Marcadors de qualitat de Cistanches Herba basats en la relació espectre-efecte antioxidant

Resum

Objectiu: Establir un mètode d'investigació dels marcadors de qualitat (Q-markers) deCistanches Herba(CH) basat en elrelació espectre-efecte antioxidant, proporcionant una base per a l'estudi de les seves substàncies farmacològiques i el control de qualitat. Mètodes: es va utilitzar cromatografia líquida d'ultra-alt rendiment (UPLC) per establir perfils d'empremtes digitals per a 10 lots de CH. Es va establir un model de dany oxidatiu cel·lular utilitzant H2O2, i es va determinar la capacitat antioxidant de CH a partir de la concentració inhibidora mitja màxima d'espècies reactives d'oxigen, així com els nivells de superoxidedismutasa i catalasa com a indicadors farmacològics. La relació espectre-efecte es va construir mitjançant l'anàlisi de components principals, l'anàlisi de correlació de Pearson i l'anàlisi de regressió parcial de mínims quadrats. Els components actius es van sotmetre a validació farmacològica. Resultats: es van establir perfils d'empremtes digitals per a CH mitjançant UPLC, identificant 17 pics comuns. A partir de l'anàlisi de correlació espectre-efecte, es van seleccionar nou components. Els resultats de la validació farmacològica van indicar que l'àcid genipòdic, 8-àcid epilogànic,equinacòsid, acteòsid,isoacteòsid, itubulósida Ava mostrar activitat antioxidant de manera dependent de la concentració. Conclusió: aquest estudi va explorar els marcadors Q per a CH basats en la relació espectre-efecte, proporcionant informació de referència per a la seva base de substàncies farmacològiques i la millora de l'estàndard de qualitat.

Paraules clau:Cistanches Herba; marcador Q;relació espectre-efecte; antioxidant

EXTRACTE DE CISTANCHE ORGANIC AMB 30% ECHINACOSIDE I 12% ACTEOSIDE PER A LA FUNCIÓ RENOLÓ

Cistancheés la tija carnosa seca amb fulles escamoses de Cistanche deserticola YCMa o Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, una planta que pertany al gènere Cistanche de la família de les Orobanchiaceae. Es va registrar per primera vegada a la "Matèria mèdica de Shen Nong" i figura com a grau superior [1]. És de naturalesa càlida, de gust dolç i salat; torna als meridians del ronyó i l'intestí gros; té els efectes de nodrir el yang del ronyó, reomplir l'essència i la sang, humitejar els intestins i laxant, i és un medicament important per tonificar el ronyó i reposar l'essència [2-3]. Els ronyons emmagatzemen l'essència, i l'essència i la sang provenen de la mateixa font. Si l'essència i la sang són deficients, afectarà les activitats generals de la vida del cos humà; la medul·la que produeix l'essència s'emmagatzema als ossos, i el cervell és el mar de la medul·la. Si l'essència del ronyó és insuficient, els ossos perdran la seva alimentació i el cervell serà deficient, donant lloc a canvis degeneratius ossis com ara textura fluixa, pèrdua de dents, pèrdua de memòria, demència i disminució de la funció immune [4-6]. Cistanche deserticola conté glicòsids de feniletanol, iridoides, lignans i altres components estructurals, com ara l'echinaceaside, el verbascòsid, l'isorbascòsid, l'àcid genipínic i l'àcid 8-epistriànic. , tubulina A, etc. [7]. El control de qualitat actual de Cistanche deserticola a l'edició 2020 de la "Farmacopea de la República Popular de la Xina" només estipula el contingut d'echinaceaside i verbascoside, que no pot reflectir completament les característiques d'acció multicomponent i multi-objectiu de la medicina tradicional xinesa. , que no afavoreix el seu control i avaluació de qualitat.

Per tal de millorar el nivell de control de qualitat de la medicina tradicional xinesa i optimitzar l'avaluació de la qualitat de la medicina tradicional xinesa, l'acadèmic Liu Changxiao va proposar el nou concepte de marcador de qualitat (marcador Q) de la medicina tradicional xinesa [8]. Entre ells, "l'eficàcia" és l'element central dels "Cinc principis" del marcador Q [9] i també és el nucli de l'avaluació de la qualitat de les medicines tradicionals xineses.

