Assaig TUNEL: una eina potent per a l'avaluació de lesions renals

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resum:L'assaig d'etiquetatge terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP (TUNEL) és un assaig establert des de fa temps que s'utilitza per detectar la fragmentació de l'ADN associada a la mort cel·lular (terminals d'ADN 3'-OH) per endonucleases. Com que aquests enzims són particularment actius al ronyó, TUNEL s'utilitza àmpliament per identificar i quantificar la fragmentació de l'ADN i la mort cel·lular en cultiu.ronyó cèl·lules i ronyons animals i humans resultants de lalesió tòxica o hipòxica. La caracterització primerenca de TUNEL com a assaig apoptòtic ha donat lloc a nombroses interpretacions errònies dels mecanismes decèl·lula renal lesió.No obstant això, TUNEL és cada cop més popularlesió renalavaluació perquè es pot utilitzar universalment en cèl·lules cultivades i de teixits i per a tots els mecanismes de mort cel·lular. A més, és sensible, precís, quantitatiu, s'enllaça fàcilment amb cèl·lules particulars o compartiments de teixits, i es pot combinar amb la immunohistoquímica per permetre una identificació fiable de tipus cel·lulars o mecanismes probables de mort cel·lular. Tradicionalment, l'anàlisi TUNEL s'ha limitat a la presència o absència d'un senyal TUNEL. Tanmateix, es pot obtenir informació addicional sobre el mecanisme de la mort cel·lular a partir de l'anàlisi dels patrons TUNEL.

Tractament del trastorn renal de l'excitació sexual amb suplement de cistanche en pols

Introducció L'ADN és l'única molècula de la cèl·lula que es pot reparar, però no es pot resintetitzar completament després d'un dany. La destrucció de l'ADN és una de les etapes finals d'un procés de mort cel·lular de diversos passos, que és potencialment reversible fins al punt de fragmentació terminal de l'ADN. Per tant, aquest últim és un atribut comú i un marcador mecanicista de la mort cel·lular irreversible [1,2]. La fragmentació de l'ADN associada a la mort cel·lular s'acostuma a "visualitzar" mitjançant l'assaig d'etiquetatge terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP (TUNEL), l'escala d'ADN o l'assaig de cometes [3]. L'electroforesi de camp de pols [4] i l'assaig de síntesi aleatòria d'oligonucleòtids (ROPS) [5] són altres dos assaigs secundaris poc utilitzats. L'ús de l'assaig de cometes es limita només a in vitro (cèl·lules cultivades) i la seva quantificació requereix molta mà d'obra [6]. És possible realitzar assajos de cometes en nuclis cel·lulars aïllats, però s'associa amb factors de confusió addicionals durant l'aïllament dels nuclis. El segon, l'assaig d'escala d'ADN, no és un mètode quantitatiu, i l'esperança inicial que el patró d'escala i el frotis distingissin entre apoptosi i necrosi, respectivament, es va eliminar, ja que aquest enfocament va resultar poc fiable [7]. Dels tres mètodes principals, TUNEL és el més sensible, el que consumeix menys temps i el més universalment aplicable. Es pot utilitzar en cèl·lules i teixits cultivats i per a tots els mecanismes de mort cel·lular. És precís, quantitatiu, s'enllaça fàcilment amb cèl·lules particulars o compartiments de teixits, i es pot combinar amb la immunohistoquímica per permetre una identificació fiable dels tipus de cèl·lules o mecanismes de lesió cel·lular associats amb senyals positius de TUNEL [2].

Les ruptures d'ADN mesurables per TUNEL són produïdes principalment per endonucleases apoptòtiques. Les endonucleases més actives al ronyó són la desoxiribonucleasa 1 (DNasa I) i l'endonucleasa G (EndoG) [8–10]. La DNasa I és l'endonucleasa apoptòtica més activa i abundant en mamífers [11]. El ronyó, les glàndules salivals, el pàncrees i l'intestí són òrgans coneguts per produir grans quantitats de DNasa I. Les cèl·lules epitelials de les glàndules salivals, el pàncrees i l'intestí segreguen DNasa I com a enzim digestiu al tracte digestiu. Alguna DNasa cel·lular I lluita contra l'ADN "estranger" que invaeix les cèl·lules hostes [12]. La DNasa I no secretada presenta un perill ocult per a l'ADN de la cèl·lula hoste, però normalment les DNases no actuen sobre l'ADN de la cèl·lula hoste fins a la lesió o la mort de la cèl·lula. Al ronyó, la DNasa I és secretada per cèl·lules epitelials tubulars, presumiblement per destruir virus i bacteris a l'orina. Aquesta funció probablement es produeix juntament amb les proteïnases, en particular, la meprina, que és la proteïna principal de l'orina [13]. Tot i que és protector contra la infecció, la presència d'una DNasa altament activa al ronyó fa que aquest òrgan sigui vulnerable a lesions, on se sap que l'activitat de la DNasa és citotòxica per a les cèl·lules hostes. Les DNases promouen la mort cel·lular induïda per estímuls tòxics o hipòxics i destrueixen totes les cèl·lules d'ADN del ronyó hoste alliberades com a resultat de la mort cel·lular.

