L'aprenentatge previ de la por permet l'assimilació ràpida de nous records de por directament a les xarxes corticals Part 3

Disseny experimental

La reproductibilitat de les dades es va avaluar amb diferents rèpliques (taula S1). Els primers experiments d'inactivació de CNQX a Te2 (Fig 1A-1C) es van realitzar en un nombre més gran de rèpliques perquè van ser els primers experiments que vam realitzar i van servir per provar la hipòtesi principal del nostre estudi. Els animals van ser assignats a priori a diferents grups de comportament d'una manera equilibrada pel pes. Els animals mascles de la mateixa cria es van assignar aleatòriament a cada grup experimental. Primer vam abordar la hipòtesi principal del nostre estudi, és a dir, la inactivació cortical pot afectar de manera diferent la consolidació d'un nou record de por en rates experimentalment ingènues i en animals que havien après un esdeveniment de por previ.

Els animals mascles tenen records extremadament forts perquè tenen un instint de supervivència més fort i el desig de reproduir-se. Els animals que sobreviuen a la natura necessiten recordar molta informació geogràfica, tipus d'aliments, rastres de depredadors i ubicacions dels membres del grup per adaptar-se millor al medi ambient i protegir la vida.

Per exemple, els lleons mascles han de recordar l'estat de tot el territori, les relacions de membres i les ubicacions dels competidors per protegir el territori i el seu estat. Les zebres mascles han de recordar la ubicació de les fonts d'aigua i els aliments a les praderies per sobreviure i reproduir-se. Una empresa de refrescs va publicar una vegada un anunci que mostrava que un ós polar mascle podia recordar un bussejador i la seva olor única perquè pogués identificar-lo la propera vegada que el veiessin.

Per tant, els animals mascles necessiten tenir un record fort pel que fa a la protecció del seu territori, el subministrament d'aliment suficient i la reproducció de la descendència. Això també els converteix en temes importants en la investigació humana, per exemple, per explorar malalties com el deteriorament de la memòria i la malaltia d'Alzheimer.

En el món humà, també ens podem inspirar en la memòria dels animals mascles. L'exposició contínua a coses noves, l'aprenentatge continu i el pensament poden millorar la nostra memòria i adaptabilitat, i millorar el nostre nivell de vida i l'eficiència laboral. Per tant, aprenem dels animals mascles, continuem acumulant coneixements i experiència, tenim forts instints de supervivència i desitjos reproductius i creem un futur millor. Es pot veure que hem de millorar la nostra memòria. Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria perquè Cistanche deserticola és un material medicinal tradicional xinès amb molts efectes únics, un dels quals és millorar la memòria. L'eficàcia de la carn picada prové dels diferents ingredients actius que conté, incloent àcids, polisacàrids, flavonoides, etc. Aquests ingredients poden promoure la salut del cervell de diverses maneres.

Feu clic a conèixer maneres de millorar la funció cerebral

En el cas de diferències estadístiques entre aquests grups, finalment vam realitzar grups de control addicionals mitjançant la injecció de solució salina. Es va aplicar un enfocament similar als experiments optogenètics, on el grup de control AAV només es va realitzar després que es detectessin diferències estadístiques entre rates ingènues i entrenades prèviament. Aquests horaris experimentals ens van permetre evitar grups de control innecessaris i l'ús d'animals innecessaris, una qüestió clau en la legislació europea i italiana sobre experimentació amb animals (principi 3 Rs).

Procediments de conducta

Tots els experiments es van dur a terme durant la fase de llum del dia (de 8:00 a 16:00). Els animals es van transportar individualment des de les instal·lacions a les sales experimentals dins de diferents petits cubells transparents en funció de les demandes experimentals.

Entrenament auditiu: Primera sessió conductual. Animals auditius condicionats per la por (CS1-CS2). En aquest grup, les rates es van treure suaument de la gàbia de casa i es van portar des de l'habitació de l'habitatge fins a l'habitació insonoritzada. Un cop allà, els animals es van col·locar dins de l'aparell de condicionament que consistia en una gàbia negra rectangular (35 × 40 cm) equipada amb una reixeta de barres d'acer inoxidable (1 cm de diàmetre, espaiades 1,5 cm) connectada a una configuració de lliurament de xoc.

