent amb un valor ICso de 26,3±{{10}},6 ug/ml, en comparació amb el control positiu d'orlistat ICso 12,3 ug/ml. El mateix extracte va ser l'inhibidor més potent de l'a-amilasa i l'a-glucosidasa, amb valors d'ICso de 19,1±0,7 ug/ml i 54,9±{0},3 ug/ml, respectivament, en comparació. a 28,8, 37,1±0,3 ug/i d'acarbosa, respectivament. La fracció d'hexà va mostrar un 99,9 per cent d'inhibició de les cèl·lules HeLa i un 97,4 per cent d'inhibició de les cèl·lules MCF7.

Conclusió:La fracció d'acetona de les fulles de R. rothschildianus podria proporcionar una font de compostos bioactius per al tractament de l'estrès oxidatiu. De la mateixa manera, la fracció d'hexà indica el potencial antitumoral prometedor de R. rothschildianus. És evident que aquestes indicacions inicials necessiten una purificació addicional de compostos potencialment actius i, en última instància, estudis in vivo per determinar la seva eficàcia.

Paraules clau:Rumex rothschildianus, antioxidant, lipasa, amilasa, trolox, fitoquímica, activitat antiproliferativa

Fons

Les plantes s'han utilitzat com a teràpies des de l'antiguitat. Les arrels, les llavors, l'escorça, les fulles i les flors s'han utilitzat amb finalitats reparadores. En l'actualitat, hi ha medicaments sintètics disponibles i són efectius en el tractament d'una àmplia gamma de malalties; no obstant això, algunes persones encara prefereixen les herbes medicinals, ja que es consideren menys perjudicials per al cos humà [1,2]. Les plantes medicinals són per definició la font de compostos fitoquímics que posseeixen activitats terapèutiques. Aquestes propietats depenen de la presència de diferents metabòlits secundaris, com ara fenòlics, terpenoides i alcaloides [3]. Rumex rothschildianus Aarons. és l'únic membre d'una secció única del gènere Rumex, a la família Polygonaceae. Aquesta espècie és una petita molt rara dioicament anual, endèmica a Palestina. Té una alçada mitjana de 45 cm i es caracteritza per tenir tiges erectes que sostenen fulles radicals peciolades, que són curtes a la base i curtes a l'àpex. Les flors tenen un diàmetre de 3-4 mm, mentre que les flors pistilades fan uns 2 mm de diàmetre amb una capa membranosa coriàcia [4]. Rumex spp. estan molt estesos a diferents regions de Turquia, i estan representats per 22 espècies. Algunes de les espècies més comunes són R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus i R. caucasicus són plantes perennes distribuïdes al centre i l'est d'Anatòlia a una altitud de {{10} }} m sobre el nivell del mar. El gènere Rumex s'ha utilitzat àmpliament en la medicina tradicional a Turquia per tractar trastorns, com el restrenyiment, la diarrea i l'èczema [5, 6]. El gènere també té alguns efectes laxants, diürètics, antipirètics, cicatritzants i antiinflamatoris. Molta gent a la part oriental de Turquia utilitzen les fulles joves de Rumex spp. com a conservant en formatges, a més de donar aroma als aliments [7].

S'han dut a terme diverses investigacions sobre espècies de Rumex, com ara activitats antimicrobianes que s'estan informant d'algunes espècies. Anteriorment s'han trobat alguns fitoquímics bioactius a Rumex vicario L, com carotenoides, tocoferols, polifenols, flavonoides i àcid ascòrbic, que tenen un paper com a antioxidants i agents desintoxicants naturals. La ingesta dietètica de fitoquímics antioxidants, com els carotenoides,fenòlics, iflavonoidespot protegir contra malalties no transmissibles en humans, com ara càncer, trastorns cardiovasculars i altres problemes de salut relacionats amb l'estrès oxidatiu [5, 8]. Se sap que els radicals lliures nocius tenen un paper important en molts problemes de salut importants, com ara càncer, malalties cardiovasculars, artritis reumatoide, cataractes,Malaltia d'Alzheimer, i altres malalties degeneratives relacionades amb l'envelliment. Els antioxidants són components beneficiosos que neutralitzen aquests radicals lliures abans que puguin atacar les cèl·lules i, per tant, eviten danys a les proteïnes, els lípids i les proteïnes cel·lulars.hidrats de carboni. S'ha proposat una varietat d'antioxidants tant naturals com sintètics per al tractament de malalties humanes. Aquest interès pel paper dels antioxidants en la salut humana ha impulsat la investigació en els camps de la ciència dels aliments i les herbes medicinals, avaluant la funció de les herbes com a antioxidants. L'acció antioxidant inclou la capacitat d'eliminar els radicals lliures, la inhibició de la peroxidació lipídica, la capacitat quelant dels ions metàl·lics i també la capacitat de reducció [9,10].