Tenint en compte l'estat actual de la investigació de la mala correlació entre els estàndards de qualitat i l'eficàcia dels medicaments, explorar els marcadors Q de les medicines tradicionals xineses i establir estàndards de qualitat més científics i raonables és de gran importància per millorar la qualitat de les medicines tradicionals xineses. La relació espectre-efecte és enllaçar els pics cromatogràfics de les empremtes digitals de la medicina tradicional xinesa amb dades farmacodinàmiques específiques per trobar les substàncies efectives de la medicina tradicional xinesa, reflectint així la qualitat inherent de la medicina tradicional xinesa [10]. L'establiment d'un model matemàtic d'eficiència espectral pot aclarir el QMarker de la medicina tradicional xinesa des d'una perspectiva de "visió holística", proporcionant més referència per al control de qualitat posterior de la medicina tradicional xinesa, la formulació d'estàndards de qualitat i el cribratge d'ingredients actius. Aquest estudi utilitza empremtes dactilars combinades amb la taxa de mitja inhibició de les espècies reactives d'oxigen (ROS IC50), el contingut de superòxid dismutasa (SOD) i catalasa (CAT) per estudiar la relació espectre-efecte de la medicina tradicional xinesa i utilitza l'anàlisi de components principals. (PCA) ), anàlisi de correlació de Pearson (PCC) i anàlisi de regressió de mínims quadrats parcials (PLS) per analitzar exhaustivament el marcador Q de Cistanche deserticola per proporcionar una base per al seu control de qualitat.

1 material

1.1 Mostra

Cistanche deserticolaes va collir al comtat de Yutian, Xinjiang i la base de plantació de Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) a Mongòlia Interior. Va ser identificat per l'investigador Zhang Tiejun de Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. com Cistanche tubulosa (Schenk) Wight i Cistanche deserticola.

YC Ma, la informació detallada es mostra a la taula 1.

1.2 Prova de medicina

L'echinaceaside (número de lot: 111670-201907, puresa: 91,8%) i el verbascòsid (número de lot: 111530-201914, puresa: 95,2%) es van comprar a l'Institut de control d'aliments i drogues de la Xina; isorescòsid (número de lot: 61303-13 -7), salidroside (número de lot: 10338-51-9), 8-àcid epistricnoic (número de lot: 82509-41-9), àcid genipínic (número de lot: Z24A10X95926) , tuberosina B (número de lot: 112516-04-08), 2-acetil eugenol glicòsid (número de lot: 94492-24-7) es van comprar a Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., puresa superior o igual a 98%; El glucòsid A de Cistanche (número de lot: MUST -20062806, puresa: 98,51%) i la vasculina A (número de lot: MUST19110102, puresa: 98,57%) es van comprar a Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; L'acetonitril cromatogràficament pur i l'àcid fòrmic es van comprar a Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Aigua purificada (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamina E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

Dimetil sulfòxid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, EUA); Kit de detecció de proliferació cel·lular d'una solució CellTiter 96® AQueous (G3580, Promega Company, EUA); El kit de detecció CAT (S0051), el kit de detecció d'activitat SOD S0101M) i el kit de detecció ROS (S0033S) es van comprar a Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instruments

Cromatògraf líquid d'ultraalt rendiment Waters H-class-PDA (Waters Company, EUA); Balança electrònica Sartorius BT25S (Sartorius Company, Alemanya); Centrífuga d'escriptori d'alta velocitat H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Lector de microplaques (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Microscopi biològic WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 cèl·lules

Cèl·lules renals embrionàries humanes Les cèl·lules HEK 293 es van utilitzar en aquest experiment i es van comprar al banc de cèl·lules de l'Acadèmia Xinesa de Ciències.

2 mètodes

2.1 Establiment del mapa d'empremtes dactilars

2.1.1 Preparació de la solució d'assaig: Peseu 2 g de material medicinal Cistanche deserticola, afegiu 10 vegades la quantitat d'aigua, escalfeu i reflux 3 vegades, 1 h cada vegada, centrifugueu a 1.0 ×105r·min-1 durant 15 min (el radi centrífug és de 300 mm), combineu els sobrenedants i concentreu-los per fer una solució de reserva amb una concentració en massa de 100 mg·mL-1, diluïu-la 10 vegades, i filtrar-lo a través d'una membrana de filtre microporosa de 0,22 µm per obtenir-lo.