RonyonsSón òrgans filtrants que eliminen els compostos tòxics del cos. L'alta activitat de la DNasa I als ronyons fa que les cèl·lules renals siguin molt sensibles a les lesions de compostos tòxics i els seus productes metabòlics. Això fa que TUNEL sigui el mètode més adequat i aplicable per mesurar lesions al ronyó. En aquesta revisió, ens centrarem en TUNEL com a assaig àmpliament utilitzat, informatiu i precís per a la mesura de la mort cel·lular i les lesions dels teixits al ronyó. Discutirem aspectes de TUNEL tal com s'aplica a les malalties i lesions renals i identificarem qualitats, tècniques i característiques infrautilitzades de TUNEL per promoure l'ús productiu i adequat d'aquest potent assaig en la investigació, el diagnòstic i la teràpia de les malalties renals. També parlarem de diversos patrons d'imatge TUNEL que es poden relacionar amb mecanismes de mort cel·lular. Els punts plantejats en aquesta revisió són àmpliament aplicables a l'ús de TUNEL en òrgans diferents del ronyó.

Paraules clau:TUNEL; mort cel·lular; ronyó; ADNases; endonucleases; lesió dels teixits

Principis de TUNELL'assaig TUNEL va ser desenvolupat l'any 1992 per Gorczyca et al. [14] i Gavrieli et al. [15], utilitzant l'etiquetatge amb fluorocrom i avidina-peroxidasa, respectivament. En aquell moment, hi havia una necessitat desesperada de nous mètodes per avaluar l'apoptosi, i TUNEL va omplir aquest buit amb èxit. Inicialment comercialitzat com a assaig de trencaments de cadena d'ADN durant o associat a l'apoptosi [14, 16], en absència de millors assajos, TUNEL es va convertir ràpidament en l'assaig estàndard per a l'apoptosi [17, 18]. Tanmateix, els investigadors van reconèixer gairebé immediatament que TUNEL mesurava indiscriminadament qualsevol fragmentació de l'ADN, no només la associada a l'apoptosi [19-21]. No obstant això, la necessitat d'assajos apoptòtics era tan gran que els rars informes de TUNEL no específics per a l'apoptosi generalment es van ignorar. Això va provocar una gran quantitat d'informes falsos positius d'apoptosi al ronyó i altres òrgans, fins al punt que fins al 20 per cent del total de cèl·lules es va informar apoptòtiques fins i tot sense lesions [22–25] quan els canvis com a petit com el 0,01 per cent podria ser una evidència estadísticament significativa de lesió tissular.

L'assaig TUNEL ha experimentat un renaixement en els últims anys des del final del boom dels estudis d'apoptosi fa uns anys. La nostra cerca PubMed d'articles de revistes amb termes "ronyó" i "TUNEL" va produir més de 1.500 resultats entre 1992 i 2020. El 2019, es van publicar 170 articles, el nombre més alt en un sol any dels darrers 28 anys (figura S1) i que constitueixen la majoria dels articles enquestats per a aquesta revisió. Nombrosos estudis van utilitzar la positivitat de TUNEL com a mesura universal de la mort cel·lular associada a la fragmentació de l'ADN en altres tipus de mort cel·lular a part de l'apoptosi. Per exemple, TUNEL pot detectar la ferroptosi, una forma recentment descoberta de mort cel·lular programada i no apoptòtica provocada pel dany oxidatiu que es produeix durant la isquèmia-reperfusió renal (IR) en ratolins [26]. La piroptosi, que és una forma inflamatòria de mort cel·lular programada que és diferent de l'apoptosi i la necrosi, està associada amb senyals positius de TUNEL [27, 28]. Es va observar la positivitat de TUNEL durant la necroptosi que va contribuir a l'esgotament progressiu de les cèl·lules del túbul renal en rates sotmeses a nefrectomia subtotal [29]. Al ronyó i altres teixits, s'han trobat senyals TUNEL positius en necrosi [30,31], autofàgia desregulada [32–35], anoikis [36,37], catàstrofe mitòtica [35,38], autòlisi [39], pautòlisis. [39], proptosi [40] i aponeurosi [30], demostrant que TUNEL és un assaig realment universal per a la mort cel·lular irreversible.

