Lesió dels podòcits mitjançant la interacció entre Tlr8 i el seu lligand endogen MiR-21 en ronyó obstruït i col·lateral

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

disfunció erèctil cistanche relacionat amb el ronyó

Tot i que la malaltia renal crònica és freqüent en adults, s'ha informat de nefropatia obstructiva (ON) tant en pacients joves com grans. A ON, les lesions tubulointersticials (TIL) s'han investigat àmpliament, però les lesions glomerulars (GL) s'han descuidat en gran mesura. Aquí, mostrem un nou mecanisme subjacent al desenvolupament de GL a ON en ratolins joves i grans. Els TIL es desenvolupen abans que els GL a causa de la infiltració de cèl·lules inflamatòries al tubulointerstici, però els GL es desenvolupen després de l'activació del receptor Toll-like 8 (Tlr8) tot i que l'absència de cèl·lules inflamatòries que s'infiltren al glomèrul. Les proteïnes TLR8 i la interleucina 1 beta (IL1b) colocalitzen amb marcadors de funció de podòcits reductors (PFM), cosa que indica l'activació de la senyalització TLR8 en podòcits lesionats. A més, els nivells glomerulars i sèrics de miR-21, un lligand endogen per a Tlr8, eren més alts en el model de ratolí ON que en el control simulat. L'expressió glomerular de Tlr8 es correlaciona positivament amb miR-21 i les citocines aigües avall Il1b i Il6 i es correlaciona negativament amb PFM (Nphs1 i Synpo). També mostrem la colocalització de proteïnes TLR8 i IL1b amb PFM reductors tant en obstruït com encol · lateralronyonsde ratolins joves i grans. A més, els resultats de l'estudi in vitro van revelar una expressió més alta de Tlr8 i les seves citocines aigües avall en glomèruls obstruïts.ronyonsdesprés del tractament amb miR- 21 que en el control. En conclusió, la sobreexpressió de Tlr8 pot servir com a mecanisme plausible subjacent al desenvolupament de GL a ON a través de la lesió dels podòcits.

Paraules clau: malaltia renal crònica,nefropatia obstructiva, podòcit, TLR8, ronyó obstruït i col·lateral

INTRODUCCIÓ

Malaltia renal crònica (ERC), una preocupació important de salut pública, predomina entre el 8% i el 13% de la població general (1). És freqüent en persones grans a causa de l'envelliment de la societat. La nefropatia obstructiva (ON) és de gran interès per als metges, ja que s'ha informat en pacients de diferents grups d'edat. ON és tractable i reversible, a diferència d'altres ERC (2, 3). En nens, es produeix en un dels 1500 individus joves, i la seva prevalença arriba a l'1% -5% als països desenvolupats (4, 5). En adults, la prevalença de l'ON oscil·la entre 5 per 1000 i 5 per 10000 individus. A més, la prevalença de l'ON unilateral crònica és aproximadament del 0,5%, mentre que la de l'ON aguda unilateral i bilateral crònica és aproximadament del 0,1% (4-7).

L'ON pot provocar una lesió renal aguda o ERC, que comporta una disminució progressiva de la funció renal i alteracions de les estructures renals de més de 3 mesos (8, 9). L'obstrucció ureteral unilateral (UUO) és una estratègia àmpliament utilitzada per estudiar l'ON crònica. ON en un ronyó UUO es caracteritza per hipertròfia, hidronefrosi, reclutament de cèl·lules inflamatòries a la zona intersticial, mort de cèl·lules tubulars per hipòxia i deposició de col·lagen al tubulointerstici, seguida del desenvolupament de fibrosi tubulointersticial (TF) (10).