Les rates es van deixar tranquil·les durant 1 minut. Després d'aquest temps, es van administrar 7 estímuls condicionats (CS) consistents en un to pur de 15 kHz de freqüència (15 s de durada cadascun, 80 dB, interval de proves de 36 s). Els últims 1 s de cada to es van combinar amb un US dolorós (0, 5 mA, 1 s). Al final de la sessió de condicionament, les rates van ser portades de tornada a la seva gàbia.

Animals només de xoc (shock-CS2). En aquest grup, les rates es van col·locar de manera similar dins del mateix aparell de condicionament. Immediatament després, cada rata va ser sotmesa a 7-xocs amb els peus (1 s, 0,5 mA) un després de l'altre. Al final de l'estimulació, els animals van ser portats de tornada a la seva gàbia. El temps de permanència a la gàbia de condicionament va ser inferior a 9 segons. Estudis anteriors van demostrar que aquest procediment permet evitar processos associatius entre estímuls dolorosos i estímuls sensorials [29,30].

Olor d'animals condicionats per por (olor-CS2). En aquest grup, les rates es van col·locar dins de la mateixa gàbia negra rectangular emprada en els grups experimentals anteriors i es van connectar a una configuració de lliurament de xoc. Les rates es van deixar tranquil·les durant 2 minuts. Passat aquest temps, es van administrar 7 CS consistents en olors de vainilla (1 0 s de durada cadascuna, interval de prova de 24 s). Els últims 1 s de cada olor es van combinar amb un US dolorós (0, 5 mA, 1 s). El mòdul de condicionament es va col·locar a prop d'una font de ventilació per evitar la persistència dels estímuls lliurats després de la seva compensació. La gàbia estava assegurada amb una reixeta superior. Les olors es van presentar mitjançant un olfactòmetre de dilució de flux. L'aire net (1,5 L/min) es va dirigir a una vàlvula de solenoide, que quan es va accionar, va passar l'aire a una ampolla de 15 ml que contenia 10 ml d'olor de vainilla.

Animals de només to (Tone-CS2). Les rates d'aquest grup es van col·locar dins de la mateixa gàbia negra i se'ls va presentar el to de 15-kHz (7 estímuls, 15 s de durada, 36 s ITI) lliurat en absència dels EUA.

Animals preexposats (Tone-CS1-CS2). Les rates es van col·locar a l'interior de la gàbia de condicionament i, 1 min després, se'ls va presentar 20 vegades només amb el to 15-kHz, i 24 h després es va emparellar el mateix to amb els EUA convertint-se en el CS1.

Animals condicionats per la por de soroll blanc (WN-CS2). En aquest grup, les rates es van col·locar dins de la gàbia negra rectangular i es van deixar sense molèsties durant 1 minut. Passat aquest temps, es van administrar 7 CS consistents en un WN (15 s de durada cadascun, 75 dB, 36 s interval entre assaigs). Els últims 1 s de cada to es van combinar amb un US dolorós (0,5 mA, 1 s). Al final de la sessió de condicionament, les rates van ser portades de tornada a la seva gàbia.

Aprenentatge de la por auditiva: Segon entrenament conductual. Dues setmanes després dels procediments descrits al paràgraf anterior, els animals van ser entrenats en una altra tasca de condicionament de la por auditiva diferent. Les rates es van posar en una caixa de pell estàndard, com en el nostre treball anterior [10], i es van deixar sense molèsties durant 2 min. Després d'aquest temps, es van lliurar 7 CS consistents en tons purs de 3 kHz de freqüència (8 s de durada cadascun, 80 dB, 22 s d'interval entre proves). Els últims 1 s de cada to es van combinar amb un US dolorós (0, 5 mA, 1 s). Al final de la sessió de condicionament, les rates van ser portades de tornada a la seva gàbia.

