La quercetina atenua les alteracions oxidatives del cervell induïdes per nanopartícules d'òxid de ferro en rates

Contacte:tina.xiang@wecistanche.comper a més detalls

Resum: La teràpia amb nanopartícules d'òxid de ferro (IONP) té diversos beneficis per a la salut, però les dosis altes o la teràpia prolongada poden induir lesions cel·lulars oxidatives, especialment al cervell. Per tant, hem dut a terme l'estudi actual per investigar el paper protector dequercetinasuplementació contra les alteracions oxidatives induïdes al cervell de rates a causa dels IONP. Es van assignar quaranta rates albines mascles adultes en cinc grups iguals; el control va rebre una dieta basal normal, el grup IONP es va injectar intraperitonealment amb IONPs de 50 mg/kg de pes corporal (BW) i els grups tractats amb quercetina tenien IONPs més Q25, IONPs més Q50 i IONPs més Q100 que van ser suplantats per via oral amb quercetina. mitjançant dosis de 25, 50 i 100 mg de quercetina/kg de peso corporal al dia, respectivament, administrades amb la mateixa dosi d'IONP durant 30 dies. Els IONP van induir augments significatius del malondialdehid (MDA) i van disminuir significativament el glutatió reduït (GSH) i el glutatió oxidat (GSSG). En conseqüència, els IONP van induir significativament lesions greus del teixit cerebral a causa de la deposició de ferro que van provocar alteracions oxidatives amb augments significatius de la creatina fosfocinasa (CPK) i acetilcolinesterasa (AChE). A més, els IONP van induir reduccions significatives de l'adrenalina cerebral, la serotonina i la melatonina amb la regulació a la baixa del coactivador gamma 1-alfa (PGC-1a) activat pel proliferador de peroxisomes i el factor de transcripció mitocondrial A (mtTFA)mRNA. expressions. Els IONP van induir l'apoptosi al cervell supervisada per augments de la caspasa 3 i disminucions dels nivells d'expressió del limfoma 2 (Bcl2) de cèl·lules B. La suplementació de quercetina va derrotar notablement el cervelldanys oxidatiusde manera dependent de la dosi. Per tant, la suplementació amb quercetina durant les IONP és molt recomanable per obtenir els beneficis dels IONP amb menys perills per a la salut.

Paraules clau: nanopartícules d'òxid de ferro; estrès oxidatiu; quercetina; antioxidant

1. Introducció

Les nanopartícules d'òxid de ferro (IONP) s'utilitzen per a l'orientació de fàrmacs, el lliurament de gens, l'etiquetatge cel·lular, un agent de contrast en la imatge de ressonància magnètica i la teràpia d'hipertèrmia [1]. També s'utilitza com a additiu alimentari en begudes fortificades amb ferro i cereals per al consum humà [2], a més de nombrosos usos industrials en el tractament d'aigües residuals, detecció de gasos i lubricacions, pigments i recobriments de sorbents semiconductors [3]. Tanmateix, l'ús divers dels IONP indueix la sobrecàrrega de ferro i la posterior iniciació de l'estrès oxidatiu en diversos òrgans [4]. La ingestió, la inhalació i la penetració dèrmica són les principals vies d'entrada d'IONPs[5]. Al torrent sanguini, els IONP s'uneixen a proteïnes plasmàtiques i es distribueixen en diferents òrgans

òrgans com el fetge, la melsa, el ronyó, el pulmó i el cor, i penetren la barrera hematoencefàlica (BHE), induint lesions oxidatives [6,7]. Els ferros alliberats dels IONP que provoquen la generació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) provoquen alteracions oxidatives greus en lípids, proteïnes i ADN [8,9].