2.1.2 Preparació de la solució de referència mixta

Preneu 8-àcid epistrícnic, salidroside, echinaceaside, cistanche glicòsid A, àcid genipínic, verbascòsid, antocianòsid A, isorbascòsid i 2'-acetil eugenol. La substància de referència de glicòsid i angiosid B es va mesurar en quantitats adequades i es va pesar amb precisió. Afegiu una solució de metanol al 50% per dissoldre i prepareu una solució de substància de referència mixta amb una concentració en massa de 20 µg·mL–1.

2.1.3 Condicions cromatogràfiques

Columna ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); la fase mòbil és acetonitril (A) ~ 0.1% solució d'àcid fòrmic (B), programa d'elució en gradient (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A; 6~10 min, 8% ~ 15%A 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); la longitud d'ona de detecció és de 237 nm; el cabal és de 0,4 mL·min –1; la temperatura de la columna és de 40 graus; el volum d'injecció és de 3 µl.

2.1.4 Selecció del pic de referència

En el cromatograma de cromatografia líquida d'ultra rendiment (UPLC) de Cistanche deserticola, es va seleccionar com a pic de referència de l'espectre de l'empremta digital el pic amb la proporció d'àrea màxima més gran, un temps de retenció moderat i una bona separació.

2.1.5 Revisió metodològica

Prova de precisió: agafeu la mostra T1 i prepareu la solució de prova segons el mètode de 2.1.1. Injecteu la mostra 6 vegades contínuament i registreu l'empremta digital. Els resultats mostren que l'àrea de pic relativa RSD de cada pic és de 0,10% ~ 4,61%, i el temps de retenció relatiu RSD és de 0,08% ~ 1,32%, cosa que indica que l'instrument té una bona qualitat. precisió.

Prova de repetibilitat: agafeu la mostra T1 i prepareu 6 mostres de la solució de prova en paral·lel segons el mètode de l'apartat 2.1.1, i injecteu la mostra contínuament. Els resultats mostren que l'àrea de pic relativa RSD de cada pic cromatogràfic és de l'1,35% ~ 4,80%, i el temps de retenció relatiu RSD és del 0,10% ~ 1,80%, que compleix els requisits de l'empremta digital i demostra que la repetibilitat de l'instrument és bo.

Prova d'estabilitat: agafeu la mostra T1 i prepareu la solució de prova segons el mètode indicat en 2.1.1, injecteu mostres per a la prova a les 0, 2, 4, 8 i 12 hores i registreu l'empremta digital. La RSD calculada de l'àrea relativa del pic de cada pic cromatogràfic és 0,53%~4,82%, i la RSD del temps de retenció relatiu és 0,09%~2,17%, que compleix els requisits de l'empremta digital i indica que el producte de prova és estable en 12 hores.

2.2 Investigació sobre l'efecte antioxidant de Cistanche deserticola

2.2.1 Elaboració del licor mare Cistanche deserticola

Agafeu el licor mare del punt 2.1.1, filtreu-lo i esterilitzeu-lo, i diluïu-lo amb medi de cultiu a la concentració requerida abans d'utilitzar-lo.

2.2.2 Cistanche deserticola i control positiu

L'efecte de VE sobre la viabilitat de les cèl·lules HEK 293 es va establir com a grup normal (suspensió cel·lular), grup d'administració de Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), grup VE (20, 40, 60). , 80, 100 µmol·L–1), establiu 6 pous duplicats per a cada concentració, cultiu durant 24 h, afegiu 20 µl de reactiu de solució única CellTiter 96® AQueous a cada pou per detectar la viabilitat cel·lular, continueu cultivant durant 2 h, i utilitzeu un lector de microplaques per detectar la viabilitat cel·lular a 490 nm El valor d'absorbància (OD) de cada pou es va utilitzar per calcular la taxa de supervivència cel·lular segons la fórmula (1). Taxa de supervivència (%)=(grup experimental OD/grup en blanc OD) × 100% (1)

2.2.3 Cistanche deserticola sobre inducció de H2O2

Efecte de ROS sobre les cèl·lules HEK 293. Les cèl·lules es van dividir en grup normal (suspensió cel·lular) i grup d'administració de Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola i 60 µm·L–1 H2O2) i es van cultivar 24h. Seguiu els passos del kit de detecció de ROS per a operacions posteriors, observeu directament la tinció cel·lular a través d'un microscopi i utilitzeu un lector de microplaques per detectar la intensitat de fluorescència de cada grup. La configuració dels paràmetres utilitzava una longitud d'ona d'excitació de 488 nm i una longitud d'ona d'emissió de 525 nm. L'experiment es va repetir tres vegades.