Por a la retenció de memòria. La retenció de la memòria auditiva de la por recentment adquirida al CS2 (3 kHz) es va provar 4 dies després. Per als experiments d'optogenètica, la prova de memòria recent es va realitzar amb el lliurament de làser 24 h després de l'aprenentatge CS2-EUA en analogia amb l'interval de temps en què vam realitzar la inactivació cortical mitjançant l'administració del CNQX (és a dir, 24 h després de formació). Les rates es van habituar a un aparell diferent del que s'utilitzava per condicionar i es van col·locar en una habitació diferent per evitar un comportament de por condicionat a senyals contextuals [10,62].

El nou aparell consistia en una gàbia de plàstic transparent amb un costat pintat de negre tancat dins d'una caixa d'atenuació acústica equipada amb un ventilador d'escapament, que eliminava l'aire odoritzat del recinte i proporcionava un soroll de fons de 60 dB. Es va permetre als animals explorar la gàbia durant 5 minuts al dia durant la sessió d'habituació. El dia de la prova de retenció de memòria de la por, després de 2 minuts d'exploració gratuïta, vam lliurar 4 CS2 de 3 kHz (8 s—22 ITI) sense cap EUA.

Si ho requeria la demanda experimental, es van provar les rates per a la retenció de la memòria de la por remota, adquirida 2 setmanes abans del segon assaig de condicionament de la por auditiva. Amb aquest objectiu, 7 dies després de la prova de retenció de memòria de la por al to de 3-kHz, els animals van ser col·locats en un entorn nou (una gàbia amb ratlles blanques i negres) i després se'ls va presentar el to de 15-kHz. Es van presentar quatre tons a intervals de 36 segons.

Formació contextual: Primera sessió conductual. Grup de condicionament de la por contextual (CtxA-CtxB). En aquest grup, les rates es van treure suaument de la seva gàbia de casa, es van col·locar en una galleda i es van portar des de l'habitació de l'habitatge fins a l'habitació insonoritzada. Un cop allà, els animals es van col·locar dins de l'aparell de condicionament format per l'esmentada gàbia negra rectangular, equipada amb la reixeta de barres d'acer inoxidable connectada a una configuració de lliurament de xoc. Les rates es van deixar tranquil·les durant 1 minut. Passat aquest temps, es van administrar 5 US (0.5 mA, 1 s) amb intervals de temps de 51 s. Al final de la sessió, els animals van ser tornats a la seva gàbia de casa.

Grup només de xoc (xoc-CtxB). Les rates, un cop col·locades dins de l'aparell de condicionament, van rebre immediatament 5-xocs de peus (1 s, 0,5 mA) un immediatament després de l'altre. El temps de permanència a la gàbia de condicionament va ser inferior a 7 segons. Estudis anteriors van demostrar que aquest procediment permet evitar processos associatius entre estímuls dolorosos i estímuls sensorials [29,30].

Grup només de xoc (xoc-CtxB). Les rates, un cop col·locades dins de l'aparell de condicionament, van rebre immediatament 5-xocs de peus (1 s, 0,5 mA) un immediatament després de l'altre. El temps de permanència a la gàbia de condicionament va ser inferior a 7 segons. Estudis anteriors van demostrar que aquest procediment permet evitar processos associatius entre estímuls dolorosos i estímuls sensorials [29,30].

Nou condicionament de la por contextual i recent retenció de memòria de por. Dues setmanes després dels procediments descrits al paràgraf anterior, tots els grups van ser entrenats per associar un nou entorn contextual (el mòdul de la caixa de pell, situat en una habitació diferent) amb un US dolorós (0,5 mA, 1 s) . Cada animal es va col·locar dins de la nova cambra i es va deixar sense molèsties durant 2 minuts. Després, es va exposar a 5 US separats per intervals de 30 s.

La retenció de la memòria contextual de la por es va provar 4 dies després del procediment de condicionament de la por tornant a posar les rates a la cambra de la caixa Skinner durant 3 minuts. Per als experiments d'optogenètica, la prova de memòria recent es va realitzar amb lliurament làser 24 h després de l'aprenentatge CtxB-US en analogia amb l'interval de temps en què vam realitzar la inactivació cortical mitjançant l'administració del CNQX (és a dir, 24 h després de l'entrenament). Si ho requeria la demanda experimental, es van provar les rates per a la retenció de la memòria de la por remota posant animals en el context emparellats als EUA 2 setmanes abans de la nova associació.