Quercetina(3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona) és aflavonoidepresent en fruites (pomes, baies, cireres i raïm vermell) i verdures (ceba i bròquil) a més de moltes llavors, blat sarraí, fruits secs, flors, escorces, te verd i oli d'oliva[10]. La quercetina té molts efectes valuosos que inclouen efectes antiinflamatoris, antioxidants, antimutagènics, antiisquèmics, antivirals i antienvelliment [11-17]. La quercetina és lipòfila i pot penetrar la barrera hematoencefàlica (BHE)[18]. A més, la quercetina presenta un paper antioxidant potencial mitjançant la millora del glutatió reduït (GSH) i la regulació de la superòxid dismutasa de coure-zinc (SOD1)[17]. La quercetina pot quelar el ferro, inhibint la reacció de Fenton i inhibint la generació de ROS [19]. En conseqüència, la quercetina és un potencial terapèutic per a múltiples malalties neurodegeneratives i lesions neuronals [20]. ElantioxidantEl potencial de la quercetina ens va animar a dur a terme el present estudi per investigar el potencial protector de la quercetina contra les alteracions oxidatives induïdes per les IONP als teixits cerebrals.

Feu clic per obtenir més informació sobre els productes

2. Resultats

2.1.Dimensió i càrrega dels IONP

Una imatge SEM d'IONPs, tal com es mostra a la figura 1, va revelar una forma esfèrica amb una mida mitjana de 16, 34-22, 88 nm mentre posseïa un valor potencial zeta positiu més 22, 8 mV (figura 2).

2.2. Estrès oxidatiu cerebral i estat anti-oxidant

Els nivells del producte de peroxidació lipídica malondialdehid (MDA) van augmentar significativament al grup IONPs (p<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">

Els nivells de GSH en l'homogeneïtat cerebral es van reduir significativament en els IONPs (p<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">

Els nivells de glutatió oxidat (GSSG) van augmentar significativament als IONPs (p<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">

A partir de les dades de GSH i GSSG, els valors de la relació GSH/GSSG es van reduir significativament en IONPs (p<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>

2.3. Activitats de la creatina fosfocinasa (CPK) i l'acetilcolinesterasa (AChE) del cervell

Les activitats de CPK van augmentar significativament als IONP (pàg<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>

A la figura 4B, les activitats d'AChE van augmentar significativament als IONPs (p<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">

2.4.Hormones cerebrals d'epinefrina, serotonina i melatonina

Els nivells d'epinefrina en homogeneïtats cerebrals es van reduir significativament en IONPs (p<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">

Com es pot veure a la figura 4D, els nivells de serotonina es van reduir significativament en els IONP (p<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">

Els nivells de melatonina en homogeneïtats cerebrals es van reduir significativament en IONPs (p<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">

2.5. Expressió d'ARNm de PGC-1a i mtTFA del cervell

Els canvis en el plec d'expressió de l'ARNm del coactivador gamma 1-alfa (PGC-1a) activat pel proliferador de peroxisomes es van reduir significativament en els IONPs (p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">

En IONPs (pàg<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">

2.6. Avaluació de la tinció d'hematoxilina (H) i eosina (E) de seccions cerebrals

Les avaluacions histològiques del teixit cerebral van revelar que el grup de control mostrava una estructura histològica normal de les capes del cerebel (figura 6A). Al grup IONP, el cerebel va mostrar un esgotament greu de la capa de cèl·lules de Purkinje (figura 6B) mentre aquest esgotament de la cèl·lula de Purkinje La capa deguda als IONPs es va alleujar als grups IONPs més Q25 (figura 6C), IONPs més Q50 (figura 6D) i IONPs més Q100 (figura 6E) de manera dependent de la dosi.

Les rates del grup control mostraven una estructura histològica normal de les meninges i l'escorça cerebral (Esquema 1A), mentre que les meninges de rates tractades amb IONPs mostraven congestió dels vasos sanguinis submeníngeos (Esquema 1B). En els grups IONP, el cervell del cervell de les rates van mostrar satellitosi, neuronofàgia (Esquema 1C), gliosi (Esquema 1D) i espongiosi (Esquema 1E), a més de la congestió del plexe coroide (Esquema 1F).

Com es pot veure a l'Esquema iF, el cervell de les rates del grup IONPs més Q25 mostrava espongiosi (fletxes curtes) i congestió dels vasos sanguinis submeníngeos. A més, el cervell de les rates del grup IONPs més Q50 va mostrar una espongiosi lleu i una congestió dels vasos sanguinis (esquema 1H). El cervell de les rates del grup IONPs més Q100 va mostrar una estructura histològica relativament normal de les meninges i l'escorça cerebral (Esquema 1I).