La TF és una característica important de la malaltia renal en fase terminal i un determinant important de la lesió renal progressiva (11). La TF s'ha investigat àmpliament en models ON, però les dades sobre la lesió glomerular, especialment les anomalies de la barrera sang-orina (BUB), són escasses (8, 9, 12). A més, els estudis han investigat les lesions tubulointersticials (TIL) al ronyó col·lateral en ON unilateral, però les lesions glomerulars (GL) s'han descuidat en gran mesura (12). Diversos informes han revelat la implicació dels capil·lars peritubulars en la progressió dels TIL en ON experimental (13, 14). Tanmateix, el glomèrul i el capil·lar glomerular drenen als segments tubulars de la nefrona i els capil·lars peritubulars, respectivament. Per tant, suggerim que la glomerulonefritis també pot afectar el tubulointerstici. Els nostres estudis anteriors han posat de manifest la contribució de la lesió a les cèl·lules intrínseques glomerulars, principalment podòcits, a GL i el posterior desenvolupament de TIL en un model de ratolí de malaltia autoimmune a causa de la sobreexpressió de diferents receptors Toll-like (TLR) (15-18).

L'endoteli capil·lar glomerular i els podòcits són importants guardians que inclouen BUB. Entre aquests dos epitelis, els podòcits estan exposats contínuament a senyals de perill, inclosos els lligands TLR com els patrons moleculars associats al perill (DAMP) o els patrons moleculars associats a patògens (PAMP), a causa de la seva localització única als glomèruls (15). Per tant, es creu que la interacció entre els TLR dels podòcits i els seus lligands endògens contribueix a la lesió dels podòcits en condicions no infeccioses. En el present estudi, ens hem centrat en el desenvolupament de GL tant en els ronyons obstruïts com en els col·laterals de ratolins joves i vells, ja que l'ON es troba freqüentment tant en humans joves com grans. Vam aclarir que GL es va desenvolupar a ON a causa de la lesió dels podòcits a través de la sobreexpressió de Tlr8 en podòcits tant de ronyons obstruïts com col·laterals de ratolins joves i vells.

MATERIALS I MÈTODES

Declaració ètica i allotjament d'animals experimentals Tots els experiments amb animals de laboratori van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Facultat de Medicina Veterinària de la Universitat de Hokkaido (aprovació núm. 16- 0124). Els autors van seguir la guia aprovada per a la cura i l'ús d'animals de laboratori de la Universitat d'Hokkaido, Facultat de Medicina Veterinària (aprovada per l'Associació per a l'avaluació i l'acreditació de la cura internacional dels animals de laboratori). Els ratolins C57BL/6N de sis setmanes es van comprar a Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japó) i es van mantenir en condicions específiques lliures de patògens en un entorn clar-fosc 1:1. Els animals d'experimentació van rebre menjar i aigua potable ad libitum.

Disseny experimental Hem utilitzat ratolins joves (9 setmanes) i vells (12 mesos). Els ratolins de cada grup d'edat (n=4) van ser sotmesos a operacions simulades (grup control) o UUO (2, 7, 11 i 21 dies) per establir un ronyó de model ON, tal com es descriu al nostre estudi anterior. (13).

Preparació de la mostra Els ratolins es van anestesiar profundament amb una barreja d'agents anestèsics tal com es va descriure anteriorment (16) i es van sacrificar per luxació cervical. Es van recollir mostres de sang a través de l'artèria femoral per a l'anàlisi de marcadors sèrics. Tant els ronyons UUO com els col·laterals es van recollir i es van tallar en rodanxes fines. Les rodanxes de ronyó es van fixar amb un 10% de formalina tampó neutra (NBF), un 4% de paraformaldehid (PFA) i un 2,5% de glutaraldehid (GTA) per a estudis histopatològics, immunohistoquímics i de microscòpia electrònica, respectivament.

Immunohistoquímica i immunoffluorescència Els blocs de parafina fixats amb NBF es van tallar a 2 mm de gruix i es van tacar amb àcid periòdic Schiff-hematoxilina (PAS-H) per examinar la histopatologia renal. La immunodetecció de marcadors cel·lulars es va realitzar com es va informar anteriorment (16) per a cèl·lules B (B220), cèl·lules T (CD3), endoteli capil·lar (CD31), IL1b, macròfags (Iba1), podòcits (podocina i sinaptopodina) i TLR8. Les condicions de tinció es mostren a la taula 1.

