R. Vesicarius L. exerceix un efecte nefroprotector contra l'estrès oxidatiu induït pel cisplatí
Mar 26, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Md. Mahmudul Hasan1, La majoria. Sayla Tasmin2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Md. Abu Reza1i Ariful Haque2*
Resum
Antecedents:El cisplatí és un fàrmac anticancerígen excepcional, però el seu ús s'ha reduït notablement a causa de la nefrotoxicitat severa. R. vicarious L. és una hortalissa de fulla evident amb potencial antiangiogènic, antiinflamatori, antiproliferatiu, hepatoprotector i nefroprotector. Per tant, aquest estudi va ser dissenyat per inspeccionar el seu extracte de metanol (RVE) per a un possible efecte nefroprotector.
Mètodes:Principalment, in vitro, es va confirmar l'activitat antioxidant de l'RVE basant-se en l'aptitud per eliminar radicals lliures de 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). A continuació, es van tractar ratolins mascles albinos suïssos amb cisplatina (2, 5 mg/kg) durant 5 dies successius per induir nefrotoxicitat. La recuperació de la nefrotoxicitat es va examinar tractant els animals amb RVE (25, 50 i 100 mg/kg) per via intraperitoneal (ip) durant els següents 5 dies consecutius. Un cop finalitzat el tractament, es van sacrificar els ratolins i es van recollir els ronyons. Una part es va homogeneïtzar en tampó de fosfat sòdic per avaluar el nivell de malondialdehid (MDA), una altra part es va utilitzar per avaluar l'expressió gènica (NQO1, p53 i Bcl-2). A més, es va avaluar la capacitat neutralitzadora del peròxid d'hidrogen (H2O2) de RVE en cèl·lules HK-2 in vitro. Finalment, es van determinar els fitoquímics bioactius en RVE mitjançant cromatografia de gasos-espectrometria de masses (GC-MS).
Resultats:RVE va mostrar activitat antioxidant in vitro de manera dependent de la dosi amb un valor IC50 de 37,39 ± 1,89 ug/mL.
El tractament amb RVE (p <{{0}}.05) va="" disminuir="" notablement="" el="" contingut="" de="" mda="" al="" teixit="" renal.="" a="" més,="" l'expressió="" dels="" gens="" nqo,="" p53="" i="" bcl-2="" es="" va="" mitigar="" significativament="" (p=""><0, 05)="" de="" manera="" dependent="" de="" la="" dosi="" a="" causa="" de="" l'administració="" de="" rve.="" rve="" significativament="" (p=""><0, 05)="" va="" revertir="" el="" nivell="" d'h2o2="" a="" les="" cèl·lules="" hk-2="" a="" gairebé="" normal.="" a="" partir="" de="" gc-ms,="" deu="" compostos="" inclosos="" tres="" antioxidants="" coneguts="" "4h-pyran-4-un,="" 2,="" 3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-"="" ,="" "àcid="" hexadecanoic"="" i="" "esqualè"="" es="" van="" detectar.="" l'extracte="" era="" ric="" amb="" un="" alcaloide="">
Conclusió:En general, RVE té un efecte protector contra el dany renal induït pel cisplatí.