2.7. Avaluació de la tinció de blau de Prússia de seccions cerebrals

Les seccions cerebrals del grup control van mostrar una tinció negativa de blau de Prussia (figura 7A). Al grup IONPs, es van reconèixer taques de tinció de blau prussià a les seccions del cervell (figura 7B). Per contra, la intensitat de les taques de tinció de blau prussià de les seccions del grup IONPs es va atenuar per la quercetina als grups IONPs més Q25 (Figura 7C), IONPs més Q50 (Figura 7D) i IONPs més Q100 (Figura 7E) en un manera dependent de la dosi.

2.8. Nivells de proteïnes de caspasa 3 i Bcl2 a les seccions del cervell

El grup control va mostrar una expressió negativa dels nivells de proteïna de la caspasa 3 (figura 8A), mentre que estaven molt expressats en IONPs (figura 8B).Tractat amb quercetinaels grups (figura 8C-E) van mostrar una expressió baixa de la caspasa 3 en comparació amb les IONP. Per contra, Bcl2 es va expressar significativament en IONPs més Q25 (Figura 9C), IONPs més Q50 (Figura 9D) i IONPs més Q100 (Figura 9E) en comparació amb IONPs (Figura 9B) i el grup control (Figura 9A).

3. Discussió

L'exposició a IONP va provocar ferro i la seva deposició en teixits tous, especialment al cervell [21]. En el present estudi, vam reconèixer la deposició de ferro al cervell evidenciada per la tinció de blau de Prussia i les alteracions de la morfologia controlades per l'avaluació de la tinció H i E. Dhakshinamoorthy et al. [22] va demostrar que el contingut de ferro va augmentar significativament al teixit cerebral dels grups tractats amb IONP en comparació amb el control. Això es va avaluar mitjançant la tinció de blau de Prussia de les regions del cervell i es va evidenciar per taques blaves a l'escorça frontal, l'hipocamp i el cerebel. El-Sayed et al. [23] també va declarar augments significatius dels nivells de ferro al teixit cerebral a causa de l'administració d'IONP a rates.

Els IONP podrien tenir més capacitat per penetrar a la BBB i induir lesions de cèl·lules cerebrals que altres cèl·lules d'òrgans [24, 25]. Una altra explicació pot ser l'augment dels nivells de ferro

al cervell a causa de la unió del ferro a la transferrina desencadena la regulació positiva dels receptors de ferro al cervell i, en conseqüència, transporta ferro a través de la BBB [26].

Els feions lliures reaccionen amb H2O2 per generar ROS en el procés de reacció de Fenton [27]. El ROS elevat va augmentar la permeabilitat de la membrana mitocondrial externa, la peroxidació lipídica, el dany proteic i la cadena d'ADN es va trencar [28]. Elestrès oxidatiude la ROS va provocar augments dels nivells cerebrals del producte de peroxidació lipídica, MDA, tal com s'indica a l'estudi actual en rates tractades amb IONP. De la mateixa manera, Dhakshinamoorthy et al, [22] van informar d'augments significatius dels nivells de MDA als teixits cerebrals de ratolins tractats amb IONP. Reddy et al.[26] també va afirmar que els nivells de MDA van augmentar significativament en el teixit cerebral en una dosi alta, però un augment no significatiu en una dosi baixa en rates tractades amb IONP. Gaharwar i Paulraj [5] van revelar que els nivells de MDA estaven significativament elevats en rates tractades amb IONP. De la mateixa manera, els IONP van induir la lesió oxidativa dels cardiomiòcits controlats per una alta producció de MDA i una disminució de les concentracions de GSH [29].

Els autors de diversos estudis han investigat l'efecte protector dels productes naturals o els seus extractes contra els efectes secundaris associats als IONP, inclosos els extractes d'Echinacea purpurea [30] i Antlriscus sulvestris [31]. En l'estudi actual, hem investigat el paper protector de la quercetina contra la toxicitat dels IONP en el cervell de rates. La suplementació de quercetina a rates tractades amb IONP va disminuir els nivells de MDA al teixit cerebral i els nostres resultats estaven en concordança amb els obtinguts per Dong et al. [32] que va afirmar que la quercetina va disminuir la peroxidació lipídica reduint els nivells de MDA al teixit cerebral de les rates. Això es pot explicar per la capacitat de la quercetina de reduir el ROS, per tant, inhibint la peroxidació lipídica i evitant la formació de MDA [33]. Això es va atribuir al grup catecol (anell B) i al grup OH a la posició 3 de l'anell A i C, que tenen una eliminació òptima de radicals lliures [17].