La histoplanimetria PAS-H i les seccions de ronyó immunotingudes es van convertir en diapositives virtuals mitjançant Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japó). Les cèl·lules positives es van comptar a partir de 20 glomèruls o 20 focus seleccionats aleatòriament del tubulointerstici amb un augment de 400x mitjançant el programari NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). També es van capturar imatges de 20 glomèruls de seccions tacades de PAS-H a 400x de cada ratolí mitjançant un microscopi de fluorescència tot en un BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japó). L'àrea i la mida mesangial glomerular es van mesurar a partir d'imatges capturades mitjançant un analitzador BZ-X (Keyence).

L'aïllament del glomèrul per a l'extracció i el cultiu d'ARN Els glomèruls de ronyons simulats i UUO es van aïllar tal com es va descriure anteriorment (16). Breument, els ratolins van ser anestesiats profundament i perfusats pel ventricle esquerre amb 40 ml de solució de sal equilibrada de Hank (HBSS) que contenia Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Es va extirpar el ronyó

i tallat a trossos petits. A continuació, les cèl·lules es van digerir amb col·lagenasa A (1 mg/mL; Roche, Basilea, Suïssa) i desoxiribonucleasa I (100 U/ml; Life Technologies) en HBSS a 37 graus durant 30 min. La suspensió que contenia teixit digerit es va pressionar suaument a través d'un colador de cèl·lules de 100- mm (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, EUA) amb una mà de mà aplanada. La suspensió cel·lular resultant es va centrifugar a 200 × g durant 5 min i el pellet cel·lular es va tornar a suspendre en 2 ml de HBSS. Els glomèruls que contenien Dynabeads es van recollir mitjançant un concentrador de partícules magnètiques (Life Technologies) i es van utilitzar per aïllar l'ARN.

Transcripció inversa i PCR en temps realL'ARN total es va aïllar dels glomèruls mitjançant un kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanya). L'ADNc es va sintetitzar a partir de l'ARN total mitjançant transcripció inversa mitjançant l'enzim de transcriptasa inversa ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japó) i cebadors dT aleatoris (Promega). L'ADNc es va utilitzar en PCR en temps real amb la mescla mestra Brilliant III SYBR Green QPCR i Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, EUA). L'expressió gènica glomerular es va normalitzar a l'expressió d'Actb. Els parells d'imprimadors utilitzats es mostren a la taula 2.

Transcripció inversa i PCR en temps real basada en TaqManL'ARN total, inclòs el microARN (miRNA) als glomèruls aïllats, es va aïllar mitjançant un kit miRNeasy (Qiagen). Els primers RT de bucle de tija específics de miRNA, la transcriptasa inversa, el tampó de transcripció inversa, els dNTP i l'inhibidor de la RNasa es van utilitzar per transcriure l'ARN total segons les instruccions del fabricant (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). La PCR en temps real es va realitzar amb l'ADNc resultant mitjançant primers TaqMan específics de miR-21- i sondes específiques (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) i Mx3000P (Agilent Technologies).

Tractament in vitro de glomèruls aïllats amb imitacionsEls glomèruls es van aïllar d'operacions simulades i UUOronyonsdesprés d'11 dies d'obstrucció. El medi del Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) (Fujifilm Wako, Japó) que contenia 300 glomèruls es va distribuir a cada pou d'una 96-placa de cultiu de pou (TPP, Trasadingen, Suïssa) i tractat amb PBS, control negatiu i miR-21 (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Corea del Sud) a 1 pmol/µL durant 4 h a 37 graus en un 5% de CO2. L'expressió de Tlr8 i les seves citocines aigües avall es va mesurar tal com es descriu a la secció anterior.

Microscòpia electrònica d'escaneigPer a la microscòpia electrònica d'exploració rutinària (SEM), petitaronyó rodanxeses van fixar amb un 2,5 per cent de GTA durant 4 h i es van fixar posteriorment amb un 1 per cent de tetròxid d'osmi durant 1 h, seguit d'un tractament amb un 1 per cent d'àcid tànnic durant 1 h. A continuació, es van fixar les mostres amb un tetròxid d'osmi a l'1 per cent durant 1 h i es van tractar amb 0, 5 per cent i 1 per cent d'àcid tànnic durant 10 min i 1 h, respectivament.Ronyórodanxeses van deshidratar amb graus ascendents d'alcohol, es van transferir a 3-acetat de metil butil i, finalment, es van assecar amb un assecador de punt crític HCP-2 (Hitachi, Tòquio, Japó). Les mostres van ser sotmeses a polverització iònica i després examinades amb un microscopi electrònic d'escaneig S-4100 a una tensió accelerada de 12 kV.