L'assaig TUNEL es basa en l'etiquetatge dels extrems 3'OH per un enzim d'ADN específic de l'extrem 3'OH, desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (figura). L'ús d'ADN polimerasa o ADN polimerasa del fragment de Klenow en lloc de TdT pot ajudar a determinar el tipus d'extrems 3'OH (talles, buits o oligos sobresortint) perquè les ADN polimerases necessiten una plantilla (la cadena d'ADN oposada) i per tant no s'etiquetaran. extrems d'ADN penjants o que sobresurten. És important recordar que la producció d'extrems d'ADN 3ZOH no és exclusiva de les endonucleases apoptòtiques (degradant l'ADN). Els extrems de l'ADN 3'OH són un senyal "comunicador" important, un denominador comú de la majoria dels enzims d'ADN. Són produïts i utilitzats per gairebé tots els enzims d'ADN dels eucariotes, incloses les endonucleases de reparació de l'ADN (apurínic/apirimidínic, AP), les exonucleases, les ADN polimerases, les ADN lligases, les ADN transferases i les topoisomerases. A més, els conjugats 3'Id 3z-sucre o 3z-proteïna es poden convertir en 3'OH terminals mitjançant fosfatases, glicosilasas i proteïnases, respectivament. Per això és necessària una comprensió precisa del que s'està mesurant per a l'aplicació exitosa de TUNEL i la interpretació dels seus resultats.

En comparació amb altres dos mètodes primaris de mesura de la fragmentació de l'ADN, l'escala d'ADN i l'assaig de cometes, TUNEL té l'avantatge de basar-se en la identificació dels extrems de l'ADN en lloc de fragments (figura 2). Teòricament, TUNEL hauria de ser més sensible i lineal per a la identificació de la fragmentació inicial (baixa) de l'ADN que l'escala d'ADN o el cometa, ambdós tenen un període de retard d'acumulació de petits fragments d'alta mobilitat. En qualsevol cas, els estudis que combinen TUNEL amb el cometa )41,42] o l'escala d'ADN [43,44] tenen algun avantatge de detectar la fragmentació primerenca de l'ADN amb la màxima sensibilitat.

Aplicacions TUNELTUNEL s'utilitza per identificar i quantificar la lesió renal en estudis clínics i toxicológicos bàsics en una àmplia gamma d'aplicacions, incloent tractaments mèdics [45], exposicions ambientals [46], agrícoles [41] i industrials [47] i animals [48] ] i ciències dels aliments [49]. TUNEL és aplicable a tots els tipus de cèl·lules, òrgans i espècies que tenen ADN i DNases, que inclou gairebé totes les espècies. TUNEL s'ha utilitzat per identificar i quantificar la lesió renal en una àmplia gamma d'animals, com ara peix zebra [50], peix arròs japonès [51], pollastres [48], gerbills [52], ratolins [41], rates [45], rabb its [53], mini-porcs [54] i humans [55]. Un avantatge important de TUNEL és que es pot utilitzar en cèl·lules en cultiu fixes així com en teixits fixos. Això proporciona consistència metodològica per a la comparació entre els resultats in vitro i in vivo en estudis en què es poden investigar mecanismes en cèl·lules renals cultivades, mentre que les implicacions in vivo s'avaluen en els ronyons animals. També es pot utilitzar qualsevol cosa entre cèl·lules i teixits sencers, inclosos els esferoides cel·lulars cultivats [56] i les rodanxes de ronyó ex vivo [57,58].

La intensitat de TUNEL pel que fa a la força del senyal o el nombre de cèl·lules positives a TUNEL pot variar entre espècies en funció de l'activitat de les DNases. Segons la nostra experiència, el ronyó de rata té DNasa I més activa que el ronyó de ratolí, i la força del senyal positiva de TUNEL es correlaciona amb això. Quan es compara el ronyó amb altres òrgans, el seu senyal positiu TUNEL és molt intens i semblant a altres òrgans amb alta activitat de DNasa I, com l'intestí i la glàndula salival. A l'altre extrem de l'espectre, s'observa la força del senyal positiva més baixa de TUNEL al cervell i a les cèl·lules tumorals/cànceroses, on l'expressió de la DNasa I és probable que s'inactiva mitjançant un empalmament alternatiu a la regió de codificació [59]. El senyal positiu de TUNEL s'observa en tots els tipus de cèl·lules del ronyó. De mitjana, l'epiteli tubular està danyat més sovint que els glomèruls, especialment en lesions agudes (figura 3A). Això es correlaciona bé amb l'activitat de la DNasa I que predomina en aquests tipus de cèl·lules. A jutjar per les diferències de sexe i edat observades als nostres experiments, la DNasa I és més abundant i activa en els mascles que les femelles i els animals de mitjana edat en comparació amb els animals d'edat avançada o nounat. No obstant això, no hi ha cap diferència clara en la positivitat de TUNEL en relació amb el sexe o l'edat, probablement perquè el destacat o predominen altres factors. En alguns models renals (com ara isquèmia-reperfusió), s'indueix la DNasa I [9]; mentre que en altres, no està i fins i tot es pot suprimir (per exemple, en la toxicitat per cisplatí) [10]. S'ha demostrat que l'activació de les endonucleases, si està present, es produeix durant les cinc primeres 24 hores després de la lesió renal [9,60,61]. Per tant, no va ser d'estranyar que almenys la meitat de les aplicacions de TUNEL en la investigació renal d'aquesta revisió s'utilitzessin per a la lesió renal aguda (IRA), ja que l'avaluació de la LRA es fa sovint entre 24 i 72 hores després de la lesió quan les endonucleases són més actives. . La llista d'estudis d'AKI és llarga i inclou lesions tòxiques, sèptiques, de trasplantament i hipòxiques. En aquest treball, vam estudiar els models, els tipus d'exposició, els tractaments, els terminis d'avaluació i els tipus de cèl·lules afectats en aquests estudis. Els estudis que es van enquestar van incloure modes aguts i mixtos de lesió renal i malaltia renal crònica.