El càncer és un dels problemes de salut més globals. El desenvolupament i el descobriment de nous medicaments contra el càncer segueixen sent extremadament importants a causa de diversos factors. Aquests factors inclouen tractaments que poden causar efectes secundaris importants o poden ser bastant cars. Les alternatives que siguin biològicament més segures i més assequibles segueixen sent molt desitjables [11-14].

Diverses espècies vegetals es consideren fonts potencials de molècules bioactives com l'atropina de les fulles de Belladona, la cocaïna de les fulles de coca, la vincristina de la planta Vinca i moltes altres que encara tenen un paper important en la medicina moderna [15,16].

Els efectes terapèutics útils poden provenir de la barreja de productes secundaris presents a les plantes medicinals. Aquests compostos són majoritàriament metabòlits secundaris, com alcaloides, esteroides, tanins, flavonoides i fenòlics, que es sintetitzen i es dipositen en parts específiques d'aquestes plantes [17,18]. El present estudi investiga les activitats in vitro anti-a-amilasa, anti- -glucosidasa, anti-lipasa, antiproliferatives i antioxidants de diferents fraccions extretes de fulles de R. rothschildianus.

Mètodes

Material vegetal, productes químics i instruments

Les fulles de R. rothschildianus es van collir de les regions occidentals de Palestina, entre febrer i març de 2018. Les va identificar el doctor Nidal Jaradat, del Laboratori de Farmacognòsia de la Universitat Nacional d'An-Najah, amb el codi d'exemplar de val Pharm-PCT{{3} }. Tots els productes químics es van comprar a Sigma-Aldrich. Un espectrofotòmetre UV/Visible (grau Jenway 7135, Stafford-shire, Regne Unit), papers de filtre (Whitman No. 1, Washington, EUA), dispositiu agitador (Memmert 531-25-1, Estocolm, Suècia), aparell rotavap (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Alemanya), molinet (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Xina), balança electrònica (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Polònia), liofilitzador-BT85 Es van utilitzar (Millrock Technology, Xina) i crio-dessecador (Mill-Rock Technology, BT85, Kingston, EUA).

Preparació d'extractes i fraccionament

La pols seca de fulles de R. rothschildianus es va extreure afegint dissolvents seqüencialment en funció de la seva polaritat, començant pel dissolvent no polar hexà, i després acetona (un dissolvent orgànic apròtic polar), metanol (alcohol polar) i finalment aigua destil·lada (a dissolvent pròtic polar). Per a cada extracció, es van col·locar uns 25 g de fulles seques mòltes en 0,51 hexà durant 72 h en un dispositiu agitador a 100 rotacions per minut a 25 graus. En primer lloc, l'hexà es va substituir per 0,5 L d'acetona i, posteriorment, la substitució va implicar volums equivalents de metanol i aigua. Les incubacions en els dissolvents van ser les descrites anteriorment per a l'hexà. Cada fracció orgànica es va filtrar i es va concentrar al buit en un evaporador rotatiu, mentre que la fracció aquosa es va assecar amb un liofilitzador. Finalment, totes les fraccions brutes es van emmagatzemar a 4 graus [19, 20].

El rendiment de cada fracció es va calcular mitjançant la fórmula següent:

Avaluació fitoquímica preliminar

Es van realitzar proves de cribratge fitoquímic de fulles de R. rothschildianus en quatre fraccions per identificar metabòlits secundaris actius. Els resultats qualitatius es van expressar com (+) per a la presència i (-) per a l'absència de fitoquímics bioactius[10,21].