Anàlisi estadísticaEls valors s'expressen com la mitjana ± error estàndard (se). Els resultats es van analitzar estadísticament mitjançant una prova U de Mann-Whitney no paramètrica (P <0.05). la="" prova="" de="" kruskal-wallis="" es="" va="" utilitzar="" per="" comparar="" tres="" o="" més="" poblacions,="" i="" es="" van="" realitzar="" comparacions="" múltiples="" mitjançant="" el="" mètode="" de="" scheffe="" un="" cop="" observades="" diferències="" significatives="" (p="">< 0.05).="" la="" correlació="" entre="" els="" dos="" paràmetres="" es="" va="" analitzar="" mitjançant="" la="" prova="" del="" coeficient="" de="" correlació="" de="" rang="" de="" spearman="" (p=""><0,>

RESULTATS

TIL i GL als ronyons obstruïts de ratolins jovesPrimer vam examinar TIL i GL en ronyons simulats i UUO de ratolins joves sotmesos a obstrucció durant diferents períodes de temps. Mentre que els ronyons operats per simulació mostraven un tubulointerstici normal (figura 1A), els ronyons obstruïts després de 2 dies d'UUO mostraven TIL i es caracteritzaven per la dilatació dels túbuls; alguns túbuls també contenien guisos urinaris. Aquestes lesions van augmentar amb l'avanç de l'obstrucció (figura 1A). Els GL, principalment glomerulosclerosi, es van observar en l'etapa tardana als 21 dies després de l'UUO i es van caracteritzar per la deposició de materials positius per àcids periòdics de Schiff (PAS). L'estructura glomerular era normal tant als ronyons simulats com als primers UUO (2, 7 i 11 dies) (figura 1B). El nombre de cèl·lules glomerulars va tendir a augmentar fins al dia-11 després de l'obstrucció i va tendir a disminuir el dia-21 als ronyons UUO (figura 1C). L'acumulació mesangial glomerular va tenir tendència a augmentar a partir dels 7 dies posteriors a l'obstrucció (figura 1D).

estava absent al centre dels glomèruls dels ronyons UUO als 21 dies després de l'obstrucció (figura 1F). La reacció en cadena de la polimerasa va revelar una disminució significativa dels PFM (Nphs1 i Synpo) als ronyons UUO 21 dies després de l'obstrucció (figura 1G). A més, l'anàlisi SEM va revelar processos normals del peu de podòcits (PFP) en ronyons operats per simulació; tanmateix, es van informar d'esborrament de PFP i estructures semblants a microvellositats als ronyons UUO 21 dies després de l'obstrucció (figura 1H). En conjunt, aquests resultats suggereixen l'aparició de lesions de podòcits al ronyó obstruït 21 dies després de l'obstrucció.

Les cèl·lules immunitàries infifiltrants estan absents al ronyó obstruït Hem demostrat anteriorment que la lesió dels podòcits es correlaciona amb les cèl·lules immunitàries infifiltrades al glomèrul (13, 16, 18). Per tant, vam examinar la infifiltració de cèl·lules B i T, així com macròfags en TIL i GL de ronyons simulats i UUO (figura 2). Es van observar nombroses cèl·lules B, T i macròfags infifiltrants als TIL dels ronyons UUO tots els dies posteriors a l'obstrucció, però eren gairebé absents o pocs als glomèruls dels ronyons simulats i UUO (figures 2A-E). El nombre de cèl·lules B, T i macròfags era molt poc al glomèrul (dades no mostrades), però significativament més alt en el glomèrul.

tubulointerstici dels ronyons 2-, 7-, 11- i 21-dia en comparació amb el del ronyó simulat (figura 2F). Per tant, la infiltració de cèl·lules immunitàries pot contribuir al desenvolupament de TIL al ronyó obstruït. Tanmateix, altres factors poden estar relacionats amb el desenvolupament de GL.