El GSH és una part essencial de la defensa antioxidant cel·lular que reacciona directament amb ROS i altres espècies reactives [34]. En el present estudi, els nivells de GSH cerebral es van reduir significativament en rates tractades amb IONP, però els nivells de GSSG van augmentar significativament. Reddy et al.[26] van declarar l'esgotament dels nivells de GSH al teixit cerebral de rates tractades amb IONP i van suggerir que podria ser degut a l'augment de la utilització de GSH en reaccions de conjugació com a part d'un mecanisme de desintoxicació, per tant, la reducció del GSH va disminuir i el GSSG oxidat. augmentat. La coadministració de rates tractades amb IONP amb quercetina ho va restaurar augmentant el GSH i disminuint els nivells de GSSG al teixit cerebral. Aquests resultats estaven en harmonia amb Singh et al. [35] que va informar de l'elevació dels nivells de GSH al teixit cerebral que indica el potencial antioxidant de la quercetina. Dong et al. [32] també va revelar que la quercetina alterava l'expressió gènica del factor nuclear eritroide 2-relacionat amb el factor 2(Nrf2). En conseqüència, Nrf2 va estimular la producció d'enzims antioxidants als teixits cerebrals.

En el present estudi, la CPK va augmentar significativament en el teixit cerebral de rates tractades amb IONP. En l'amortització d'energia cel·lular i la transmissió d'energia, la CPK/fosfocreatina té un paper important, especialment en cèl·lules amb necessitats energètiques elevades i fluctuants, com ara les neurones [36]. Per tant, l'activació del sistema CPK/fosfocreatina i els canvis d'expressió de CPK poden ser un indicador anterior de l'estrès oxidatiu i bioenergètic a la cèl·lula [37] com a compensació per la disminució de la producció d'energia a causa de l'estrès oxidatiu. La coadministració de rates tractades amb IONP amb quercetina va disminuir la CPK al teixit cerebral, Lemmens et al. [38] va demostrar disminucions de les activitats de CPK a causa de la suplementació de quercetina.

L'activitat de l'AChE al teixit nerviós és responsable de la hidròlisi de l'acetilcolina (Ach) a la colina a les sinapsis i la unió neuromuscular [39]. En el present estudi, l'AChE va augmentar significativament en rates tractades amb IONP i aquest resultat estava en harmonia amb Dhakshinamoorthy et al. [22] que van reconèixer augments significatius de les activitats d'AChE al teixit cerebral de rates tractades amb IONP en les quals l'acumulació de ferro per part dels IONP va alterar el sistema colinèrgic.

Els neurotransmissors són substàncies químiques endògenes que permeten que les neurones es comuniquin per tot el cos; permeten que el cervell realitzi diferents funcions en la transmissió química sinàptica [40]. En l'estudi actual, les concentracions d'adrenalina, serotonina i melatonina als teixits cerebrals es van reduir significativament en rates tractades amb IONP.

Yousef et al. [41] va informar que els nivells de serotonina i dopamina es van reduir significativament al teixit cerebral en rates tractades amb IONP. En canvi, la quercetina va augmentar les concentracions d'adrenalina, serotonina i melatonina als teixits cerebrals en comparació amb les IONP. Singh et al. [35l va afirmar que la quercetina augmentava la serotonina, la norepinefrina i la dopamina.