Si s'observa una lesió renal amb un senyal positiu de TUNEL als túbuls o al glomèrul depèn del tipus d'agent o malaltia danyosa. Per exemple, la nefritis lúpica en humans i el dany de les nanopartícules de níquel es va descriure com a senyals positius de TUNEL estrictament glomerulars [62, 63]. D'altra banda, la isquèmia-reperfusió i la nefropatia diabètica induïda per estreptozotocina en rates van produir cèl·lules positives per a TUNEL només als túbuls [64, 65]. Els túbuls proximals, el bucle de Henle, els túbuls distals i els conductes col·lectius solen ser TUNEL positius en models d'isquèmia-reperfusió. Les cèl·lules positives de TUNEL tant als glomèruls com als túbuls es van descriure en rates exposades a fàrmacs com la ciclosporina A [66] i la doxorubicina [67] o materials de productes de consum com les nanopartícules d'òxid de zinc [68] i en un model de rata de diabetis mellitus [68]. 69]. L'AKI induïda per xoc sèptic en humans també es va associar amb cèl·lules TUNEL positives tant glomerulars com tubulars [70]. L'obstrucció de l'intestí prim estrangulada va provocar la positivitat de TUNEL al ronyó en 3 h [87].

L'IRA pot ocórrer després del trasplantament i lesions hipòxiques. El rebuig d'al·lograft en humans s'associa habitualment amb l'elevació de cèl·lules positives per a TUNEL [88,89]. Després de la isquèmia freda, les cèl·lules positives per a TUNEL s'observaven normalment entre 2 i 24 hores durant la reperfusió [90], o més estretament, entre 14 i 17 hores després de la isquèmia [91], i de vegades encara se'ns observa fins a 7 dies en rebuig del trasplantament [92]. De la mateixa manera, en els models d'isquèmia-reperfusió, les cèl·lules positives amb TUNEL es van observar amb més freqüència 24 hores després de la reperfusió [44,93,94], o dins del rang entre 4 [95,96] i 72 hores [97]. Tant en estudis de trasplantament com d'AKI isquèmic, les cèl·lules positives de TUNEL es van localitzar a cèl·lules epitelials tubulars distals i proximals [44,93]. En ratolíronyonsdesprés de la lesió per isquèmia-reperfusió, les cèl·lules positives de TUNEL es van descriure concentrades a la unió corticomedular, l'objectiu habitual de la lesió isquèmica [98].

Les lesions agudes i cròniques mixtes, on en el mateix estudi es van observar exposicions tòxiques, estats de malaltia i/o avaluacions tant agudes (és a dir, hores, dies) com cròniques (és a dir, setmanes, mesos, anys) en un trasplantament humà. rebuig (biòpsia 1 setmana a 3 anys després del trasplantament) [88], infecció pel virus de l'hepatitis E porcina (7 i 14 dies després de la inoculació) [52], estrès induït pel pneumoperitoneu de CO2 en hidronefròticsronyons(2 setmanes hidronefrosi, 2 dies després del pneumoperitoneu) [53], glomerulonefritis proliferativa mesangial induïda pel verí de serp (d'1 a 14 dies després de la injecció) [99], obstrucció ureteral unilateral (d'1 a 14 dies d'obstrucció) [100], Exposició a l'acetat d'uranil (d'1 a 28 dies d'exposició) [101], nefropatia d'àcid aristocòlic (exposició diària de 5 i 30-dies) [102] i hiperòxia neonatal (provada d'1 a 60 dies postnatals, exposada a hiperòxia primers 14 anys). dies) [103]. Catorze dies després de l'impacte és un moment d'avaluació molt comú per a aquest tipus d'impactelesions renals[52,53,99,101,103]. En la majoria dels casos, les cèl·lules positives de TUNEL es van localitzar en túbuls i conductes col·lectius. L'única excepció va ser la toxicitat del verí de serps, que va danyar principalment els glomèruls [99].