Paraules clau:Cisplatí, R. vicarious, ratolins, ronyó, cèl·lules HK-2, estrès oxidatiu, gen NQO1
Cistanche deserticola prevé la malaltia renal, feu clic aquí per obtenir la mostra
Introducció
L'estrès oxidatiu és el resultat de la desproporció entre la formació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i els mecanismes de defensa antioxidants regulars [1]. Les reaccions bioquímiques regulars, l'exposició freqüent a l'entorn desfavorable i la ingesta elevada de xenobiòtics donen lloc a la producció de ROS [1]. Les ROS interaccionen amb els residus de cisteïna de les molècules de senyalització sensibles a redox, inclosos els factors de transcripció, les proteïnes tirosina fosfatases i les proteïnes quinases; en conseqüència, l'oxidació dels grups tiol d'aquests residus guia les alteracions de les proteïnes dirigides, les accions biològiques, les capacitats de senyalització, la immunitat i els paradigmes de cèl·lules vives/morts suplementàries [2]. Les espècies químiques que contenen oxigen que tenen propietats reactives es coneixen com a ROS, que inclou radicals lliures i molècules no radicals com el superòxid i l'H2O2, respectivament [3]. L'estrès oxidatiu induït per ROS està relacionat amb l'etiologia de nombroses malalties, inclòs el càncer. La leucèmia mieloide aguda (AML) és un creixement cancerós de cèl·lules sanguínies dins de la medul·la òssia. Els esdeveniments cel·lulars i moleculars subjacents a l'AML inclouen danys a l'ADN, propagació clonal, augment de la mort cel·lular i més inestabilitat genètica, que són el resultat de l'estrès oxidatiu induït per ROS [4]. La fisiologia humana ha estat dotada de nombrosos mecanismes que poden generar antioxidants per exercir protecció contra l'estrès oxidatiu que protegeixen les cèl·lules dels efectes tòxics i serveixen per a la prevenció de malalties [5]. Tanmateix, les cèl·lules desenvolupen mecanismes endògens per contrarestar l'estrès oxidatiu i conservar les ROS requerides [6].
NAD(P)H: la quinona oxidoreductasa 1 (NQO1) és un flavoenzim [7] que pot catalitzar la reducció de dos o quatre electrons i utilitza aquesta propietat per desintoxicar les quinines [8]. Pot protegir les cèl·lules del dany oxidatiu mantenint de banda el cicle redox i reduint la producció de radicals lliures [8]. A més de la desintoxicació xenobiòtica, NQO1 també està implicat en la neutralització del superòxid, la modulació de la degradació del proteasomal p53 [9], la inhibició de Bcl-2 [10] i la millora de la susceptibilitat a lesions cel·lulars [11].
El cisplatí és el primer medicament contra el càncer basat en platí aprovat per la Food and Drug Administration (FDA) [12]. El cisplatí exerceix apoptosi induint estrès oxidatiu i sobreexpressió del gen supressor de tumors p53 [12]. Diversos efectes adversos com la nefrotoxicitat, l'hepatotoxicitat, la gastrotoxicitat, l'ototoxicitat, la mielosupressió i la neurotoxicitat són el resultat de l'estrès oxidatiu induït pel cisplatí [12]. Aquests efectes secundaris han disminuït notablement l'ús de cisplatí tot i que té una activitat anticancerígena excepcional. El cisplatí és ben conegut per induir estrès oxidatiu i suprimir el gen NQO1 en ronyons de ratolins [13]. Per tant, la recerca i la validació de fonts naturals efectives d'antioxidants s'estan convertint en una àrea de consciència. La ingesta d'antioxidants dietètics derivats de plantes, com ara flavonoides, carotenoides i compostos fenòlics, pot provocar protecció contra malalties cardiovasculars, cataractes i càncer [14].
R. vicarious (Polygonaceae) es coneix com "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" en bengalí [15]. Creix a les zones desèrtiques i semidesèrtiques d'Àsia, Austràlia i el nord d'Àfrica [16]. És una planta en perill d'extinció poc estudiada a Bangla Desh. A Bangla Desh, la gent consumeix tota la planta com a verdura després de cuinar-la amb sal, diferents espècies i oli. De vegades, la gent utilitza només les fulles fresques de l'amanida mixta com a alternativa a l'enciam. La fulla crua és lleugerament àcida, però es torna molt àcida després de la cocció. A més, durant la cocció s'acostuma a barrejar un petit nombre de fulles als plats de peix per tenir un gust lleugerament àcid.