Expressió de diferents membres de la família TLR i citocines aigües avall en ronyons simulats i obstruïts de ratolins joves Estudis anteriors han revelat una expressió més alta de diferents TLR en podòcits de ronyons malalts (15, 16, 19, 20). Curiosament, les nostres dades van revelar una expressió significativament més alta de Tlr8 i Tlr9 als glomèruls aïllats del grup de dies UUO 21- que als glomèruls del grup simulat (figura 3A). A més, vam examinar l'expressió de citocines aigües avall dels membres de la família TLR als glomèruls dels grups de dies simulats i UUO 21- i vam trobar una regulació a l'alça significativa en l'expressió dels gens que codifiquen tant la interleucina 1 beta (Il1b) com la interleucina 6. (Il6) al grup UUO en comparació amb el grup simulat (figura 3B).

TLR8 co-localitzat amb PFM Com que l'expressió de Tlr8 i Tlr9 era alta en els glomèruls aïllats del ronyó obstruït, vam examinar la seva localització mitjançant una tinció d'immunofluorescència. La proteïna TLR8 no es va detectar als ronyons operats per simulació (figura 4A), però es va colocalitzar amb la sinaptopodina PFM al ronyó UUO (figura 4B). A més, no vam poder detectar l'expressió de la proteïna TLR9 al ronyó de ratolins operats per simulació o UUO (dades no mostrades).

Producció d'IL1b a partir de podòcits al ronyó obstruït de ratolins joves Com es mostra a la figura 3B, l'expressió d'Il1b glomerular (una citocina aigües avall de la família TLR) va ser significativament més alta al ronyó UUO als 21 dies que la del ronyó simulat. Per tant, vam examinar la font d'IL1b als glomèruls dels ronyons UUO mitjançant una tinció d'immunofluorescència. L'expressió de proteïna IL1b no es va detectar als glomèruls dels ronyons simulats, però es va observar als glomèruls dels ronyons UUO (figures 4C, D). A més, IL1b es va colocalitzar amb la podocina PFM (figura 4D).

a l'UUOronyóals 21 dies que a la farsaronyó.Per tant, vam examinar la font d'IL1b als glomèruls dels ronyons UUO mitjançant una tinció d'immunofluorescència. L'expressió de proteïna IL1b no es va detectar als glomèruls de la farsaronyonsperò es va observar als glomèruls de l'UUOronyons(Figures 4C, D). A més, IL1b es va colocalitzar amb la podocina PFM (figura 4D).

Augment del nivell del lligand Tlr8 endògen putatiu en ratolins model ON Un estudi anterior va demostrar que miR-21 serveix com a lligand per a TLR8 (21). Per tant, vam comparar els nivells glomerulars i sèrics de miR-21 entre els grups de dies simulats i UUO 21-. Curiosament, el grup UUO 21-dia va mostrar nivells significativament més alts de miR glomerular-21 que el grup simulat (P <0.05), però,="" una="" tendència="" creixent="" de="" mir-21="" sèric.="" es="" va="" observar="" {10}}="" al="" primer="" grup="" que="" al="" segon="" (p="0.06)" (figura="">

Correlació de l'expressió Tlr8 amb el seu lligand miR-21 i PFM a l'obstruïtRonyóTal com es mostra a la taula 3, vam observar una correlació positiva significativa entre l'expressió glomerular de l'ARNm de Tlr8 i el seu lligand endogen (miR-21), així com les citocines Il1b i Il6 aigües avall. D'altra banda, es va evidenciar una correlació negativa entre l'ARNm de Tlr8 i els PFM Nphs1 i Synpo.