Crònicaronyómalaltia (ERC), definida com la presència deronyódany o disminució de la taxa de filtració glomerular (GFR) en humans durant més de 3 mesos, també és un tema comú per a l'avaluació de TUNEL, que pot determinar si la CKD s'associa ambdany renal.La ERC més estudiada en la qual s'aplica TUNEL és la nefropatia diabètica. La lesió identificada per la positivitat de TUNEL es va produir en túbuls i podòcits [69] en pacients diabètics amb inici de diabetis abans de la prova TUNEL entre 7 i 30 anys [104,105] i de 2 a 16 setmanes després del tractament amb estreptozotocina en rosegadors [106,107]. Es va informar d'histopatologia similar a TUNEL positiva en la nefropatia per immunoglobulina A [22]. En la nefritis lúpica i la glomerulonefritis membranoproliferativa, la positivitat de TUNEL es va observar principalment als glomèruls [62,108,109]. D'altra banda, els estudis de seguretat dels fàrmacs de cisplatí [110], cloroquina [45], doxorubicina [67], finasterida [23], tacrolimus [111] i levetiracetam [24] van observar principalment danys tubulars. De la mateixa manera, la lesió aguda continuada identificada per cèl·lules tubulars positives amb TUNEL es va descriure en estudis de nefropatia àcid úric [112], deficiència de metionina [48], exposició a toxines ambientals microcistina-LR [50] i cadmi [113], i en associació induïda amb oxalat de calcironyópedres [114] i nanopartícules calcificants [115]. Tot i que la identificació del dany renal progressiu durant la CKD mitjançant l'assaig TUNEL és una eina de diagnòstic útil, combinar l'assaig TUNEL amb la immunohistoquímica (IHC) potser seria encara més informatiu per determinar el mecanisme de la lesió.

Tècniques de quantificació i colocalització TUNEL

Els mètodes de quantificació de TUNEL varien. A la majoria dels informes, les cèl·lules/nuclis positius per a TUNEL es quantifiquen com el percentatge de cèl·lules/nuclis totals [83,116,117]. Això sembla el correcte, encara que el nombre de cèl·lules positives de TUNEL probablement no es correspongui exactament amb el nombre de cèl·lules mortes. És possible que algunes cèl·lules no hagin assolit nivells identificables de fragmentació de l'ADN, mentre que altres ja podrien haver estat eliminades pels macròfags. També s'utilitza la quantificació del nombre de cèl·lules positives TUNEL per unitat quadrada (mm2) [118], però aquest mètode sembla menys precís perquè depèn de la ubicació i el contingut del tipus de cèl·lula de les àrees. Les seccions corticals contenen principalment glomèruls, túbuls, vasos sanguinis i raigs medul·lars, mentre que les seccions medul·lars contenen principalment bucles de Henle, conductes col·lectors i vasos sanguinis. La quantificació "per Fifield" depèn sens dubte de quin és el camp [72,119], i la quantificació "per secció" és, encara més, indefinida [61,120]. Sembla que mesures mal identificades, com ara "puntuació histològica" [121], "índex apoptòtic" [113], "taxa d'apoptosi" [92], "percentatge d'apoptosi" [122] o percentatge de control no tractat [123,124] ser encara menys apropiat i dificultar la interpretació i no comparar-se amb la majoria dels estudis.

La mort cel·lular a les cèl·lules veïnes comença de manera desigual perquè depèn de la vascularització, el cicle cel·lular i altres variables. Això sovint provoca una tinció desigual de TUNEL de les cèl·lules del teixit [45,96,125]. Sorprenentment, la intensitat general del senyal positiu de TUNEL no s'utilitza per a la mesura de TUNEL, tot i que depèn directament del grau de fragmentació de l'ADN. Això és potser perquè les cèl·lules es consideren mortes independentment de la intensitat del senyal TUNEL, ja que una cèl·lula no pot estar "més morta" si la tinció de TUNEL és més intensa. Tot i que és difícil comparar estudis que utilitzen una gran varietat de mètodes per quantificar els resultats de TUNEL, la quantitat de cèl·lules positives per a TUNEL en animals de control sol ser inferior al 2 per cent [75,99,100,116,126]. Una lesió aguda s'associa amb un augment de ~ 5-40 × en la positivitat de TUNEL [79,126,127]. Durant la lesió crònica, l'augment de les cèl·lules positives per a TUNEL és lleugerament inferior, ~ 2–20- vegades, [29,43,65] en comparació amb els controls no tractats.

L'assaig inicial TUNEL basat en la tinció de diaminobenzidina (DAB) es va dissenyar per a la microscòpia de llum [14, 15]. Aquest mètode tradicional encara es va utilitzar en dos terços dels estudis enquestats en aquesta revisió i en la gran majoria dels estudis de biòpsia humana. La quantificació es fa mitjançant el recompte manual de cèl·lules i, tot i que és precisa, requereix molt de temps. Sovint, la quantificació no s'utilitza en absolut, i els resultats es presenten mitjançant imatges de mostres tractades i tacades com a simple evidència que va tenir lloc la mort cel·lular. L'automatització pot accelerar el procés de quantificació [128,129]. Tanmateix, DAB no es pot combinar amb cap altra tinció a la mateixa mostra i, per tant, TUNEL basat en DAB només pot proporcionar el nombre de cèl·lules mortes, sense cap identificació del tipus cel·lular (excepte el reconeixement visual) o el mecanisme de mort cel·lular.