La biogènesi mitocondrial assumeix un paper principal en el manteniment de l'homeòstasi mitocondrial per satisfer les necessitats fisiològiques cel·lulars de les cèl·lules neuronals [42]. PGC-1a és un factor de regulació co-transcripcional que indueix la biogènesi mitocondrial i promou l'expressió de mtTFA [43]. En el present estudi, els nivells d'expressió de PGC-1a i mtTFA es van reduir significativament al teixit cerebral en rates tractades amb IONP. Els nostres resultats estaven en concordança amb els obtinguts per Yousef et al. [44]. Van il·lustrar que la biogènesi mitocondrial representada per PGC-la i mtTFA va disminuir significativament la seva expressió en el teixit cerebral en rates exposades a IONP, cosa que indica una disminució de la biogènesi mitocondrial i la replicació i transcripció de l'ADNmt que podria conduir a una disfunció mitocondrial. La coadministració de rates tractades amb IONP amb quercetina va restaurar aquesta disminució augmentant les expressions tant de PGC-1a com de mtTFA al teixit cerebral i els nostres resultats estaven en harmonia amb Sharma et al.[45] que va informar que la quercetina va augmentar l'expressió de PGC-1a, NRF{-1, NRF-2 i mtTFA. Van suggerir que a causa d'una disminució de ROS pel PGC induït per la quercetina{{17 }}un augment, això va provocar l'activació de l'expressió NRF-1 i NRF-2 estimulada de mtTFA.

La quercetina va atenuar l'efecte apoptòtic dels IONP mitjançant una reducció significativa de la caspasa 3 i un augment dels nivells d'expressió de Bcl2 a les seccions immunohistoquímiques del cervell. Aquesta troballa dóna suport alantioxidantpotencial de la quercetina. De la mateixa manera, el tractament amb quercetina va atenuar l'augment de la caspasa 3 en lesions cerebrals isquèmiques en rates [46,47] i Bcl2 en ratolins tractats amb lipopolisacàrids [48].

4. Materials i Mètodes

4.1.Reactius i productes químics

La pols de nanopartícules d'òxid de ferro (ⅡI) es va obtenir de Sigma-Aldrich (Louis, Mo, EUA), que es va solubilitzar en aigua desionitzada abans del seu ús. La quercetina és una forma en pols que també es va obtenir de Sigma-Aldrich, que es va dissoldre en sulfòxid de dimetil (DMSO) i aigua destil·lada en una proporció d'1:20, respectivament, abans de l'ús. Es va comprar DMSO superior o igual al 99,6 per cent a Sigma-Aldrich. Altres productes químics i aigua desionitzada es van comprar al Centre d'Estudis i Recerca de Postgrau de la Universitat d'Alexandria.

4.2. Declaració Ètica

L'estudi es va aprovar en resposta a les directrius de la "Guia NIH per a la cura i l'ús d'animals de laboratori" pel Comitè d'Ètica de la Facultat de Medicina Veterinària de la Universitat d'Alexandria, Egipte.

4.3. Caracterització de les IONP

La morfologia i la mida de partícules dels IONP es van examinar mitjançant un microscopi electrònic d'escaneig (SEM). La càrrega de la partícula també es va determinar pel potencial zeta mitjançant un ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Regne Unit).

4.4.Animals, habitatge i disseny experimental

Es van comprar quaranta rates albines masculines adultes sanes amb un pes corporal de 150 ± 20 (BW) a la Unitat de Cria d'Animals de l'Institut d'Investigació Mèdica de la Universitat d'Alexandria, Egipte. Els animals es van mantenir en gàbies metàl·liques en condicions ambientals controlades amb una temperatura òptima (23 ± 2), humitat (55 ± 5) i un cicle fosc/llum (12 h) i accés lliure a una dieta d'alimentació basal (taula 1). i aigua potable. Tots els animals van ser allotjats durant dues setmanes abans de l'experiment d'aclimatació. Les rates es van assignar aleatòriament a cinc grups (vuit rates cadascun); el control va rebre una dieta basal normal i aigua ad libitum, el grup IONPs es va injectar intraperitonealment amb IONPs 50 mg/kg de peso corporal tres vegades per setmana[49], el grup IONPs més Q25 mg es va administrar amb la mateixa dosi.

d'IONPs i es van donar amb 25 mg de quercetina/kg de peso corporal al dia, el grup IONPs més Q50 es va administrar amb la mateixa dosi d'IONPs i es va administrar amb 50 mg de quercetina/kg de peso corporal al dia i el grup IONPs més Q100 es va administrar amb la mateixa dosi d'IONPs i gavaged. amb 100 mg de quercetina/kg de peso corporal al dia [17]. Tots els tractaments es van mantenir durant 30 dies.