Els animals es van portar en 2 galledes diferents a les cambres de condicionament segons els diferents procediments contextuals.

Mesura de congelació. En tots els procediments experimentals, l'avaluació de la retenció de memòria de la por es va determinar com una resposta de congelació [10], analitzada com l'absència completa de mobilitat somàtica excepte els moviments respiratoris. Per a cada animal, la quantitat de temps (en segons) dedicat a la congelació es va mesurar fora de línia per 2 observadors independents que estaven encegats als grups d'animals.

Procediments quirúrgics

Per administrar les substàncies seleccionades als llocs objectiu, les rates van ser anestesiades amb isoflurà: la inducció es va realitzar al 4% [vol/vol] en 2 L/min d'aire mèdic i es va estendre a una exposició contínua al 2% [vol/vol]) quan es van muntar rates a l'aparell estereotàxic.

Es va fer una incisió al crani i es van perforar petits forats per permetre la penetració d'una agulla d'infusió de calibre 28-. Es va utilitzar una xeringa 10-ul Hamilton muntada en una bomba d'infusió per lliurar substàncies. Després de les infusions, l'agulla es va deixar al seu lloc durant 3 minuts més. A continuació, es va tancar la incisió amb clips de ferides d'acer inoxidable i es va administrar a l'animal una injecció subcutània del ketoprofè analgèsic/antiinflamatori (2 mg/kg de pes corporal) i l'animal es va mantenir calent i sota observació fins a la recuperació de l'anestèsia.

Com en estudis anteriors [10,32–34], la canulació dels animals era innecessària, ja que els compostos actius s'administraven directament estereotàxicament. Aquest procediment és avantatjós perquè s'evita el trauma quirúrgic inherent al procediment de canulació permanent, restringint així el trauma a la penetració d'una sola agulla [10,32-34]. De fet, l'anestèsia general no afecta significativament la consolidació de la memòria [10,32-34]. Per garantir que el moment de l'administració de compostos relacionats amb l'assaig d'aprenentatge fos precís, de manera que les rates rebin els compostos seleccionats al voltant d'1 hora i al voltant d'1 dia després de l'entrenament, es va induir l'anestèsia d'isoflurà 5 minuts abans del moment de la injecció prevista, per exemple, als 55 anys. min en rates tractades 60 min després de l'entrenament i 23 h i 55 min en animals injectats a les 24 h després de l'entrenament. Cada rata es va condicionar i després es va operar per separat. Els animals pertanyents als diferents grups de comportament es van manipular de manera intercalada.

L'inhibidor selectiu dels receptors de glutamat AMPA/kainat CNQX ({{0}}ciano-7-nitroquinoxalina{-2,3-diona) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] es va dissoldre en solució salina estèril (NaCl, 0,9%) i es va ajustar a pH 7,4 amb HCl. L'anisomicina inhibidora de la síntesi de proteïnes (Merck, 125 ug/ul) es va dissoldre en HCl equimolar, es va diluir amb solució salina estèril i es va ajustar a pH 7, 4 amb NaOH. Es va utilitzar solució salina estèril (0, 9% NaCl) com a control del vehicle. Aquestes substàncies es van injectar bilateralment a una velocitat de 0,1 ul/min i un volum de 0,5 ul per lloc a les següents coordenades estereotàxiques extretes de l'atles Paxinos i Watson [26], amb el camp cortical Te2 referit a l'atles de Zilles [25]:

Escorça auditiva secundària (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Escorça cingulada anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

El volum d'injecció (0.5 ul per lloc) es va seleccionar a partir d'estudis anteriors on es van injectar compostos actius en Te2 [10,34] i ACC [55,63] en rates adultes.

Per inactivar l'hipocamp dorsal, es van injectar compostos actius a un volum de 0,6 ul per lloc a les coordenades estereotàxiques següents:

Hipocamp dorsal: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Les lesions irreversibles de l'hipocamp dorsal es van induir administrant NMDA (Tocris, 18 ug/ul, dissolt en solució salina estèril, 0,4 ul per lloc) a una velocitat de 0,1 ul/ min en els punts de les coordenades esmentades. Es van utilitzar les mateixes coordenades per a controls injectats amb solució salina i animals operats per simulació.