Aquesta planta s'està utilitzant com a herba vegetal i medicinal a tot el món [17]. Les fulles i les llavors s'utilitzen com a antídot per al verí de serps i escorpins, respectivament [17]. En el tractament popular, R. vicarious s'ha utilitzat durant molt de temps en el tractament de malalties hepàtiques, mala digestió, restrenyiment, piles, vòmits, flatulències, problemes cardíacs, dolors, trastorns de la melsa, dispèpsia, mal de queixal, bronquitis, asma, sarna, leucoderma i com a laxant, estomacal, aperitiu, tònic, diürètic i analgèsic [18]. Aquesta planta comprèn nombrosos compostos biològicament importants com flavonoides, antraquinones, carotenoides, vitamines, lípids i àcids orgànics, que són coneguts com a agents antioxidants, antimicrobians i anticancerígens [19]. Cada part d'aquesta planta conté quercetina (flavonoides) en una quantitat elevada [15]. Aquesta planta conté 0,25 mg de vitamina A, 1,33 mg de vitamina C, 2,37 mg de vitamina E [15], 3,38 mg de flavonoides i 5,66 mg de polifenols [20] per 100 g de pes sec.
Shahat i els seus col·legues [21] van mostrar efectes anti-angiogènics i anti-proliferatius de l'extracte de metanol (80 per cent) de la part aèria vicària de R. contra el carcinoma hepatocel·lular en un model de rata. Un altre estudi va mostrar el potencial antiangiogènic in vitro de l'extracte vicari de R. [22]. L'extracte de metanol de R. vicarious sencer exerceix protecció contra l'hepatotoxicitat induïda pel tetraclorur de carboni in vivo [23]. L'efecte antiinflamatori en conills ha estat evident per l'extracte metanòlic de fulla de R. vicarious [24]. Un estudi recent [25] va informar de l'efecte nefroprotector in vivo de l'extracte vicari de R. etanòlic fraccionat contra la toxicitat de gentamicina i dicromat de potassi.
Tenint en compte la informació anterior, vam tenir com a objectiu inspeccionar l'efecte dels extractes vicaris de R. (RVE) en termes de recuperació de la nefrotoxicitat induïda per cisplatí mitjançant el manteniment de l'expressió del gen NQO1 en un model animal.
Beneficis per a la salut de cistanche: tractament de malalties renals
Materials i mètodes
Productes químics i reactius
El cisplatí i el 2, 2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) es van comprar a SIGMA-ALDRICH (EUA).
El kit d'assaig colorimètric de creatinina (ID de producte: 700.460) es va comprar a Cayman Chemical (EUA). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum fetal boví (FBS) i l'antibiòtic (10,000 U/mL de penicil·lina i 10,000 ug/mL d'estreptomicina) es van comprar a Gibco (Gibco Laboratories, EUA). El kit d'assaig ROS-Glo™ H2O2 i la mescla mestra GoTaq® qPCR es van obtenir de Promega (EUA). El kit de transcripció inversa TIAN-Script M-MLV es va comprar a TIANGEN (Xina) i primers a IDT (Integrated DNA Technologies, Malàisia). Tots els altres productes químics i reactius utilitzats en aquest experiment eren de grau analític.
Recollida de mostres de plantes i preparació d'extractes
Es van comprar plantes fresques de R. vicàries en un mercat local de Sonadighi, Rajshahi, Bangla Desh. L'exemplar de planta va ser identificat i autenticat pel Dr. Ahmad Humayan Kabir, Departament de Botànica, Universitat de Rajshahi, Bangla Desh. Un exemplar sota el val núm. 00095 es va emmagatzemar a l'herbari del Departament de Botànica de la Universitat de Rajshahi. Les parts aèries de la planta es van netejar, es van assecar a 37 graus, es van triturar a una pols gruixuda amb un assecador electrònic i es van emmagatzemar en un recipient tancat a 4 graus. La pols fina (10 g) es va dissoldre en metanol (500 ml). El contingut es va sonicar (Soniprep 150, Xina) a 20 kHz durant 10 min. La filtració de l'extracte es va dur a terme utilitzant paper de filtre de fibra de vidre (Macherey NAGEL, GmBH, alemany) amb un aparell de filtratge DURAN (alemany). Finalment, el filtrat es va concentrar mitjançant un assecador de congelació (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, EUA). L'extracte finalment es va anomenar RVE.