L'estimulació in vitro dels glomèruls amb miR{{0}} La mímica activa l'expressió de Tlr8 i les seves citocines aigües avall L'expressió de Tlr8 es va tendir a augmentar (P=0.06) però les seves citocines aigües avall (Ifng i Il1b) van augmentar significativament (P <0, 05 i 0, 01) en els glomèruls de ratolins simulats després de

tractament amb miR-21 en comparació amb el dels glomèruls de ratolins tractats amb PBS i mimic de control negatiu (figura 5A). Tanmateix, no es va observar cap correlació significativa entre l'expressió de Tlr8 i les seves citocines aigües avall als glomèruls de ratolins simulats després del tractament amb mimics (taula 4). L'expressió de Tlr8 i les seves citocines aigües avall va ser significativament més alta als glomèruls d'UUOronyons, després del tractament amb miR-21 que els dels glomèruls de l'UUOronyonstractat amb PBS i mimic de control negatiu (figura 5B). Es va detectar una correlació significativa entre l'expressió de Tlr8 i les seves citocines aigües avall als glomèruls dels ronyons UUO després del tractament amb mimics, indicatiu de la major activació de la via del factor nuclear kappa B (NF-kB) mediat per Tlr8- i secreció de citocines proinflamatòries al ronyó obstruït (taula 4).

Localització de TLR8 i lesió de podòcits als ronyons col·laterals de ratolins jovesEls ronyons operats per simulació mostraven un glomèrul normal, mentre que els ronyons col·laterals tenien hipertròfia glomerular, augment del nombre de cèl·lules glomerulars i dilatació dels capil·lars glomerulars (figura 6A). Els glomèruls dels ronyons operats per simulació eren positius per a l'expressió de sinaptopodina i no tenien expressió de TLR8 (figura 6B). D'altra banda, els ronyons col·laterals van perdre l'expressió de sinaptopodina al centre dels glomèruls, però van mostrar l'expressió de TLR8 al llarg de la velocitat glomerular (figura 6C). A més, la proteïna TLR8 es va co-localitzar amb la sinaptopodina (figura 6C). Els ronyons operats per simulació van mostrar una expressió normal de podocina però cap expressió d'IL1b als glomèruls (figura 6D). Tanmateix, els glomèruls del ronyó col·lateral van perdre l'expressió de podocina al centre, però tenien expressió IL1b al llarg de la taxa glomerular (figura 6E). A més, la proteïna IL1b es va colocalitzar amb podocina (figura 6E). L'anàlisi SEM va revelar PFP normals en ronyons de ratolí simulats, però l'eliminació de PFP i les estructures semblants a les microvellositats eren visibles als ronyons col·laterals (figura 6F).

Localització de TLR8 i lesió dels podòcits als ronyons obstruïts i col·laterals de ratolins envellitsEls ronyons operats per simulació van mostrar una expressió normal de sinaptopodina, però no van revelar cap tinció per a la proteïna TLR8 dins dels seus glomèruls (figura 7A). Curiosament, tant els ronyons col·laterals com els UUO van mostrar una pèrdua d'expressió de sinaptopodina al centre dels glomèruls, però van mantenir l'expressió de TLR8 al llarg de la xarxa glomerular (figures 7B, C). La proteïna TLR8 es va colocalitzar amb la sinaptopodina als ronyons col·laterals i UUO (figures 7B, C). Els ronyons operats per simulació mostraven de manera similar una expressió de podocina normal, però no tenien expressió IL1b als seus glomèruls (figura 7D). D'altra banda, tant els ronyons col·laterals com els UUO van perdre l'expressió de podocina al centre dels glomèruls, però van mostrar l'expressió IL1b al llarg de la xarxa glomerular (figures 7E, F). Es va trobar que la tinció positiva estava colocalitzada amb podocina als glomèruls dels ronyons col·laterals i UUO (figures 7E, F). L'examen SEM va revelar PFP normals en ronyons de ratolí simulats, esborrament de PFP i estructures semblants a microvellositats tant als ronyons col·laterals com UUO de ratolins vells (figura 7G).