Red Retrobeads (Lumafluor, dilució 1:2 en solució salina, 0.6 ul) es van injectar en BLA segons les coordenades següents: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

Al final dels experiments, es van comprovar histològicament les traces de l'agulla en el cas de les injeccions de CNQX, anisomicina o solució salina o l'extensió de les lesions en el cas de les injeccions de NMDA. Les rates van ser profundament anestesiades i perfoses intracardialment amb formaldehid al 4%. Els seus cervells es van seccionar a 30 μm en un criostat. Les seccions en sèrie tenyides de Nissl es van preparar mitjançant el procediment convencional i les seccions es van verificar histològicament amb un microscopi ampliat a 2, 5 ×.

Experiments optogenètics

Injecció de virus. El virus adenoassociat AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cirera i el vector de control AAV5:CaMKII -cherry es van obtenir de la Universitat de Carolina del Nord Vector Core (Chapel Hill, Carolina del Nord, Estats Units d'Amèrica). La frase Viraltiter era 5:8 El títol viral era de 5,8 × 10^12 vg/ml per als dos virus. L'ús del promotor CaMKII permet l'expressió transgènica afavorint les neurones piramidals. Els virus es van allotjar en un congelador a −80˚C. Les infusions víriques dirigides al Te2 o l'ACC es van realitzar a les coordenades estereotàxiques anteriors als volums de 0,5 ul per a cada forat. El virus es va injectar a una velocitat de 0,1 ul/min i l'agulla es va deixar al seu lloc durant 5 minuts addicionals. Les injeccions virals es van realitzar 4 setmanes abans dels experiments d'optogenètica.

Il·luminació.

Les fibres òptiques (Plexon, nucli de 200/230 μm; 10 mm de longitud) es van implantar bilateralment al BLA (AP=-2,8, L=± 5,4, V=-8,2 mm). de bregma). La inhibició optogenètica de les projeccions de Te2 a BLA o de les projeccions d'ACC a BLA es va obtenir mitjançant el sistema d'estimulació optogenètica PlexBright acoblat a un díode làser (Laserglow Technologies). Es genera llum groga (589 nm) i es passa a través d'una fibra òptica. La densitat de potència estimada a la punta de la fibra òptica era de 10 a 15 mW per a la il·luminació dels llocs de projecció. Durant la retenció de la memòria de la por, l'emissió de llum es va iniciar 4 s abans de l'inici del to, va persistir durant tot el to i es va aturar 4 s després de la compensació del to. Els animals que pertanyen a grups de condicionament de la por contextual van rebre estimulació lleugera durant tota l'exploració del context (3 min). Les rates es van familiaritzar amb el cordó de connexió durant 2 dies abans de la prova de retenció de memòria.

Immunohistoquímica. Un cop finalitzats els experiments d'optogenètica, les rates es van anestesiar profundament i es van perfondre intracardialment amb un 4% de PAF per examinar la difusió del virus. Els cervells es van disseccionar, es van emmagatzemar durant la nit a 4 °C i finalment es van transferir a sacarosa al 30%. Les seccions coronals (30 μm) es van tallar en un criostat i es van recollir en PBS. Les seccions flotants es van incubar en una solució de bloqueig durant 1 h a RT. A continuació, es van incubar en anticossos monoclonals primaris de ratolí anti mCherry (dilució 1:500, Abcam) a la solució de bloqueig durant la nit a temperatura ambiente. Posteriorment, es van rentar les seccions amb PBS i es van incubar durant 1 h a RT amb un anticòs anti-ratolí AlexaFluor-568 fluorescent secundari (1:600, Invitrogen) diluït en PBS. Les seccions es van rentar amb PBS, es van muntar amb suports de muntatge que contenien DAPI (Vector) i es van col·locar la coberta.