2.2.4 Parell de Cistanche deserticola

Efecte de l'H2O2 sobre la SOD a les cèl·lules HEK 293. Les cèl·lules es van dividir en grup normal (suspensió cel·lular), grup model (60 µm·L–1 H2O2), grup VE (60 µm·L–1 VE i 60 µm·L–1 H2O2), grup d'administració de Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola i 60 µm·L–1 H2O2), recollir les cèl·lules després de 24 h de cultiu, afegir una solució de preparació de mostres de SOD per lisar les cèl·lules i centrifugar a 4 graus i 12.000 r·min {{22} } min (el radi de centrifugació és de 300 mm), agafeu el sobrenedant com a mostra a provar i seguiu els passos del kit de detecció de SOD per a les operacions posteriors. L'experiment es va repetir tres vegades.

2.2.5 Cistanche deserticola sobre inducció de H2O2

Els efectes de la CAT a les cèl·lules HEK 293 es van tractar segons el mètode de 2.2.4 i es van agrupar en grups. Després del tractament, afegiu la solució de lisi, centrifugueu a 4 graus i 12000 r·min-1 durant 10 min (el radi centrífug és de 300 mm), agafeu el sobrenedant i seguiu els passos del kit de detecció CAT per a les operacions posteriors. . L'experiment es va repetir tres vegades.

2.2.6 Anàlisi estadística

Es va utilitzar el programari SPSS 26.0 per a l'anàlisi estadística. Cada grup de dades estava representat per (±±(). Es va realitzar una anàlisi unidireccional de la variància sobre les dades que s'ajustaven a la distribució normal. Si les variàncies eren iguals, s'utilitzava el mètode de la diferència menys significativa. Si les variàncies eren desigual, es va utilitzar el mètode T3 de Dunnett per fer gràfics GraphPad Prism 8 i P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Anàlisi de correlació espectre-efecte de l'antioxidant Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Les àrees pics dels pics comuns d'10 lots de Cistanche deserticola que han establert empremtes dactilars es van normalitzar pel valor Z i es van convertir en una matriu de dades d'ordre de 10 × 17, que es va importar al programari SPSS 26.0 per a PCA.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 es va utilitzar per realitzar anàlisis bivariades per estudiar la relació d'eficiència espectral entre les empremtes dactilars de Cistanche deserticola i els antioxidants. Les proves de significació es van realitzar mitjançant una prova de dues cares (T), amb P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Importeu els resultats experimentals de l'àrea de pic estandarditzada de Cistanche deserticola i l'antioxidant al programari SIMCA-P 14.1, configureu l'àrea de pic com a variable X i configureu l'índex farmacodinàmic com a variable Y per realitzar PLS.

2.4 Verificació de l'activitat antioxidant del marcador Q de Cistanche deserticola

2.4.1 Preparació de la solució mare de principis actius. Peseu amb precisió les quantitats adequades d'àcid genipínic, 8-àcid epistricnic, echinaceaside, verbascòsid, isorebascòsid i antocianòsid A, i afegiu DMSO per dissoldre'ls en una solució de referència de 10 mmol·L-1.

2.4.2 Efecte dels ingredients actius sobre la citotoxicitat de HEK 293.

Després d'incubar les cèl·lules HEK 293 durant 24 hores, afegiu diferents concentracions de solucions d'ingredient actiu sota 2.4.1 a cada pou (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1). ) 100 µL, estimulació contínua

Després d'incubar les cèl·lules durant 24 hores, es va afegir un reactiu de solució única CellTiter 96® AQueous per detectar la viabilitat cel·lular.

2.4.3 L'efecte de dany antioxidant dels ingredients actius a les cèl·lules HEK 293 induïdes per H2O2-.

Les cel·les s'agrupen de la següent manera: el grup normal, el grup model i el grup VE s'agrupen segons 2.2.4. Grup experimental (0,781, 1,563, 3,125 µm·L–1 composició d'activitat i 60 µm·L–1 H2O2), cultivat durant 24 h. Determineu els nivells intracel·lulars de ROS, els continguts d'enzims SOD i CAT segons els mètodes de 2.2.3, 2.2.4 i 2.2.5 respectivament.

Servei de Suport de Wecistanche

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop