Descobriments preliminars de citocines plasmàtiques inflamatòries elevades en nens amb autisme que tenen símptomes gastrointestinals comòrbids Part 1

Resum:

El trastorn de l'espectre autista (AU) està present en aproximadament el 2% de la població i sovint s'associa a comorbiditats que poden afectar la qualitat de vida. Una de les comorbiditats més freqüents en l'autisme és la presència de símptomes gastrointestinals (GI) consistents en hàbits intestinals irregulars com ara restrenyiment, diarrea o hàbits intestinals alternats.

En els darrers anys, amb l'aprofundiment de la investigació sobre el trastorn de l'espectre autista (TEA), cada vegada més persones han començat a prestar atenció a la relació entre el TEA i la immunitat. Tot i que els resultats actuals de la investigació no són del tot coherents, la majoria dels estudis han demostrat que efectivament hi ha un vincle entre el TEA i la immunitat.

En primer lloc, molts nens neixen amb una immunitat baixa, cosa que pot augmentar el seu risc de desenvolupar TEA. En segon lloc, cada vegada hi ha més estudis que demostren que hi ha anomalies en el sistema immunitari dels pacients amb TEA. Per exemple, poden tenir reaccions al·lèrgiques, malalties autoimmunes, etc. A més, alguns estudis han trobat que els pacients amb TEA presenten nivells més alts d'estrès oxidatiu, que poden provocar danys cel·lulars i neurodegeneració.

Tanmateix, no hem de passar per alt els aspectes positius de viure amb TEA. Les persones amb TEA poden tenir una immunitat més forta. Els estudis han demostrat que el seu sistema immunitari pot ser millor per fer front a algunes invasions bacterianes i virals. A més, els pacients amb TEA també poden tenir més cèl·lules immunitàries i els seus sistemes immunitaris poden ser més estables i menys propensos a reaccions excessives.

En general, la relació entre el TEA i la immunitat és complexa i no només positiva o negativa. Aquesta qüestió s'ha d'explorar en profunditat mitjançant una investigació més rigorosa en el futur. En qualsevol cas, tots hauríem de ser proactius amb el TEA i treballar amb les persones amb TEA i les seves famílies perquè puguin adaptar-se millor a la societat. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la nostra immunitat. Cistanche pot millorar significativament la immunitat, perquè la cendra de carn conté una varietat de components biològicament actius, com ara polisacàrids, bolets i Huang Li. Aquests components poden estimular diverses cèl·lules del sistema immunitari i augmentar la seva activitat immune.

Cliqueu els avantatges de cistanche tubulosa

S'ha demostrat evidència d'infiltració immune i activació immune a l'ileon i el còlon de nens amb AU amb símptomes gastrointestinals. A més, la disfunció immune és un factor que contribueix a moltes malalties gastrointestinals, i es planteja la hipòtesi que seria més evident en nens amb AU que presenten símptomes GI que en aquells que no presenten símptomes GI.

Aquest estudi preliminar tenia com a objectiu determinar si hi ha nivells de citocines alterats al plasma en nens amb AU amb símptomes GI en comparació amb nens amb AU sense símptomes GI, normalment nens en desenvolupament (TD) amb símptomes GI i nens TD sense símptomes GI, a partir del mateix cohort basat en la població. Els nivells de citocines en plasma es van avaluar mitjançant assaigs multiplex.

No es van observar diferències en les citocines plasmàtiques en els controls de TD amb o sense símptomes gastrointestinals; no obstant això, moltes citocines innates (IL-1, TNF, GM-CSF, IFN) i adaptatives (IL-4, IL-13, IL-12p70) es van incrementar a AU nens amb símptomes gastrointestinals en comparació amb nens amb AU sense símptomes gastrointestinals. La citocina IL-15 rellevant per a la mucosa va augmentar a l'AU amb símptomes gastrointestinals en comparació amb tots els grups.

En canvi, la citocina reguladora IL-10 es va reduir a l'AU amb símptomes GI i pot suggerir un desequilibri en els senyals proinflamatoris/reguladors. Aquestes dades suggereixen que els nens amb símptomes de AU i GI tenen un desequilibri en la seva resposta immune que és evident en els seus nivells de citocines plasmàtiques circulants. Una troballa que podria apuntar a possibles estratègies terapèutiques i/o de seguiment per a problemes GI a la UA.

Paraules clau:
autisme; TEA; immune; inflamació; gastrointestinal; comorbiditats; citocines; regulació; esquizofrènia; tolerància; immunitat innata; immunitat adaptativa; immunitat de la mucosa.

1. Introducció

Els trastorns del neurodesenvolupament, com ara el trastorn de l'espectre de l'autisme (AU), estan augmentant ràpidament en prevalença a tot el món. La seva etiologia és en gran part desconeguda, però, en la majoria dels casos, probablement a causa d'una combinació de factors genètics i ambientals. El diagnòstic de l'AU es limita actualment a trets de comportament, com ara comportaments repetitius i estereotipats i deficiències en la comunicació i la interacció social.

No obstant això, moltes persones amb AU també pateixen una o més comorbiditats mèdiques, inclosa la disfunció gastrointestinal (GI) [1–7] Durant 80 anys s'han reportat símptomes gastrointestinals en l'autisme [8], amb símptomes intestinals irregulars de restrenyiment i diarrea, sent el més comú [9–11].

En el nostre gran estudi de cohorts de 1.000 participants, els nens amb AU tenien entre 6 i 8 vegades més probabilitats de patir símptomes gastrointestinals en comparació amb els nens de desenvolupament típic de la mateixa edat; a més, els símptomes GI es van associar amb puntuacions d'avaluació del comportament més baixes [12].

Malgrat els informes freqüents de disfunció GI a la UA, hi ha una manca de derivació a clíniques especialitzades o tractament adequat dels símptomes GI. L'absència d'estudis sobre signatures biològiques en les comorbiditats de la UA també ha obstaculitzat les estratègies que podrien ajudar a alleujar els problemes gastrointestinals.
Les cèl·lules immunitàries de la mucosa comprenen aproximadament el 70 per cent de les cèl·lules immunitàries del cos, i la disfunció d'aquestes cèl·lules pot tenir conseqüències adverses per a la funció GI. La immunitat de la mucosa alterada pot afectar la funció de barrera epitelial hoste, la diversitat de bacteris comensals a l'intestí i el sistema nerviós entèric [3].

Molts informes han descrit anomalies immunes a la UA, inclosos canvis en la genètica immune, producció esbiaixada de citocines, funció alterada de les cèl·lules T i respostes immunitàries innates millorades [13–16]. A més, s'ha informat d'activació immune en gairebé dos terços dels nens amb AU i s'associa a comportaments més greus [13]. Les anàlisis endoscòpiques de nens AU amb símptomes gastrointestinals han revelat la presència d'una inflamació subtil i difusa del tracte intestinal (revisat a [1, 4]).

Tanmateix, la naturalesa precisa d'aquesta inflamació s'ha debatut i actualment no està clara. La histologia, la immunohistoquímica i les proves de citometria de flux han demostrat constantment la infiltració panenterica de cèl·lules immunitàries com limfòcits, monòcits, cèl·lules assassines naturals (NK) i eosinòfils a les parets del tracte gastrointestinal en nens amb AU, en comparació amb el desenvolupament típic ( TD) nens amb símptomes gastrointestinals [9,17–21].

Aquests informes han demostrat que en nens amb símptomes de AU i GI, hi ha un augment dels infiltrats de cèl·lules immunitàries al còlon, ile, duodè i estómac. A més, els limfòcits infiltrats presenten un marcat fenotip proinflamatori, amb un augment de les cèl·lules CD3 més IL-6 més, CD3 més TNF més cèl·lules i una reducció de les cèl·lules reguladores CD3 més IL-10 més en nens amb AU i Símptomes gastrointestinals en comparació amb els controls [17,18].

La comparació de la producció intracel·lular de citocines abans i després del repte immune a les cèl·lules T perifèriques va revelar un perfil similar amb un augment de la producció de citocines proinflamatòries però una disminució de la regulació en nens amb AU que tenien símptomes GI en comparació amb els controls [22].

Les respostes de citocines estimulades observades en nens amb símptomes AU i GI eren diferents dels nens amb AU sense símptomes GI, així com els nens de control de TD i suggereixen que la producció de citocines després del repte immunitari pot ser única en nens amb símptomes AU i GI.

Els perfils immunitaris en nens amb símptomes de AU i GI també eren diferents dels nens amb malalties inflamatòries intestinals (MII) establertes, com la malaltia de Crohn, la malaltia celíaca i la colitis ulcerosa [9,17–19,21]. S'han demostrat troballes similars d'augment de la producció de citocines proinflamatòries després de l'estimulació, IL-1, IL{-6 i TNF, en nens que tenen AU i sensibilitat alimentària en comparació amb els controls [23,24].