Els cervells de rates que es van sotmetre a injeccions de NMDA es van recollir de manera similar. Les seccions flotants, després de diversos esbandits, es van incubar amb anticòs monoclonal primari anti-Neun de ratolí (1:1, dilució 000, Merck) a la solució de bloqueig durant la nit a temperatura ambient. Posteriorment, es van rentar les seccions amb PBS i es van incubar durant 1 h a temperatura ambient amb anticossos anti-ratolí de cavall biotinilat (dilució 1:200, Vector). El complex avidina-biotina (complex ABC 1:100, Vector, 2 h i meitat d'incubació) es va acoblar a diaminobenzidina (0, 03%, Merck) per tacar Neun. A continuació, es van esbandir les seccions amb PBS i es van transferir a portaobjectes recoberts de gelatina, es van deshidratar i es van cobrir amb un cobreobjectes.

Les seccions de Te2 de rates injectades amb perles retro es van sotmetre a incubació amb anticòs anti-Fos de conill policlonal primari (1:2, 000, senyalització cel·lular) a la solució de bloqueig durant la nit a RT. Posteriorment, les rodanxes es van rentar amb PBS i es van incubar durant 1 h a RT amb Alexa 488 anti-conill (1: 1, 000, Invitrogen, en PBS). Finalment, les seccions immunomarcades es van rentar en PBS, es van muntar sobre portaobjectes recoberts de gelatina i es van cobrir amb un medi de muntatge complementat amb DAPI.

Microscòpia

L'etiquetatge de mCherry es va examinar mitjançant un microscopi confocal Zeiss Airyscan: es van utilitzar dos làsers (405 i 561 nm), cadascun corresponent a l'espectre d'emissió màxima de DAPI (tinció de Nissl per a nuclis cel·lulars) i Alexa 568 (mCherry). ), respectivament. Per analitzar la difusió del virus als llocs d'injecció, es van adquirir micrografies de Te2 i ACC com a imatges de mosaic (cadascun es va adquirir mitjançant un objectiu 10 ×). Els terminals d'axons a BLA es van analitzar mitjançant un objectiu de 40 × com a pila z de 10 seccions, separades 1 μm (quadrat de 159 μm; fracció de zoom, 1, 0).

Per als animals injectats amb retrobeads que es van sotmetre a un immunomarcatge cFos, les imatges es van adquirir amb un augment de 40× (159 μm quadrat; fracció de zoom, 1.0) amb 3 làsers diferents, corresponents a l'espectre d'emissió màxima. per a DAPI (tinció de Nissl per a nuclis cel·lulars), AlexaFluor 488 (cFos) i Texas Red (Retrobeads), respectivament. Es van adquirir seccions de 0, 7 μm al llarg d'una pila z de 10- μm. Es va quantificar el nombre de nuclis que expressaven cFos, marcats amb comptes i doblement positius (marcats cFos + comptes) per a cada animal de la regió Te2 a les coordenades anteroposteriors de 6, 7 a 7, 3 mm del bregma [10]. A continuació, es van promediar les dades per produir la mitjana de cada animal i es van comparar estadísticament els resultats. Les imatges de seccions amb tinció DAB de Neun es van analitzar mitjançant el programari Neurolucida connectat a un microscopi mitjançant una càmera CCD en color [10].

Anàlisi de dades i criteris d'exclusió

La n per a cada grup es va establir a priori segons els nostres estudis anteriors [10,16,17], treballs publicats prèviament en el camp (vegeu com a referències per a ACC [6,22,55] i Te2 [10,59]), i mitjançant estimacions de potència G, segons la taula següent (Taula 1):

Per a cada anàlisi, es va estimar un nombre mitjà final de 8 a 10 animals per a cada grup. Els grups es van executar amb controls interns en la mateixa sessió experimental (taula S1). Atesa la variabilitat dels procediments quirúrgics i conductuals, hem inclòs a priori un major nombre de subjectes experimentals (fins a un 15% més) que en alguns casos complien els criteris experimentals i s'hi van incloure, evitant així una exclusió arbitrària. En el cas dels estudis d'hipocamp, per avaluar els efectes de les injeccions de NMDA i CNQX a intervals de temps diferents, vam equilibrar el nombre total d'animals de control entre rates operades amb vehicle i simulació entre els diferents grups.