Prova d'activitat antioxidant in vitro
La capacitat antioxidant in vitro de RVE es va dur a terme a partir de l'eliminació de DPPH tal com es va descriure anteriorment [26] amb poca modificació. La capacitat d'eliminació de radicals de DPPH de RVE es va avaluar a partir de la conversió del color porpra de DPPH en color groc. La barreja de reacció a cada tub de microcentrífuga (2 ml) constava de 95 0 μL de solució metanòlica de radicals DPPH (0,1 mM) i 50 μL de RVE de cinc concentracions diferents (200, 500, 1000, 2000 i 4000 ug). /mL metanol) per fer concentracions finals de 10, 25, 50, 100 i 200 ug/mL. Es va mantenir com a control un altre tub que contenia 50 μL de metanol i 950 μL de solució metanòlica de DPPH. Les provetes es van deixar durant 30 minuts en un lloc fosc. L'absorbància de les mescles es va prendre a 517 nm mitjançant l'espectrofotòmetre UV-VIS GENESYS 10S (Thermo SCIENTIFIC, EUA). Finalment, el percentatge d'activitat d'eliminació de radicals (RSA) es va calcular a partir de la decoloració de DPPH mitjançant la fórmula següent percentatge RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100 on ADPPH és l'absorbància de la solució de DPPH (control) i ARVE és l'absorbància de la solució RVE. La concentració a la qual RVE va donar com a resultat un 50 per cent de RSA es va anomenar valor IC50 i es va calcular mitjançant un gràfic que situava el percentatge de RSA contra diferents concentracions de RVE utilitzades.
Animals experimentals i disseny experimental
Els ratolins albinos suïssos mascles de 42 dies d'edat (30-32 g de pes corporal) es van aclimatar durant 1 setmana abans d'iniciar l'experiment en una habitació (temperatura d'uns 25 ± 2 graus i ~ 50 per cent d'humitat, cicle fosc/llum de 12 h). L'aigua potable i el menjar es van proporcionar ad libitum.
Els ratolins es van separar aleatòriament en vuit grups (n {{0}}). El primer grup (control) es va tractar amb 0,2 ml de NaCl al 0,9 per cent. Els quatre grups següents es van tractar amb cisplatina a 2, 5 mg/kg durant 5 dies a un interval de 24 h. Després de l'administració de cisplatí, un grup (segon grup) es va quedar sense cap tractament addicional i es va assignar com a grup de control estressat. El tercer, quart i cinquè grups van ser tractats amb RVE a 25, 50 i 100 mg/kg, respectivament durant 5 dies. Altres tres grups van ser tractats amb RVE només a 25, 50 i 100 mg/kg, respectivament durant 5 dies. El cisplatí i RVE es van dissoldre en aigua destil·lada. Tots els tractaments es van administrar per via intraperitoneal. Després de 24 h de l'últim tractament, els animals van ser sacrificats després de la luxació cervical [25]. A continuació, es va obrir el peritoneu amb unes tisores, es va recollir sang després d'una punció cardíaca i es van recollir els ronyons amb pinces. Es va sotmetre sang per comprovar el nivell de creatinina en sèrum. Els ronyons es van sotmetre a una avaluació del nivell de malondialdehid i de l'expressió gènica.
Mesura de la creatinina sèrica
La creatinina sèrica es va mesurar mitjançant el kit d'assaig colorimètric de creatinina-700,460 (Cayman Chemical, EUA) seguint el protocol del fabricant proporcionat amb el kit.