La recerca de signatures biològiques o biomarcadors en l'autisme ha estat fins ara una àrea poc estudiada. Sens dubte, la major utilitat de les signatures biològiques en el context de la UA no serà la determinació dels símptomes bàsics, sinó les comorbiditats associades. Aquestes comorbiditats sovint tenen efectes profunds sobre la gravetat dels símptomes o conductes associades com el son, la irritabilitat, l'agressivitat o l'ansietat [3].

Algunes citocines plasmàtiques o mediadors immunitaris s'han investigat pel seu potencial com a biomarcadors, sobretot en el context de la gravetat de la AU [14,25–27]. No hi ha marcadors de plasma que puguin ajudar a identificar o fer un seguiment de la trajectòria dels símptomes gastrointestinals a la UA. En l'estudi actual pretenem caracteritzar els perfils de citocines plasmàtiques en nens amb AU amb o sense símptomes GI a partir d'un mostreig aleatori d'un estudi de casos i controls basat en la població.

2. Materials i Mètodes

Aquest estudi va incloure 79 participants que estaven inscrits a l'estudi CHARGE (Risc d'autisme infantil a partir de la genètica i el medi ambient), un estudi de casos i controls basat en la població en curs [28]. Breument, els participants de l'estudi CHARGE es van seleccionar entre 2 estrats: trastorns de l'autisme (AU) i controls de la població general que normalment desenvolupa (TD).

Els nens elegibles tenien entre 24 i 60 mesos d'edat, nascuts a Califòrnia, vivint amb almenys un progenitor biològic que parlava anglès o espanyol i residint a les àrees de captació d'una llista especificada de centres regionals a Califòrnia. Els nens amb AU es van identificar a través de centres regionals, proveïdors/clíniques, autoreferències i divulgació pública en general.

Els nens amb TD es van identificar a partir dels fitxers de naixement estatals i es va generar una mostra aleatòria estratificada mitjançant la concordança de freqüències amb una distribució projectada de casos AU per edat, sexe i àrea de captació. Es van excloure els nens amb deficiències motrius i sensorials importants (per exemple, ceguesa i sordesa) que impedirien una avaluació vàlida del desenvolupament.

El protocol de l'estudi CHARGE va ser aprovat pels comitès de revisió institucional de la Universitat de Califòrnia a Davis i el Comitè per a la protecció de subjectes humans de l'estat de Califòrnia. Es va obtenir el consentiment informat per escrit abans de la participació.

Per a aquest estudi, es van seleccionar aleatòriament 40 casos amb controls AU i 40 TD d'un grup de participants de l'estudi CHARGE inscrits entre l'abril de 2003 i l'abril de 2008, van proporcionar una mostra de sang, van completar un qüestionari d'història GI i tenien un diagnòstic confirmat d'AU o TD. Els casos i els controls es van comparar segons l'edat a l'extracció de sang (a intervals de 3-mesos) i si tenien o no símptomes gastrointestinals freqüents de moviments intestinals irregulars (definits com a diarrea o restrenyiment freqüents en els darrers 3 mesos).

L'objectiu inicial de l'estudi era tenir 20 casos i 20 controls amb símptomes GI freqüents, així com 20 casos i 20 controls sense símptomes GI freqüents. Com que en el moment de l'estudi, només 9 controls de tot l'estudi CHARGE tenien símptomes GI freqüents, casos i controls només es van comparar amb l'edat a la presa de sang.

La mostra final de 80 nens comprenia 20 casos (edat mitjana 41,7 ± 9,6 mesos; 16 homes) i 9 controls (edat mitjana 41,6 ± 9,1 mesos; 7 homes) amb símptomes gastrointestinals freqüents i 20 casos (edat mitjana 41,9 ± 9,3 mesos; 19). homes) i 31 controls (edat mitjana 42,2 ± 9,3 mesos; 26 homes) sense símptomes gastrointestinals freqüents. Com que es tractava d'un mostreig aleatori, no vam excloure en funció de l'ús de medicaments.

Pocs nens estaven prenent medicaments en el moment de l'extracció de sang: aquests incloïen antimicrobians com aciclovir, ketoconazol (2 casos amb símptomes gastrointestinals, i 2 casos i 2 controls sense símptomes gastrointestinals), esteroides com inhaladors d'asma, Nasonex (2 casos i 1). control amb símptomes GI i 1 cas i 1 control sense símptomes GI), i medicaments relacionats amb GI com Miralax, Nexium, llet de magnesi (2 casos i 3 controls amb símptomes GI).