L'anàlisi del comportament, les inspeccions histològiques i el recompte de cèl·lules es van realitzar a cegues. Els animals amb una localització inadequada de la pista de l'agulla o la lesió en el cas de lesions irreversibles amb NMDA van ser exclosos de l'anàlisi de dades (taula S1). En estudis farmacològics, vam excloure 57 animals sobre un total de 465 animals a causa d'una col·locació incorrecta de l'agulla (22/255 per a Te2, 31/179 per a ACC i 4/31 per a l'hipocamp). En estudis de traça, en 21 animals, vam eliminar 3 subjectes en els quals la injecció de retrobeads va perdre el BLA. En estudis d'optogenètica Te2, sobre un total de 30 animals, vam excloure 1 rata perquè la col·locació de les fibres òptiques no estava per sobre de la regió objectiu, 1 rata. Després de tot, el virus estava absent a Te2 i 2 rates perquè la difusió del virus era, respectivament, inferior al 4,7% i al 5,3% de l'àrea de Te2 als llocs d'injecció. A les rates incloses en l'anàlisi estadística, la difusió mínima del virus va ser del 39,6% a la coordenada estereotàxica més anterior i del 50,2% a la coordenada estereotàxica més posterior.

De la mateixa manera, en els experiments d'optogenètica ACC, en un total de 32 animals, es van eliminar 2 rates perquè la col·locació de fibres òptiques no estava per sobre de la regió objectiu. Es van excloure dues rates perquè el virus a l'ACC estava absent, 1 animal perquè el virus es trobava a l'escorça motora secundària adjacent i 1 rata perquè la difusió del virus era inferior al 2,3% de l'àrea de l'ACC als llocs d'injecció. A les rates restants, la difusió mínima del virus va ser del 33,3% a la coordenada estereotàxica més anterior i del 42,2% a la coordenada més posterior.

En els estudis de lesions NMDA, les lesions es van dirigir principalment a la regió CA1 de l'hipocamp dorsal. L'extensió mínima (vermell) i màxima (rosa) de les lesions de l'hipocamp a tota l'àrea de l'hipocamp dorsal van ser respectivament del 23,2% i del 53,5% a la coordenada estereotàxica més anterior i del 28,3% i del 62,3% a la coordenada més posterior. En un total de 73 animals, es van eliminar 4 rates perquè la lesió estava absent, mentre que 3 animals addicionals es van descartar perquè l'extensió de les lesions era inferior al 5,0% (és a dir, 4,8%, 4,3%, 3,1). %) sobre la zona de l'hipocamp a les 2 coordenades.

L'anàlisi del contorn de l'àrea es va realitzar mitjançant inspecció visual i quantificació manual mitjançant l'eina de contorn de regió del programari ZEN 3.0. A continuació, es van normalitzar els valors de l'àrea sobre l'àrea total de la regió. Les coordenades estereotàxiques de Te2, ACC i hipocamp es van basar en l'atles de Paxinos [26] i, en el cas de Te2, amb el camp cortical arbitrat a l'atles de Zilles [25].

Anàlisi estadística

Totes les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Totes les dades van passar la prova de Levene per a la igualtat de variàncies. Per tant, es van utilitzar estadístiques paramètriques al llarg de tots els experiments. Les dades de 2 grups es van comparar mitjançant 2-proves t de Student no aparellades amb cua. Les comparacions de diversos grups es van avaluar mitjançant una prova ANOVA de 1-via amb la prova post hoc de Tukey. Per abordar les diferències entre i dins dels grups, vam calcular un model ANOVA de disseny mixt 3 × 2 amb un grup (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) com a entre- variable subjectes i condició (abans i després del condicionament recent +injecció) com a variable dins dels subjectes. Quan la interacció grup × condició era significativa, vam realitzar una anàlisi senzilla dels efectes principals i vam ajustar cada valor p amb la correcció de Bonferroni. Per a cada model ANOVA mixt, vam avaluar la hipòtesi d'esfericitat mitjançant la prova d'esfericitat de Mauchly.