Mesura de la peroxidació lipídica renal
El malondialdehid (MDA) és un producte final de la peroxidació de lípids al teixit renal i normalment es mesura com a indicador de la producció de ROS. Tanmateix, el nivell de MDA es va mesurar al teixit renal segons un estudi previ [27]. Al principi, el teixit renal es va homogeneïtzar en tampó de fosfat sòdic (0,1 M, pH 7,4). A 100 es va afegir una solució de reacció que comprenia 0,8 per cent d'àcid tiobarbitúric (1,5 ml), 8,1 per cent de SDS (200 μL), 20 per cent (pH 3,5) d'àcid acètic (1,5 ml) i dH2O (600 μL) μL de teixit homogeneïtzat i la barreja es va incubar a 95 graus durant 1 h. Després del refredament, les mescles es van centrifugar a 10,000 g durant 10 min a 4 graus i es va mesurar l'absorbància del sobrenedant a 532 nm amb tetrametoxi propà estàndard 1, 1, 3, 3-. La quantitat de proteïna total es va mesurar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes de Bradford (BIO-RAD, EUA) i comparant-la amb l'albúmina sèrica bovina estàndard (BSA). La intensitat dels peròxids lipídics es va articular com a nanomols (nM) de MDA per mil·ligram (mg) de proteïna.
Reacció en cadena de la polimerasa en temps real (PCR en temps real)
La PCR en temps real es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [28, 29]. L'ARN total del teixit renal es va aïllar mitjançant el reactiu TRIzol® (Invitrogen) segons el protocol subministrat pel fabricant. L'ARN aïllat (1 ug) es va convertir després en ADNc. En primer lloc, es van prendre 2 μL d'hexàmer aleatori (10 μM), 2 μL dNTPs (10 mM), 1 ug d'ARN i HO lliure de nucleases fins a 15 μL i es van incubar durant 5 min a 70 graus. La barreja es va posar instantàniament sobre gel durant 2 minuts. A continuació, es van afegir 4 μL de tampó de la primera cadena (5x) i 1 μL de transcriptasa inversa M-MLV a cada tub i es van incubar durant 10 min i 50
min a 25 graus i 42 graus, respectivament. Finalment, l'enzim de transcriptasa inversa M-MLV es va inactivar incubant la mescla a 95 graus durant 5 min. Els productes d'ADNc sintetitzats es van sotmetre a PCR en temps real per quantificar l'expressió gènica de NQO1, p53 i Bcl-2 mitjançant cebadors específics (taula 1). Cada reacció (10 μL) es va realitzar per triplicat compost per 5 μL GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, EUA), 0, 5 μL (10 mM) de cada cebador, 3 μL d'aigua sense nucleases i 1 μL d'ADNc en 48-plaques de reacció de pous. El cicle tèrmic es va realitzar mitjançant una màquina de PCR en temps real (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, EUA) amb les següents condicions de ciclisme: 95 graus durant 10 min, seguits de 40 cicles de 95 graus durant 30 s, 50 graus durant 30 s i 72 graus durant 25 s. L'especificitat de les reaccions de PCR es va confirmar mitjançant l'anàlisi de la corba de fusió a 95 graus durant 15 s, 45 graus durant 15 s i 95 graus durant 15 s. L'especificitat de les reaccions de PCR es va confirmar mitjançant l'anàlisi de la corba de fusió a 95 graus durant 15 s, 45 graus durant 15 s i 95 graus durant 15 s. La quantificació relativa de l'expressió gènica es va realitzar mitjançant el gen GAPDH endogen com a control basat en el mètode ΔΔCq.
Cultiu i tractament cel·lular
La línia cel·lular epitelial del túbul renal proximal humà, les cèl·lules HK-2, es va mantenir en DMEM complementada amb un 10% de FBS i antibiòtics (50 U/mL de penicil·lina i 50 ug/mL d'estreptomicina) en una incubadora amb un 5% de CO2 i 95%. per cent d'humitat a 37 graus.