Determinació del contingut fenòlic total (TPC)

El procediment per determinar el TPC es va basar en el de Cheung et al. El TPC es va expressar en mil·ligrams d'equivalents d'àcid gàlic per gram de pes sec de fulles (mg GA/g de pes sec). Es va fer una solució de carbonat sòdic al 7,5% acabada de preparar col·locant 7,5 g de Na2CO3 en un matràs aforat i ajustant el volum a 100 ml amb aigua destil·lada. Es va preparar una solució estàndard de referència (solució d'àcid gàl·lic) dissolent 100 mg d'àcid gàl·lic en aigua destil·lada fins a un volum final de 100 ml. A partir d'això, es va realitzar una dilució en sèrie per obtenir solucions d'àcid gàl·lic a 100,70,50,40 i 10ug/ml）. Les solucions de reserva de les fraccions de les fulles es van preparar dissolent 100 mg d'extracte vegetal en aigua destil·lada i es van ajustar a un volum total de 100 ml. Les mescles de reacció es van preparar barrejant 0,5 ml de cada solució de fracció amb 2,5 ml de reactiu de Folin-Ciocalteu al 10 per cent, que es va dissoldre en aigua amb 2,5 ml de bicarbonat de sodi al 7,5 per cent. Els tubs de mostra es van incubar durant 45 minuts a 45 graus. A continuació, es va mesurar l'absorbància de cadascun en un espectrofotòmetre a una longitud d'ona de 765 nm. Les mostres de treball es van preparar per triplicat per a cada assaig analític, a partir del qual es van calcular els valors de la mitjana i la desviació estàndard [21].

Determinació del contingut total de flavonoides (TFC)

El TFC a les quatre fraccions de fulles de R. rothschildianus es va avaluar mitjançant una corba de calibratge de rutina (compost estàndard de referència). Els resultats es van expressar com a mil·ligrams d'equivalent de rutina per gram de pes sec d'extracte de fulles (mg RU/g de pes sec). Es va establir una corba de calibratge per a la rutina mitjançant dilucions en sèrie generades a partir d'una solució stock d'1{{10}}0 ug/ml. Per fer la solució madre, es van dissoldre 10 mg de rutina en 10 ml d'aigua destil·lada i després es van diluir a 100 ml. Posteriorment, la solució de reserva es va diluir per proporcionar rutina a concentracions de 10, 30, 40, 50, 70 i 100 ug/ml. Per a la preparació de la solució de treball, es van barrejar 0,5 ml de cada solució de fracció amb 3 ml de metanol, 0,2 ml d'AlCl3 al 10%, 0,2 ml d'acetat de potassi 1M i 5 ml d'aigua destil·lada, i després es va incubar a temperatura ambient durant 30 min. Els passos anteriors es van repetir per a cadascuna de les fraccions, després de la qual cosa es va mesurar l'absorbància a una longitud d'ona de 415 nm. Per a un control en blanc, es va establir una solució de treball amb aigua destil·lada en lloc de l'extracte de la mostra. Les mostres es van preparar per triplicat per a cada assaig analític, a partir del qual es van calcular els valors de la mitjana i la desviació estàndard [22].

Determinació del contingut total de taní (TTC) El protocol de Sun et al. es va utilitzar per determinar el TTC en les quatre fraccions de fulles de R. rothschildianus, sent el procediment més utilitzat. La catequina es va utilitzar com a compost de referència per construir una corba de calibratge. Es va preparar un estoc d'100 ug/ml en metanol, a partir del qual es va generar una sèrie de dilucions per donar concentracions de catequina de 10, 30, 50, 70 i 100 ug/ml. Es va preparar recentment una solució al 4 per cent de vainillina en metanol. Es van preparar solucions stock de les fraccions a 100 ug/ml utilitzant metanol com a dissolvent. Per a la solució de treball, es van barrejar 0,5 ml de cada solució de fracció amb 3 ml de solució de vainil·lina i 1,5 ml de HCl concentrat. La mescla es va deixar reposar durant 15 min, i després es va mesurar l'absorbància a 500 nm, utilitzant una solució de treball configurada amb metanol en lloc de l'extracte de mostra com a blanc. Totes les mostres de treball es van analitzar per triplicat, a partir dels quals es van calcular els valors de la mitjana i la desviació estàndard. El taní total de cada fracció es va expressar en termes d'equivalents de catequina (mg de CAE/g de pes sec de fulles)[23].