Els paràmetres estadístics (és a dir, el valor exacte de n per a cada grup, SEM, la prova estadística, la mida de l'efecte i el valor p exacte) s'informa a les llegendes. Per a mides de mostra iguals, les mides d'efectes per a proves t no aparellades es van determinar calculant la d de Cohen o la d de Glass segons la similitud dels SD, mentre que, per a diferents mides de mostra, Hedges'g. Les correlacions entre el recompte de cèl·lules i la congelació es van calcular mitjançant el coeficient de Pearson. Per determinar si les dades complien els supòsits de l'enfocament estadístic, vam rebutjar la hipòtesi nul·la al nivell P <0.05. Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant SPSS Statistics 22 (IBM).

Informació de suport

S1 Fig. Ampliació de les pistes de l'agulla de Te2 (A) i de l'escorça ACC (B) injectades amb CNQX, seleccionades com a exemples. (C) Quan es van representar amb el mateix context 2 setmanes després del procediment, els animals només amb xoc van mostrar una resposta de por baixa, demostrant que el procediment no va provocar una congelació condicionada en el context on es va lliurar el xoc. (D) Es van obtenir resultats similars als de la figura 1 compensant els 2 tons emprats com a CS (CS1, 3 kHz i CS2, 15 kHz) (Prova t de l'estudiant, t(14)=3.44, p {{{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) A les rates condicionades amb olor-CS que es congelaven a l'olor, 2 setmanes després del condicionament, era alta fins i tot si es provava en un entorn diferent pel que fa al context del condicionament, demostrant així que la por estava associada específicament amb aquest lliurament de senyals. Barres d'escala, 300 μm. ��P <0,01. Totes les dades són mitjanes i SEM. Les dades de resum de S1 Fig es poden trobar a la informació de suport al fitxer anomenat S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. La injecció de CNQX va afectar la retenció de records auditius recents de la por en rates on la generalització de la por es va reduir per un sol to pre-exposició o mitjançant l'ús d'un to de soroll blanc com CS1. Un ANOVA de disseny mixt de 3 × 2 (efecte principal del grup: F(2,42)=6.478, p {{1{0}}.00 4, η2=0. 236, efecte principal de la condició: F(1,42)=0,161, p=0,691, η2=0,004, grup × la interacció de condicions F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) va mostrar que la congelació al to de 3 kHz abans de la seva associació als EUA era menor en animals que van rebre la preexposició del to de 15 kHz abans de l'aparellament de 15 kHz-EUA (n=10, p=0,001) o en rates condicionades a un soroll blanc (n=13 , p=0,008) en comparació amb els animals CS1-CS2 (n=22) que van mostrar una resposta variable de generalització de la por. Tanmateix, després de l'aprenentatge de CS-US i les injeccions de cnqx a l'escorça Te2, la memòria de la por recent es va veure afectada en tots els grups (p> 0, 05). Efecte principal simple dins dels grups (abans i després de l'aprenentatge de CS-US seguit d'injecció de cnqx): CS1-CS2, p=0,025; Ton-CS1-CS2, pàg=0.189; WN-CS2, p=0,347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Totes les dades són mitjanes i SEM. Les dades de resum de S2 Fig es poden trobar a la informació de suport al fitxer anomenat Dades de la figura de suport S1. (TIF)

S3 Fig. (A) Exemple aleatori d'injecció de retrobeads dirigida a BLA. (B i C) Exemples de col·locacions de fibres òptiques per sobre del BLA d'animals injectats amb vectors AAV a Te2 (B) i còrtex ACC (C). Barres d'escala, 500 μm.

Agraïments

Agraïm al Dr. E. Manassaro el seu suport i assessorament continus.

Aportacions de l'autor

Conceptualització: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Comissariat de dades: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Anàlisi formal: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Adquisició de finançament: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Investigació: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologia: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Supervisió: Benedetto Sacchetti.

Validació: Benedetto Sacchetti.

Redacció – esborrany original: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Redacció – ressenya i edició: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referències
1. Frankland PW, Bontempi B. The organization of recent and remote memories. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. La neurobiologia de les consolidacions, o, com d'estable és l'engrama? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Consolidació de la memòria. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Álvarez P, Escuder LR. Consolidació de la memòria i lòbul temporal medial: un model de xarxa senzill. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Per què hi ha sistemes d'aprenentatge complementaris a l'hipocamp i al neocòrtex: visió dels èxits i fracassos dels models connectistes d'aprenentatge i memòria. Psychol Rev 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com