Assaig de mesura de H2O2
El nivell d'H2O2 a les cèl·lules HK-2 es va estimar mitjançant el kit d'assaig ROS-Glo™ H2O2 (Promega, EUA) segons el protocol proporcionat pel fabricant del kit. Les cèl·lules HK-2 (1000 cèl·lules) en 70 μL de DMEM es van col·locar als pous de la placa de microtitulació 96-pou. Després de permetre la fixació de les cèl·lules a la superfície de la paret, es van substituir 10 μL de DMEM dels pous de la placa de microtitulació per 10 μL de cisplatí (25 μM en DMEM) i es van mantenir en una incubadora durant 12 h. A continuació, es van afegir 10 μL de RVE per aconseguir concentracions finals de 125, 250 i 500 ug/mL en DMEM i es van incubar durant 12 h més. Després d'això, es van afegir 20 μL de solució de substrat H2O2 i 100 μL de solució de detecció ROS-Glo™ a cada pou. La reacció es va incubar a temperatura ambient durant 20 min. Finalment, es va mesurar la luminescència mitjançant GloMax Luminometer (Promega, EUA).
Anàlisi GC-MS
L'anàlisi GC-MS de RVE (dissolt en metanol) es va realitzar tal com s'ha descrit anteriorment [30] mitjançant GCMS-QP202{0 (SHIMADZU) que inclou un mostreig automàtic (AOC{ {5}}s), un autoinjector (AOC-20i) i un cromatògraf de gasos (GC{-2010 Plus) connectats a un espectròmetre de masses equipat amb un SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Columna capil·lar Sil MS (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). El gas portador Heli es va mantenir a un cabal constant d'1, 72 mL / min i es va sotmetre a un volum d'injecció de 5 μL amb una proporció de divisió de 10: 1. La temperatura de l'injector es va mantenir a 220 graus, la temperatura de la font d'ions era de 280 graus, la temperatura del forn es va programar des de 80 graus (mantenir durant 2 minuts), amb un augment de 5 graus / min a 150 graus (temps de retenció 5,0). min), després de 5 graus / min a 280 graus, acabant amb una isotèrmica de 8 min a 280 graus. Els espectres de masses es van prendre a 1, 5 kV amb un interval d'exploració de 0, 5 s i la mostra es va executar en un rang de 45-350 m/z. El retard del dissolvent va ser de 0 a 3 min i el temps total de funcionament de GC-MS va ser de 55 min. La concentració relativa dels compostos detectats es va mesurar comparant la seva àrea màxima mitjana amb l'àrea total. La interpretació de l'espectre de masses en GC-MS es va realitzar mitjançant les bases de dades NIST (National Institute Standard and Technology) incloent NIST08, NIST08s i NIST14.
Anàlisi estadística
Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant ANOVA seguint la prova T3 de Dunnett mitjançant el programari IBM SPPS (versió 20). Les dades s'articulen com a mitjanes ± desviació estàndard (SD). La comparació significativa es va considerar a la p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Resultats
Prova d'activitat antioxidant in vitro
Tot i que anteriorment es va informar que RVE tenia activitat antioxidant, vam tornar a comprovar l'activitat antioxidant del nostre extracte mitjançant la capacitat d'eliminació de radicals lliures de DPPH. L'RVE va neutralitzar la DPPH de manera dependent de la dosi (Fig. 1). RVE va revelar una activitat antioxidant in vitro considerable i el valor IC50 calculat de RVE va ser de 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Mesura de la creatinina sèrica
El nivell de creatinina sèrica en ratolins va augmentar significativament (p <{{0}},05) després="" de="" l'administració="" de="" cisplatí="" (taula="" 2).="" el="" tractament="" amb="" rve="" va="" millorar="" notablement="" (p=""><0, 05)="" el="" nivell="" de="" creatinina="" de="" manera="" dependent="" de="" la="" dosi="" (taula="">