Tot i que els estudis humans es basen majoritàriament en TUNEL basat en DAB mitjançant microscòpia de llum, aproximadament la meitat dels estudis amb animals utilitzen microscòpia fluorescent FL (figura 3). TUNEL fluorescent és visualment atractiu, fàcilment interpretable i té diversos avantatges importants. A més de la quantificació precisa mitjançant la identificació de nuclis positius per a TUNEL o la intensitat mitjana del color, el senyal fluorescent de FL TUNEL es pot colocalitzar amb altres colors per a la histoquímica (per exemple, DAPI) (Figura 3A) o IHC (Figura 3B). En aquest últim, l'ús de marcadors proteics pot ajudar a identificar senyals positius de TUNEL associats a diferentsronyócompartiments o donar informació sobre el tipus de mort cel·lular. No hem pogut trobar cap exemple de TUNEL combinat amb una tinció doble d'anticossos IHC. Tot i que aquesta combinació seria molt informativa, per exemple, per a la identificació d'un mecanisme de mort cel·lular en determinats tipus de cèl·lules, les dificultats tècniques associades a aquesta tinció poden superar els beneficis.

Identificació deronyóEl tipus de cèl·lula sens dubte no és un problema per a un experimentatronyópatòleg [104]. Per això, l'ús de marcadors addicionals per a la identificació de tipus cel·lular, per exemple, utilitzant CD31 per a la identificació de cèl·lules endotelials [130], és poc freqüent. Tanmateix, sovint s'utilitza l'ús de marcadors de proteïnes IHC per a la caracterització de lesions tissulars. La majoria dels estudis utilitzen la positivitat de TUNEL com a única evidència d'apoptosi. En altres estudis, el reconeixement que la positivitat de TUNEL no és específica per a l'apoptosi ha provocat que molts marcadors morfològics (per exemple, hematoxilina i eosina o tinció periòdica d'àcid Schiff), bioquímics i IHC es combinen amb la tinció de TUNEL per confirmar l'apoptosi. El marcador més utilitzat per a l'apoptosi dependent de la caspasa és la caspasa escindida (activa)-3 mitjançant l'ús d'un anticòs que no reconeix la caspasa de mida completa-3 [131,132]. Tant els assaigs de TUNEL com de caspasa escindida-3 van mostrar una tinció exclusivament tubular, no glomerular, a la isquèmia-reperfusió de rata [64]. Altres estudis sobre caspases van utilitzar caspasa-1 [27], -9 [53], -11 [28] i -12 [75]. Altres marcadors apoptòtics inclouen la família de proteïnes del limfoma 2 de cèl·lules B (Bcl2) Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] i Bad. [43]; el receptor apoptòtic Fas [52] i el receptor-ligand apoptòtic FasL [66]; factors de transcripció de proteïnes de forkhead box (FOX) Fox01 [133] i Fox03 [27]; i el citocrom c [53]. La inflamació es va identificar per IHC del factor de necrosi tumoral-alfa (TNF) [134]; factors de creixement tumoral TGF [66] i TGF- 1 [135]; serina/treonina quinasa 1 (SGK1) [135]; flavoproteïna de transferència d'electrons, subunitat beta (ETF) [136]; Janus quinasa-2 (JAK2) [137]; transductor de senyal i activador de la transcripció 3 (STAT3) [137]; potenciador de la cadena lleugera kappa del factor nuclear de cèl·lules B activades (NF-κB) [137] i la seva proteïna inhibidora IκB [137]. Perronyóavaluació de lesions, molècula de lesió renal-1 (KIM-1) [24], canal d'aquaporina-1 (AQP-1) [45], factor induïble per la hipòxia {{7} }factor de transcripció alfa (HIF-1) ​​[103], transportador d'aminoàcids de tipus Asc-1 (Asc{-1) [121], mamífer objectiu de rapamicina (mTOR) [131] quinasa i es van utilitzar transglutaminasa II [89]. La lesió renal oxidativa es va estudiar mitjançant marcadors com 8-hidroxiguanosina (8OHdG) [102], lipocalina associada a la gelatinasa de neutròfils (NGAL) [102], sirtuïna deacetilasa dependent de NAD-1 (SIRT1) [138] , i hemoxigenasa 1 (HO-1) [90]. Les cinases es van estudiar intensivament, inclosa la via c-Jun N-terminal de la cinasa (JNK) [101], la fosfoinosítid 3-quinasa/proteïna cinasa B/factor nuclear 2-factor de transcripció relacionat amb el factor 2 (PI3K/ Via Akt/Nrf2) [46], pannexina -1 (PANX1) proteïna de la unió de la membrana plasmàtica [26] i proteïna cinasa activada per mitogen/cinasa regulada per senyal extracel·lular (MAPK/ERK) [26]. Els estudis d'endonucleases apoptòtiques van implicar DNasa activada per caspasa (CAD) [139], DNasa I [108] i EndoG [139], i els marcadors de dany a l'ADN van incloure la proteïna tumoral p53 (p53) [99] i la proteïna 1 relacionada amb la dinamina (PARP1). ) [66]. Alguns estudis també van trobar útil l'avaluació de l'apoptosi mediada per l'estrès del reticle endoplasmàtic i les lesions dels teixits [75].