4.5. Mostreig

Al final de l'experiment, les rates van ser dejunades durant 12 hores i anestesiades mitjançant una injecció intraperitoneal de ketamina/xilazina (100 mg/kg/10 mg/kg) després eutanasiades i immediatament es va disseccionar el cervell. esbandida amb solució salina normal refrigerada al 0,9 per cent i dividida en tres parts; el primer es va utilitzar per a anàlisis bioquímiques. La segona part es va mantenir a -80 grau per a l'extracció d'ARNm i l'avaluació de RT-PCR, mentre que l'última part es va rentar amb solució salina tampó fosfat (PBS, pH 7,4) i es va fixar en un 4% de paraformaldehid dissolt en PBS durant 48 h per al fixació de la mostra.

4.6. Anàlisis Bioquímiques

Les parts de cada cervell de rata es van homogeneïtzar en solució salina tampó fosfat (PBS) freda i es van centrifugar durant 10 min a 4 graus a 1435 × g. El malondialdehid (MDA), el GSH, el glutatió oxidat (GSSG) i la creatina fosfocinasa (CPK) van ser determinats pels kits comercials de Biodiagnostic Co. (Giza, Egipte). Les activitats de l'enzim acetilcolinesterasa (AChE) en homogeneïtats cerebrals es van determinar mitjançant un kit d'assaig colorimètric (BioVision Co., Milpitas, CA, EUA). Els nivells d'epinefrina, serotonina i melatonina en homogeneïtats cerebrals també es van determinar mitjançant kits ELISA (BioVision Co., Milpitas, CA, EUA).

4.7.Extracció d'ARNm i RT-PCR

L'ARN total es va extreure de les mostres mitjançant els kits d'extracció d'ARN total easy-RED del fabricant (iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Corea del Sud). La primera cadena d'ADNc es va aconseguir mitjançant el paquet HiSen Script cDNA (iNtRON Biotechnology, Inc.). Es van utilitzar cebadors específics per amplificar gens seleccionats amb gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) com a gen de neteja estable (taula 2). L'expressió d'ARNm es va aconseguir mitjançant un gen Strata MX3005P PCR en temps real (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) i una mescla mestra de qPCR TOP real TM PreMIX SYBR Green (cat. RT 500, Enzynomics, Daejeon, Corea del Sud) seguint les instruccions del fabricant. Les concentracions relatives d'expressió gènica es van avaluar mitjançant el mètode 2-AAct descrit per Pfaffl [50].

4.8. Exploració histopatològica

Utilitzant la tècnica tradicional d'incorporació de parafina, les mostres fixes es van deshidratar en graus ascendents d'etanol, es van netejar en tres canvis de xilè i es van acabar per incrustació de parafina a 65 graus C. Les seccions de 4 um de gruix es van tenyir amb hematoxilina i eosina (H i E) [51].

Les seccions del cervell es van hidratar mitjançant una sèrie de concentracions d'alcohol decreixents i es van col·locar en una solució de ferrocianur de potassi al 20 per cent amb una solució de HCl al 20 per cent durant 30 min. Les diapositives es van rentar, es van deshidratar, es van netejar amb xilè i es van observar al microscopi per a la tinció blava del contingut de ferro [52].

4.9.Examen immunohistoquímic

La tècnica estàndard d'immunohistoquímica de la peroxidasa de rave picant (HRP) es va aplicar a les diapositives carregades positivament de les seccions de teixit de parafina. D'acord amb les directrius del fabricant, es van utilitzar la caspasa antirata de conill 3 (Lab Vision, Fremont, CA, EUA) i Bcl2 (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Cinc seccions gruixudes del cervell, el cerebel, la medul·la espinal i el nervi ciàtic es van desparafinar, es van rehidratar i es van tractar prèviament amb peròxid d'hidrogen al 3% (H2O2) per bloquejar l'activitat de la peroxidasa endògena. La recuperació d'antígen es va aconseguir col·locant diapositives en un microones durant 10 min en un tampó de citrat de sodi de 10 mM (pH6,0). Les diapositives es van incubar amb l'anticòs primari i després es van esbandir amb solució salina tampó Tris i l'anticòs secundari. Les diapositives es van incubar amb una solució de cromogen de substrat 3,3/-diaminobenzidina (DAB) i després es van contrastar amb hematoxilina de Mayer. Es van capturar imatges de 10 camps diferents amb una ampliació de × 400.