DISCUSSIÓON

la prevalença és freqüent tant en nadons com en individus d'edat (4-7). Per tant, vam sotmetre ratolins joves i grans a UUO per imitar la condició ON d'individus de diferents grups d'edat i vam examinar TIL i GL. En el ronyó obstruït, la progressió dels TIL es va fer evident en una etapa anterior d'obstrucció (2 dies); tanmateix, la progressió dels GL juntament amb la lesió dels podòcits es va observar en una etapa posterior. El ronyó col·lateral mostrava GL i lesions de podòcits al mateix temps. Aquesta observació indica que la lesió dels podòcits es produeix tant als ronyons obstruïts com als col·laterals, tot i que l'insult inicial pot variar. Els nostres estudis anteriors han posat de manifest la correlació entre la lesió dels podòcits i la infiltració de cèl·lules immunitàries al glomèrul (13, 16, 18). Tanmateix, en el present estudi no es va observar la infiltració de cèl·lules immunitàries als glomèruls dels ronyons simulats o obstruïts. Per tant, vam considerar la implicació d'altres factors en la lesió dels podòcits al ronyó obstruït. Vam plantejar la hipòtesi que els senyals de perill (DAMPs o PAMPs), ja sigui d'origen circulatori o derivats d'un epiteli tubular danyat, poden contribuir a la lesió dels podòcits a ON, a causa de la seva ubicació única al glomèrul. És important destacar que s'ha demostrat que la interacció entre DAMP i TLR té un paper important en la patogènesi de malalties no infeccioses (15). Diferents membres de la família TLR s'expressen a la membrana plasmàtica cel·lular o a les vesícules intracel·lulars (22) i es caracteritzen com a sensors immunitaris innats que reconeixen de manera eficient els DAMP o PAMP. Després de l'activació mitjançant els DAMP o PAMP corresponents, els TLR van millorar l'expressió de citocines aigües avall a través de la via NF-kB i van induir el sistema de defensa de l'hoste (22). A més, els DAMP transmeten la presència de lesions tissulars a les cèl·lules immunitàries o a les cèl·lules intrínseques locals i, en conseqüència, agreugen el dany tissular (23–26). És important destacar que tots els TLR activen la via NF-kB que controla l'expressió d'una sèrie de gens de citocines inflamatòries (27). A més, l'activació dels TLR indica les seves vies aigües avall per activar NF-kB, responsable de la inflamació i vinculat a la patogènesi dels teixits danyats (28). Shichita et al. van revelar les interaccions patològiques entre lligands endògens i TLR2 o TLR4, que contribueixen a la lesió cerebral isquèmica (25). Estudis anteriors també han demostrat la capacitat dels membres de la família TLR per induir TIL al ronyó (TLR2, 4, 5, 7 i 11) i GL (TLR1-6, 8 i 9) (17, 29-33). ). En el present estudi, vam trobar lesions de podòcits en ronyons obstruïts i col·laterals i vam aclarir la

rols de diferents membres de la família TLR que poden contribuir a la lesió dels podòcits (15, 16, 19, 20). Tal com vam plantejar la hipòtesi, l'expressió glomerular de Tlr8 i Tlr9 era més alta en els glomèruls aïllats del ronyó UUO que en els dels ratolins operats per simulació. A més, l'expressió glomerular de citocines inflamatòries relacionades amb la via NF-kB, incloses Il1b i Il6, va ser més alta al ronyó UUO als 21 dies després de l'obstrucció. Per tant, vam concloure que la via NF-kB mediada per TLR té un paper important en la patogènesi de GL al ronyó obstructiu. A diferència d'altres membres de la família TLR, TLR8 i TLR9 es detecten als endosomes de les cèl·lules. TLR8 reconeix ARN monocatenari i ARN curt de doble cadena dels microorganismes i activa la producció de diverses citocines mediades per NF-kB (22). D'altra banda, TLR9 reconeix ADN de doble cadena i activa la via NF-kB per produir citocines aigües avall (16, 34). En aquest estudi, només vam reconèixer la colocalització de la proteïna TLR8 juntament amb la sinaptopodina PFM als glomèruls. Els nostres estudis anteriors també han demostrat que tant TLR8 com TLR9 colocalitzen amb PFM i activen la producció de citocines inflamatòries mediada per NF-kB per induir lesions dels podòcits (15, 16). A més, altres estudis han demostrat la correlació patològica entre les vies mediades per TLR i la lesió dels podòcits in vitro (34, 35). Banas et al. va revelar la interacció de TLR4 en podòcits amb el sistema immunitari durant el desenvolupament de GL (35). Així, els podòcits poden contribuir a la vigilància immune a través de vies mediades per TLR. En aquest estudi, vam mostrar tant l'expressió del gen TLR8 com la localització de proteïnes als podòcits del ronyó obstruït, així com la major expressió de les citocines aigües avall al glomèrul. Per tant, concloem que les vies mediades per TLR8-contribueixen al desenvolupament de GL a través de la lesió dels podòcits al ronyó obstruït.