Tenint en compte un gran nombre d'estudis mecanicistes enquestats i l'avantatge de combinar TUNEL amb marcadors IHC per a la identificació de mecanismes de mort cel·lular, s'esperaria que molts estudis utilitzin la colocalització entre els dos. L'anàlisi es pot realitzar mitjançant una colocalització píxel a píxel entre les cèl·lules positives de TUNEL i els marcadors IHC, la intensitat mitjana del marcador IHC a les zones positives de TUNEL o el senyal positiu de TUNEL significa la intensitat a les zones positives del marcador IHC. Malauradament, aquest avantatge de TUNEL s'ha utilitzat només en pocs estudis. Les cèl·lules positives de TUNEL es van colocalitzar amb caspasa escindida -3ronyótúbuls durant la toxicitat per acetaminofè a rates [74]. La colocalització IHC amb senyal positiu de TUNEL va permetre la identificació de la mort cel·lular de cèl·lules mesangials durant la nefritis Habu [99]. En microscòpia de llum, la colocalització amb marcadors mecanicistes de toxicitat es va fer en seccions en sèrie, tal com va informar Ott et al. [89].

Problemes i limitacions de TUNEL

Es poden produir diversos problemes potencials i s'han d'esperar quan es treballa amb TUNEL. Un és que els extrems de l'ADN 30OH es produeixen no només durant la mort cel·lular com a resultat de l'acció de l'endonucleasa, sinó també com a metabòlit intermedi normal en gairebé totes les reaccions enzimàtiques amb l'ADN. Una funció cel·lular primària que produeix terminals 30OH és la síntesi d'ADN, en la qual nombrosos fragments d'Okazaki poden produir teòricament un senyal TUNEL fals positiu, especialment en modificacions altament sensibles de l'assaig. Durantlesió renal,La reparació de l'ADN també pot contribuir a falsos senyals positius de TUNEL com a resultat d'una acció de l'endonucleasa AP. La lesió renal oxidativa massiva induïda per una lesió química (peròxid d'hidrogen, bleomicina) o física (irradiació gamma) pot augmentar el nombre d'extrems 30OH, augmentant les lectures TUNEL falses positives a part de la fragmentació de l'ADN mediada per endonucleases.

Amb més freqüència i més probabilitat, les condicions experimentals establertes incorrectament de la reacció TdT (temps, temperatura, activitat enzimàtica o cofactors) poden donar lloc a un fons de senyal positiu TUNEL elevat artificialment. Tot i que encara no es defineix quina es considera la línia de base normal per a mostres de teixit renal no tractades, sembla plausible que al voltant de l'1 per cent del total de cèl·lules sigui un nombre raonable. Sens dubte, un fons d'un 10 per cent o més és una evidència clara de condicions d'assaig no caracteritzades i sense refinar o una desviació de les condicions adequades d'emmagatzematge de la mostra.

Un altre problema que cal esperar és la baixa activitat de la DNasa I en alguns tipus de cèl·lules (per exemple, l'endoteli),ronyócompartiments (per exemple, glomèruls) o teixits patològics (per exemple, tumors). S'ha d'esperar que aquestes cèl·lules mostrin una positivitat baixa de TUNEL, no perquè siguin resistents a lesions, sinó perquè no hi ha prou activitat endonucleasa per produir un senyal mesurable a TUNEL. Segons la nostra experiència, fins i tot els canvis entre el {{0}},01% i el 0,1% de les cèl·lules positives de TUNEL poden ser estadísticament significatius i utilitzar-los com a proves sòlides de lesió renal (d'un altre teixit).

Finalment, sorgeix un problema amb la quantificació de la tinció de TUNEL quan la quantitat de fragmentació de l'ADN és massa alta, per exemple, en les etapes últimes de la mort cel·lular o en lesions d'alta intensitat, on l'ADN restant no es pot contrarestar adequadament amb DAPI a causa del desmuntatge del doble hèlix (figura 3D). En aquests casos, els senyals positius de TUNEL estan "penjats a l'aire" i aparentment no estan associats amb un nucli. És responsabilitat d'un patòleg interpretar-les com a cèl·lules positives de TUNEL en lloc d'un artefacte. Amb TUNEL marcat amb fluoresceïna, hi ha el perill d'identificar l'autofluorescència de fons al teixit com a positivitat de TUNEL [140]. En aquests casos, es recomana canviar a l'espectre vermell TUNEL [51,54].