Cap dels participants estava prenent medicaments antipsicòtics. No hem trobat cap efecte de la medicació a les dades quan s'han analitzat conjuntament (tractades versus no tractades, dins dels grups) o per a medicaments individuals.

El diagnòstic d'autisme es va confirmar mitjançant avaluacions estàndard d'or: Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R; [29]) i Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS; [30]). Els controls es van seleccionar per a l'AU mitjançant el qüestionari de comunicació social (SCQ; [31]) i cap va obtenir una puntuació per sobre del tall (SCQ superior o igual a 15).
Les Escales de Mullen d'Aprenentatge Tempran (MSEL; [32]) i les Escales de comportament adaptatiu de Vineland (VABS; [33]) es van administrar als casos i controls per determinar el desenvolupament cognitiu i adaptatiu, respectivament. El desenvolupament típic dels controls es va definir com tenir puntuacions compostes superiors o iguals a 70 en ambdues avaluacions i sense cap diagnòstic previ de retard del desenvolupament.

Tots els metges de l'Institut UC Davis MIND (Investigació Mèdica de Trastorns del Desenvolupament Neuro) havien aconseguit la fiabilitat de la investigació sobre les avaluacions del desenvolupament que van administrar (ADI-R, ADOS, MSEL i VABS). El personal de l'estudi bilingüe estava disponible per administrar el consentiment informat i tots els instruments/qüestionaris en espanyol.

2.1. Recollida de sang i anàlisi de citocines
Es va recollir sang perifèrica de cada subjecte en Vacutainers àcid-citrat dextrosa (BD Biosciences; San Jose, CA, EUA). La sang es va centrifugar a 2100 rpm durant 10 min, després es va recollir plasma i es va emmagatzemar a -80 ◦ C abans de les anàlisis de citocines. Les concentracions de citocines al plasma dels participants es van determinar mitjançant un assaig d'immunoassaig de perles multiplexades (Millipore, Billerica, MA, EUA). Les mostres i els controls de referència es van executar segons el protocol del fabricant.

Breument, es van incubar 25 µL de mostra de plasma amb perles fluorescents acoblades a anticossos, després es van rentar i es van incubar amb anticossos de detecció biotinilats seguits d'estreptavidina-ficoeritrina. A continuació, es van analitzar les perles mitjançant un sistema de matriu de suspensió Luminex™ 100 basat en flux (Bio-Plex 200; BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). El programari Bio-plex Manager va generar corbes estàndard per determinar la concentració de mostra desconeguda. Totes les mostres i les citocines de referència es van preparar segons la recomanació del fabricant i es van avaluar els nivells de citocines i quimiocines mitjançant l'anàlisi multiplex Luminex™.

Els valors de les mostres s'expressen en pg/mL. Les citocines/quimiocines analitzades van ser interleucina (IL){{0}}, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL{ {5}}, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL{{1{0}} (p4{{48} }), IL-12 (p7{{50}}), IL-13, IL{-15, IL{-17, estimulant de colònies de granulòcits i macròfags factor (GM-CSF), factor estimulant de colònies de granulòcits (G-CSF), interferó gamma (IFN), IFN- 2, factor de necrosi tumoral-alfa (TNF), TNF, eotaxina, proteïna quimiotàctica de monòcits (MCP) )-1, proteïna inflamatòria dels macròfags (MIP)-1 , MIP-1 i proteïna induïda per interferó gamma (IP-10) d'1{0 kDa, la els límits mínims de detecció per a aquestes citocines/quimiocines eren 2,4, 0.3, 1.2, 1.3, 2.2, {{6{0}}.2, 1.1, 2.4, 0.9, 0.3, 34.9, 0.8, 1.0, 0.8, 0.4, 5.0, 0.9, 0.5, 0.4, 1.5, 0.9, 5., 1.8, 5, 10 ,7 i 3,6 pg/ml, respectivament.

Les concentracions obtingudes per sota del límit de detecció (LOD) del mètode es van calcular com la meitat del límit de detecció (LOD/2) per a les comparacions estadístiques. Els valors obtinguts a partir de la lectura de mostres que superaven el límit superior del mètode de sensibilitat es van diluir encara més i es van calcular les concentracions de citocines en conseqüència.

Les variacions intra i interplaques/assaig dels nivells de citocines, utilitzant mostres representatives executades a totes les plaques, van ser inferiors al 5 per cent. Les alíquotes de plasma no havien patit cap cicle de congelació/descongelació anterior. L'analista de citocines es va cegar a l'estat del cas o control de cada mostra.

For more information:1950477648nn@gmail.com