Un estudi anterior va demostrar que miR-21, un lligand endogen de TLR8, pot arribar i unir-se a TLR8 en endosomes cel·lulars, on pot induir l'activació mediada per TLR8- de la via NFkB i la secreció de citocines proinflamatòries. (21). En el present estudi, vam trobar nivells significativament més alts de miR glomerular-21, així com nivells elevats de miR-21 sèric al ronyó UUO que els dels controls simulats i vam demostrar la seva correlació amb l'expressió glomerular de Tlr8. . Curiosament, els glomèruls dels ronyons UUO tractats amb miR-21 van mostrar una expressió més alta de Tlr8 i les seves citocines aigües avall en comparació amb els dels glomèruls de ratolins simulats tractats amb miR-21, cosa que indica una major disponibilitat de miR endògens. -21 dels teixits danyats al ronyó obstruït i l'activació de la sobreexpressió de Tlr8 als ronyons UUO es comparen amb la d'una simulació. Junts, concloem que un volum més elevat de miR-21 al ronyó obstruït arriba als endosomes dels podòcits i indueix l'activació mediada per Tlr8- de la via NF-kB i la secreció de citocines proinflamatòries. Aquestes citocines, al seu torn, participen en el desenvolupament de GL mitjançant lesions dels podòcits.

IL1b és una de les citocines importants aigües avall de la via NF-kB, produïda principalment pels podòcits del glomèrul en condicions de malaltia. Estudis anteriors han demostrat que IL1b indueix lesions dels podòcits reduint els PFM (36, 37). En el present estudi, vam mostrar una expressió glomerular més alta d'Il1b i la seva colocalització amb PFM, que va mostrar una expressió reduïda. A més, l'expressió glomerular d'Il1b es va correlacionar amb Tlr8 i va tendir a correlacionar-se amb l'expressió de PFM (Nphs1 i Synpo). Per tant, aquests resultats indiquen que els factors aigües avall de Tlr8, inclosos Il1b i Il6, poden causar lesions dels podòcits al ronyó obstruït reduint l'expressió de PFM.

Els ronyons col·laterals dels ratolins joves també mostraven GL i pèrdua de PFM. Aquest resultat va ser confirmat per SEM, que va revelar una lesió de podòcits al ronyó col·lateral. També hem trobat nivells més alts de sèrum miR-21 al model de ratolí ON. A més, la proteïna IL1b es va co-localitzar amb PFM. Aquests resultats indiquen que el sèrum miR-21 interacciona amb TLR8 als podòcits del ronyó col·lateral i activa la producció de citocines aigües avall, que al seu torn redueix la funció dels podòcits i la lesió dels podòcits. També es va observar la lesió de podòcits als ronyons obstruïts i col·laterals de ratolins vells mitjançant un mecanisme similar al observat en ratolins joves.

En conclusió (figura 8), l'expressió glomerular de miR-21 s'eleva després de l'obstrucció ureteral unilateral, en què interacciona amb TLR8 en podòcits i indueix la producció de citocines aigües avall (Il1b i Il6) que suggereix l'activació de la via NF-kB. Els nivells més alts de citocines redueixen els PFM, donant lloc a lesions dels podòcits i el desenvolupament posterior de GL. Els nivells elevats de sèric miR-21 activen TLR8 als podòcits del ronyó col·lateral i indueixen GL a través de la lesió dels podòcits. Per tant, aquest estudi mostra clarament el desenvolupament de GL en ronyons obstruïts i col·laterals mitjançant lesions de podòcits després de la sobreexpressió de Tlr8.