Patrons TUNEL com a font d'informació addicional

Es poden distingir i utilitzar clarament diversos patrons de TUNEL per determinar un mecanisme potencial i el grau de lesió (taula 1, figura 3). Normalment, un tipus de patró TUNEL de només nuclis es produeix per una lesió lleu, mentre que una lesió més forta (és a dir, una exposició elevada) produeix una tinció i desintegració més forta de nuclis o cèl·lules. Un patró TUNEL estrictament apoptòtic és la fragmentació nuclear com a resultat de la formació de cossos apoptòtics (figura 3E). Petits fragments de nuclis positius per a TUNEL, que probablement són cossos apoptòtics, es van veure a la isquèmia-reperfusió de rata a les 24-72 h [97]. També es van observar cossos apoptòtics amb l'etiquetatge TUNEL dels nuclis a l'epiteli tubular renal i l'interstici 14 dies després de la lesió per isquèmia-reperfusió en rates [141]. L'augment de les dosis d'oli de lavanda va reduir els patrons de TUNEL només de nuclis i els va convertir en TUNEL semblant a la necrosi amb fuita citoplasmàtica [94]. Aquest últim va ser el resultat de la destrucció de l'embolcall nuclear per l'acció de les proteïnases i les lipases en la necrosi. Es va observar TUNEL citoplasmàtic (figura 3F) com un citoplasma positiu per a TUNEL en microscòpia lleugera en el model de rabdomiòlisi en túbuls de rata [142] i en podòcits cultivats en presència d'alta glucosa i en nefropatia diabètica en ratolins [135]. TUNEL citoplasmàtic també es va descriure en isquèmia-reperfusió renal en ratolins mitjançant TUNEL fluorescent FL [98] i en isquèmia-reperfusió en rates mitjançant microscòpia de llum [143]. Dany profund i exclusivament tubular induït pel clorur mercúric amb una forta tinció citoplasmàtica de TUNEL indicativa de dany a la membrana nuclear [60]. Si la lesió continua o augmenta la dosi de l'agent danyós, TUNEL citoplasmàtic es pot convertir en una imatge "desordenada" de TUNEL dispers (figura 3G) atribuïda a les etapes últimes de la destrucció cel·lular a causa de la necrosi i el vessament de citoplasma cel·lular i restes. Per exemple, es va observar tant el TUNEL citoplasmàtic com el dispers en ratolins tractats amb cisplatí [71,72] i rates [144], i en lesions de podòcits en rates diabètics induïdes per estreptozotocina [145]. També es va observar TUNEL necròtic dispers durant la nefrotoxicitat induïda per l'acetat d'uranil en ratolins [101]. Finalment, una altra variable de senyal de TUNEL a la qual cal prestar atenció és la intensitat dels senyals positius de TUNEL, que poden desviar-se d'una cèl·lula a una altra depenent del nombre de trencaments (grau de lesió) que experimenta cada cèl·lula, tal com documenten alguns estudis [45,96,125] ]. Per als models en què s'observa una intensitat de senyal TUNEL variable, es recomana la quantificació tant pel nombre d'objectes positius per a TUNEL com per la intensitat mitjana de la tinció.

Conclusions

A causa de l'alta activitat de les endonucleases apoptòtiques al ronyó, especialment la DNasa I i EndoG, l'ús de TUNEL perinvestigació i diagnòstic renalés molt informatiu. Pot ser encara més útil si s'aplica TUNEL més enllà del seu ús inicial com a mètode per identificar l'apoptosi. L'aplicació de TUNEL exclusivament per a estudis d'apoptosi és un bon exemple de com la ciència es pot desviar inadvertidament per un mètode utilitzat de manera inadequada. Malgrat el seu ús com a assaig de lesions majoritàriament agudes, TUNEL es pot aplicar amb èxit per avaluar tant l'AKI com la CKD. Tanmateix, en la CKD, el grau de positivitat de TUNEL s'ha d'esperar que sigui més baix que en la lesió aguda. Com que l'activitat de les endonucleases (principalment, la DNasa I) és molt més elevada a l'epiteli tubular que en altres compartiments renals, la lesió dels túbuls renals sol ser vista com més prominent. Tanmateix, les lesions glomerulars o vasculars també es poden estudiar mitjançant TUNEL si la lesió realment es produeix en aquests compartiments. La colocalització de FL fluorescent TUNEL amb marcadors IHC permet la identificació i associació de tipus cel·lulars i mecanismes de mort cel·lular amb senyals TUNEL. La quantificació de TUNEL pot aportar informació valuosa sobre el grau de mort cel·lular, i l'aplicació de programari d'anàlisi d'imatges pot ser molt útil en aquest sentit. Tenint en compte la varietat de patrons de TUNEL, es recomana encaridament establir i demostrar imatges representatives

TUNEL senyals que es consideren positius. Finalment, els patrons TUNEL s'han d'utilitzar com a font d'informació addicional, com ara el mecanisme de mort cel·lular i el grau de toxicitat. Per exemple, distingir entre cossos apoptòtics TUNEL positius, la presència de senyals TUNEL citoplasmàtics o patrons TUNEL dispersos pot ajudar a identificar cèl·lules TUNEL positives apoptòtiques i necròtiques per a interpretacions més precises dels resultats de la investigació i el diagnòstic.

tractament del trastorn renal de l'excitació sexual