Mètode d'activitat antioxidant

L'assaig d'eliminació de radicals lliures 2,2-difenil-picrilhidrazil (DPPH) es va utilitzar per mesurar l'activitat antioxidant en les diferents fraccions de fulles de R. rothschildianus. Es va preparar una solució d'1000 ug/ml de cada fracció vegetal en metanol. A més, també es va preparar una solució de Trolox de 1000 ug/ml (l'estàndard de referència). Es va preparar una sèrie de dilucions a partir de les solucions stock per a cada fracció, donant sis dilucions en sèrie a 2, 5, 10, 20, 50 i 100 ug/ml. Es va barrejar un ml de cada dilució d'extracte amb 1 ml de 0,002 g/ml de DPPH en metanol. Es va afegir un ml de metanol per donar un volum de treball final de 3 ml. La solució de DPPH es va preparar recentment, ja que era molt sensible a la llum. El control en blanc de les concentracions en sèrie va ser DPPH en metanol en una proporció d'1:2, sense l'addició d'un extracte. Totes les solucions de treball es van incubar a temperatura ambient (25 graus) a la foscor durant uns 30 min. A continuació, es van mesurar les densitats òptiques amb un espectrofotòmetre a una longitud d'ona de 517 nm. Es va utilitzar l'equació següent per calcular el percentatge d'inhibició de DPPH per a cada fracció de planta, amb Trolox com a compost estàndard:

on, Ag és l'absorbància registrada de la solució en blanc i Ats és l'absorbància registrada de la solució de mostra provada [21].

Assaig d'inhibició de la lipasa pancreàtica porcina

Es van fer solucions stock de 500 ug/ml a partir de cada fracció de planta en un 10 per cent de DMSO. A partir d'aquests, es va fer una sèrie de dilucions de cinc concentracions de 50.100.200, 300 i 400 ug/ml. Es va preparar recentment una solució d'1 mg/ml de lipasa pancreàtica porcina en tampó Tris-HCl just abans de l'ús. El substrat, butirat de p-nitrofenil (PNPB) es va preparar dissolent 20, 9 mg en 2 ml d'acetonitril. Per a cada solució de treball, es va barrejar 0,1 ml de lipasa pancreàtica porcina amb 0,2 ml de fracció vegetal de cada membre de la sèrie de dilucions. Es va afegir Tris-HCl per fer que el volum final de les solucions de treball fos d'1 ml, i es van incubar a 37 graus C durant 15 min. Després de la incubació, es va afegir 0,1 ml de solució de p-nitrofenil butirat a cada tub d'assaig. A continuació, la barreja es va incubar durant 30 minuts més a 37 graus. L'activitat de la lipasa pancreàtica es va determinar mesurant la hidròlisi de PNPB en p-nitrofenolat a 410 nm, mitjançant un espectrofotòmetre UV. El mateix procediment es va repetir utilitzant orlistat com a compost de referència estàndard. El percentatge d'inhibició de la lipasa per fraccions vegetals es va calcular amb l'equació següent:

on, Ap és l'absorbància registrada de la solució en blanc i Ats és l'absorbància registrada de la solució de mostra provada [24]. Assaig inhibidor de l'amilasa

A100 mg de cada fracció es va dissoldre en uns quants mil·límetres d'10 per cent de DMSO, i després es va dissoldre fins a 100 ml en 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4, NaCl 0,006 M, pH 6,9 per donar finalment solucions stock amb concentracions de 1000 ug/ml. A partir d'aquestes, es van preparar les següents dilucions de 10,50,70,100 i 500 ug/ml, utilitzant un 10% de DMSO com a diluent. Es va barrejar un volum de 0,2 ml de 2 unitats/ml d'amilasa pancreàtica porcina amb 0,2 ml

fracció de planta i es va incubar durant 10min a 30 graus. Després de la incubació, es van afegir 00,2 ml d'una solució de midó a l'1 per cent acabada de preparar en aigua, i els tubs es van incubar durant almenys tres minuts més. En aquest punt, la reacció es va aturar afegint 0,2 ml de reactiu de color àcid 3,5-dinitro salicílic (DNSA) i es va diluir amb 5 ml d'aigua destil·lada, abans d'escalfar-se a 90 graus durant 10 minuts en aigua. bany. A continuació, la mescla es va refredar a temperatura ambient i es va mesurar l'absorbància a 540 nm. El control en blanc es va preparar utilitzant les mateixes quantitats descrites anteriorment, però substituint la fracció vegetal per tampó de 0,2 ml. L'acarbosa es va utilitzar com a referència estàndard seguint el procediment descrit anteriorment. L'activitat inhibidora de l'a-amilasa es va calcular mitjançant l'equació següent:

on, Ag: és l'absorbància de la mostra en blanc, i Ar és l'absorbància de la mostra de prova [25].

Aquest article està extret de Jaradat et al. BMC Medicina i Teràpies Complementàries (2021) 21:107