4.10. Anàlisi estadística

Es va utilitzar un ANOVA unidireccional amb les proves d'interval múltiple post hoc de Tukey per a l'anàlisi de dades mitjançant un GraphPad Prism v.5https://www.graphpad.com/, consultat el 10 de març de 2021 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) . Totes les declaracions d'importància depenien de la p<0.05. 5.="">

Les nanopartícules d'òxid de ferro (IONP) injectades per via intraperitoneal amb una dosi de 50 mg/kg de BW van provocar alteracions oxidatives al cervell mentre que la quercetina en dosis de 25, 50 i 100 mg/kg de BW va alleujar les lesions oxidatives cerebrals induïdes per les IONP. Per tant, la quercetina és un complement alimentari prometedor juntament amb la teràpia IONP.

Referències

1. Mazdeh, M.; Rahiminejad, ME; Nili-Ahmadabadi, A.; Ranjbar, A. Trastorns neurològics i estrès tòxic oxidatiu: un paper de les nanopartícules metàl·liques. Jundishapur J. Nat. Farmàcia. Prod. 2016, 11, e27628. [Ref creuat]

2. Fidler, MC; Walczyk, T.; Davidsson, L.; Zeder, C.; Sakaguchi, N.; Juneja, LR; Hurrell, RF Un pirofosfat fèrric micronitzat i dispersible amb una alta biodisponibilitat relativa en l'home. Br. J. Nutr. 2004, 91, 107–112. [Ref creuat]

3. Ramimoghadam, D.; Bagheri, S.; Hamid, SBA Avenços en la síntesi electroquímica de nanopartícules d'òxid de ferro magnètic. J. Magn. Magn. Mater. 2014, 368, 207–229. [Ref creuat]

4. Gaharwar, EUA; Kumar, S.; Rajamani, P. Resposta hematopoètica i immunològica induïda per nanopartícules d'òxid de ferro en rates. RSC Adv. 2020, 10, 35753–35764. [Ref creuat]

5. Gaharwar, EUA; Paulraj, R. Les nanopartícules d'òxid de ferro van provocar danys oxidatius a les cèl·lules sanguínies perifèriques de rata. J. Biomed. Ciència. Eng. 2015, 8, 274–286. [Ref creuat]

6. Feng, Q.; Liu, Y.; Huang, J.; Chen, K.; Huang, J.; Xiao, K. Absorció, distribució, eliminació i toxicitat de nanopartícules d'òxid de ferro amb diferents mides i recobriments. Ciència. Rep. 2018, 8, 1–13. [CrossRef] [PubMed]

7. Gaharwar, EUA; Meena, R.; Rajamani, P. Biodistribució, eliminació i alteracions morfològiques de nanopartícules d'òxid de ferro administrades per via intravenosa en rates Wistar masculines. Int. J. Nanomed. 2019, 14, 9677–9692. [CrossRef] [PubMed]

8. Palmieri, B.; Sblendorio, V. Proves d'estrès oxidatiu: visió general de la fiabilitat i l'ús, Part II. Eur. Reverent Med. Pharmacol. Ciència. 2007, 11, 383–399.

9. Naqvi, S.; Samim, M.; Abdin, MZ; Ahmed, FJ; Maitra, AN; Prashant, CK; Dinda, AK Toxicitat depenent de la concentració de nanopartícules d'òxid de ferro mediada per un augment de l'estrès oxidatiu. Int. J. Nanomed. 2010, 5, 983–989. [Ref creuat]

10. David, AVA; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. Visions generals de la importància biològica de la quercetina: un flavonoide bioactiu. Farmacogn. Rev. 2016, 10, 84–89.

11. Wu, W.; Li, R.; Li, X.; Ell, J.; Jiang, S.; Liu, S.; Yang, J. La quercetina com a agent antiviral inhibeix l'entrada del virus de la grip A (IAV). Virus 2015, 8, 6. [CrossRef]

12. Akdemir, FNE; Gülçin, ˙I.; Karagöz, B.; Soslu, R. La quercetina protegeix el múscul esquelètic de la rata de lesions per isquèmia-reperfusió. J. Enzim. Inhib. Med. Chem. 2016, 31, 162–166. [CrossRef] [PubMed]