L'extracte de placenta porcina augmenta els nivells de NAD cel·lular en els queratinòcits epidèrmics humans

Les millors herbes per a Cistanche anti-envelliment

Nicotinamida adenina dinucleòtid(NAD) és un cofactor clàssic per a moltes reaccions redox i està present a totes les cèl·lules vives en les formes oxidada (NAD més) i reduïda (NADH). NAD plus també es coneix com un cosubstrat essencial per als enzims que consumeixen NAD plus com la sirtuïna (SIRT) i la poli ADP-ribosa polimerasa (PARP). Com que aquests enzims tenen un paper central en diversos processos biològics, com ara la reparació de l'ADN, el metabolisme mitocondrial i la resistència a l'estrès, l'homeòstasi desequilibrada del NAD afecta els seus processos fonamentals1. Els nivells de NAD en teixits/òrgans disminueixen amb l'edat, donant lloc a una homeòstasi de NAD desequilibrada2-6. Per tant, ara hi ha un consens que mantenir els nivells de NAD condueix a la prevenció i el tractament de l'envelliment i les malalties relacionades amb l'edat7. El NAD es biosintetitza mitjançant una varietat de vies, inclosa la biosíntesi de novo a partir del triptòfan, la via Preiss-Handler de l'àcid nicotínic i la via de rescat de la nicotinamida (NAM)8. En els mamífers, la via de salvament és la via principal per mantenir els nivells de NAD cel·lular9. En aquesta via, NAM es converteix en mononucleòtid de nicotinamida (NMN) per NAM fosforibosiltransferasa (NAMPT) i després es converteix en NAD per NMN adenililtransferases. El ribòsid de nicotinamida (NR) es converteix en NMN per les quinases NR i després s'integra a la via de salvament. S'ha demostrat que els metabòlits intermedis de NAD, com NMN i NR, augmenten els nivells de NAD en diverses cèl·lules i teixits i milloren les malalties relacionades amb l'edat10,11.

L'extracte placentari (PE) s'ha utilitzat àmpliament en la medicina tradicional per a la cicatrització de ferides. El PE és una font rica de nombrosos components bioactius, com ara aminoàcids, àcids nucleics, àcids grassos, minerals, vitamines, hormones, pèptids bioactius, citocines i factors de creixement. Se sap que té diverses activitats farmacològiques, com ara efectes antiinflamatoris, antioxidants, regeneratius i immunomoduladors12. Així, les injeccions subcutànies i intramusculars de PE humà (HPE) s'han utilitzat clínicament per al tractament de diverses malalties, inclosos els símptomes de la menopausa i la malaltia hepàtica crònica13. A més, l'HPE s'utilitza clínicament com a agent antiarrugues principalment als països asiàtics pels seus efectes sobre el creixement cel·lular i la síntesi de col·lagen14. Atès que l'ús d'HPE està restringit a aplicacions mèdiques en alguns països com el Japó, el PE porcí (PPE) es va desenvolupar recentment com a alternativa a l'HPE i s'ha utilitzat com a ingredient en brut en aliments i cosmètics saludables. Un estudi in vivo utilitzant un model de dermatitis de contacte de ratolí va demostrar que l'EPI tòpic té efectes antiinflamatoris i antioxidants a la pell15. Els estudis clínics han informat que l'EPI tòpic és beneficiós per al tractament de ferides cròniques que no cicatritzen i per prevenir la formació d'arrugues16,17. A més, es va dur a terme un assaig clínic aleatoritzat, doble cec i controlat amb placebo en dones adultes sanes per validar els beneficis de la pell de la ingestió oral d'EPI i va demostrar que l'estat de la pell del grup d'ingesta d'EPI va millorar significativament18. Aquests informes donen suport al concepte que el tractament amb EPI pot alleujar o prevenir l'envelliment de la pell.

El PE s'ha utilitzat convencionalment com aagent anti-envelliment, i nombrosos estudis clínics l'han establertpropietats anti-envelliment. Tanmateix, el mecanisme subjacent als efectes anti-envelliment de la PE no està clar. Aquest informe va demostrar que el PPE conté diversos precursors de NAD, com NMN i NR, i augmenta els nivells intracel·lulars de NAD en queratinòcits epidèrmics humans normals (NHEK). Les nostres troballes proporcionen noves idees sobre el mecanisme mitjançant el qual PE exerceix els seus efectes anti-envelliment mantenint l'homeòstasi NAD intracel·lular.

Resultats

L'EPP augmenta els nivells de NAD intracel·lular. Per investigar si el PPE canvia els estats de NAD cel·lular, vam cultivar NHEK en un medi suplementat amb PPE i vam quantificar els seus nivells intracel·lulars de NAD plus i NADH. Els resultats van mostrar que l'EPI va augmentar significativament la quantitat tant de NAD més com de NADH a les NHEK de manera dependent de la dosi (Fig. 1A). El nivell total de NAD (NAD més NADH) de les cèl·lules tractades amb 1 mg/mL d'EPP va ser aproximadament 1,5 vegades superior al de les cèl·lules no tractades (Fig. 1A). A més, en un experiment de transcurs de temps, es va observar una elevació significativa dels nivells de NAD més, NADH i NAD total després de 4 h de tractament amb 1 mg/mL d'EPI (Fig. 1B). L'assaig de {{10}}(4,5-dimetiltiazol-2-il){-2,5-bromur de difeniltetrazoli (MTT) va confirmar que {{20} },5-2 mg/mL PPE no va tenir cap efecte sobre l'activitat metabòlica cel·lular, mentre que 5 mg/mL PPE o el control positiu (0,2 per cent de Triton X-100 [TX{-100]) van mostrar una toxicitat cel·lular important. (Fig. 1C). Com que el NAD amb prou feines es va detectar en el propi PPE (dades no mostrades), l'efecte que produeix NAD del PPE no semblava ser degut a l'afluència de NAD derivat del PPE als NHEK. Així, aquests resultats suggereixen que el PPE pot augmentar els nivells de NAD intracel·lular. Els ingredients actius dels EPI són molècules petites, no proteïnes. Per determinar si el PPE augmenta la biosíntesi de NAD cel·lular mitjançant la reacció NAMPT a la via de salvament de NAD, vam realitzar un assaig de recuperació de NAD mitjançant l'inhibidor de NAMPT FK 866 (Fig. 2A). FK866 va reduir considerablement els nivells totals de NAD 24 h després de l'addició (figura 2B).

Curiosament, malgrat l'absència d'activitat NAMPT dins dels NHEK, el PPE va suprimir l'esgotament de NAD induït per FK{{{0}} de manera dependent de la dosi (figura 2B). Molts informes han demostrat que el PE conté proteïnes com ara citocines i factors de creixement13,19,20. Per tant, vam suposar que algunes proteïnes bioactives o NAMPT porcina contingudes en PPE podrien millorar la biosíntesi intracel·lular de NAD en NHEK. Per confirmar la nostra hipòtesi, vam separar PPE en fraccions de pes molecular alt i baix (HMW, LMW) mitjançant un dispositiu de filtre centrífug (tall: 3 kDa). Com que l'assaig de recuperació de NAD utilitzant FK866 va mostrar l'efecte de l'EPI sobre la biosíntesi de NAD amb més claredat que en absència de FK866 (Figs. 1A i 2B), vam procedir a identificar els ingredients actius de l'EPI. utilitzant aquest assaig. Inesperadament, l'HMW-PPE va requerir una concentració elevada d'1 mg/mL per a una restauració significativa dels nivells de NAD, mentre que el LMW-PPE va millorar clarament l'esgotament de NAD induït per FK866- fins i tot a una concentració baixa de 0, 25 mg/mL (Fig. .2C i D). Així, aquests resultats suggereixen que els ingredients actius primaris de l'EPI són molècules petites de menys de 3 kDa, més que proteïnes com els factors de creixement i les citocines.

El PPE conté precursors de NAD, com NMN i NR. A més, vam fraccionar LMW-PPE en 12 fraccions mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) en fase inversa i vam investigar quina fracció va contribuir a la restauració de l'esgotament de NAD induït per FK866-. A la figura 3A es mostra un cromatograma HPLC típic del LMW-PPE. L'assaig de recuperació de NAD va demostrar que només la fracció 3 augmentava clarament els nivells de NAD en NHEK tractats amb FK866- (figura 3B). Els precursors de NAD, com NMN i NR, eleven els nivells intracel·lulars de NAD sense intervenció de NAMPT en diverses línies cel·lulars, incloses les NHEKs10,21. Com que el LMW-PPE encara augmentava el contingut de NAD als NHEK, fins i tot quan el NAMPT va ser inhibit per FK866, vam plantejar la hipòtesi que els precursors de NAD continguts en l'EPI milloren la producció intracel·lular de NAD. Per provar aquesta hipòtesi, vam analitzar la fracció 3 mitjançant cromatografia líquida-espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS) per detectar els precursors de NAD. Els resultats van mostrar que es van detectar tres pics d'ions consistents amb NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) i NAM (m/z 123→80) a la fracció 3 ( Fig. 3C). Les anàlisis de quantificació van revelar que la concentració de NMN, NR i NAM continguda en el PPE sencer era de 0,22, 17,62 i 0,14 ng/mg, respectivament (taula 1). Aquests resultats suggereixen que almenys tres precursors de NAD, NMN, NR i NAM, estan presents a l'EPI i participen en l'augment de NAD intracel·lular.

Figura 2. L'EPP millora l'esgotament de NAD per FK866 als NHEK. (A) La via de salvament de la biosíntesi de NAD. Els NHEK es van tractar prèviament amb FK866 durant 30 min i es van incubar amb PPE sencer (B), HMW-PPE (C) o LMW-PPE (D) a les concentracions indicades durant 24 h. Els nivells totals de NAD es van determinar mitjançant el kit d'assaig NAD plus /NADH. †p<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

L'administració tòpica d'EPI a l'epidermis humana reconstruïda augmenta els nivells de NAD dels teixits. Els ingredients actius primaris en l'efecte que augmenta el NAD de l'EPI són molècules petites, que es pot esperar que tinguin una absorbència transdèrmica més alta que les proteïnes més grans, com ara els factors de creixement. Per tant, l'aplicació tòpica d'EPI a la pell sembla ser una opció adequada per augmentar els nivells de NAD als teixits de la pell. Per investigar si l'administració tòpica d'EPI afecta els nivells de NAD a l'epidermis per sota de l'estrat corni, l'epidermis humana reconstruïda 3-dimensional (RHE) es va tractar amb PPE al costat de l'estrat còrni i es va cultivar en un medi amb presència o absència. de FK866 (Fig. 4A). L'aplicació tòpica d'EPI va augmentar els nivells de NAD un 9,1 per cent (no significatiu) o un 7,3 per cent (significant) en absència o presència de FK 866, respectivament (figura 4B). L'EPI no va tenir cap efecte sobre l'activitat metabòlica cel·lular quan es va provar fins a 10 mg/ml, mentre que l'1 per cent de TX-100 es va reduir notablement (Fig. 4C). Aquests resultats suggereixen que els ingredients actius de l'EPI poden infiltrar-se a la pell subcorneal i augmentar els nivells de NAD de la pell sense causar efectes nocius.

Demana més:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: més 86 15292862950