Mesura de la peroxidació lipídica renal
En comparació amb el control, el cisplatí va augmentar considerablement (p <{{0}},05) el="" contingut="" de="" mda="" al="" teixit="" renal="" de="" ratolins="" (taula="" 3).="" en="" canvi,="" el="" tractament="" rve="" va="" restablir="" considerablement="" (p=""><0, 05)="" la="" mda="" gairebé="" normal="" de="" manera="" dependent="" de="" la="" dosi="" (taula="">
PCR en temps real
El cisplatí (p <{{0}}.05) va="" disminuir="" significativament="" l'expressió="" de="" l'arnm="" de="" nqo1="" 0.{15-plegament="" i="" va="" augmentar="" l'arnm="" de="" p53="" i="" bcl-2="" expressió="" per="" 24="" i="" 4.2-fold,="" respectivament="" (fig.="" 2).="" rve="" va="" mitigar="" considerablement="" (p=""><0.05) l'expressió="" d'arnm="" de="" nqo1,="" p53="" i="" bcl-2="" de="" manera="" dependent="" de="" la="" dosi="" (figura="" 2).="" en="" comparació="" amb="" l'únic="" grup="" tractat="" amb="" cisplatí,="" l'expressió="" de="" l'arnm="" de="" nqo1="" es="" va="" incrementar="" en="" 3,57,="" 6,36="" i="" 9,28-="" vegades="" a="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectivament="" (fig.="" 2a).="" de="" nou,="" l'expressió="" d'arnm="" de="" p53="" es="" va="" reduir="" en="" 0,="" 63,="" 0,="" 46="" i="" 0,="" 21-="" vegades="" a="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectivament="" (figura="" 2b).="" l'expressió="" d'arnm="" de="" bcl-2="" també="" es="" va="" reduir="" en="" 0,="" 71,="" 0,="" 40="" i="" 0,="" 32-="" vegades="" a="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve,="" respectivament="" (figura="" 2c).="" però,="" no="" es="" van="" trobar="" canvis="" significatius="" (p=""> 0, 05) en el nivell d'expressió dels gens NQO1, p53 i Bcl-2 a causa del tractament amb RVE (Fig. 3).
H2O2assaig de mesura
En l'assaig de mesura de H2O2, l'H2O2El nivell es va considerar proporcional a la luminescència. L'administració de cisplatí significativament (p <{{0}}.05) va="" augmentar="" el="" nivell="" d'h2o2="" en="" 2.2-="" vegades="" (fig.="" 4).="" el="" tractament="" amb="" rve="" va="" disminuir="" considerablement="" (p=""><{13}}.05) el="" nivell="" d'h2o2="" en="" 0,25,="" 0,38="" i="" 0,49-="" vegades="" a="" 125,="" 250="" i="" 500="" ug/ml,="">
Anàlisi GC-MS
Un total de 10 compostos (taula 4 i figura 5) incloent "Isoborneol, pentametildisilanil èter (alcohol sesquiterpè)", "Timina (nucleobase de pirimidina)", "4H-Py-ran-4-un, {{{{ 8}}dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil- (saponina)", "Àcid hexadecanoic, èster metílic (èster metílic d'àcids grassos)", "9,12- Àcid octadecadienoic, èster metílic (èster metílic d'àcids grassos)", "9-Àcid octadecenoic (Z)-, èster metílic (èster metílic d'àcids grassos)", "Estearat de metil (èster metílic d'àcids grassos)", "Ftalat de diisooctil (èster)", "13-Docosenamida, (Z)- (alcaloide)" i "Esqualè (triterpè)" es van detectar en RVE.
Beneficis de cistanche tubolosa: reducció de lípids en sang
Discussió
Els antioxidants naturals i sintètics s'han estudiat exhaustivament i s'han revelat que són funcionals per a la prevenció o la millora de la toxicitat en la fisiologia animal [31]. Els suplements antioxidants són el component desenvolupat per síntesi química o per extracció d'aliments naturals, però aquests no són idèntics en composició als antioxidants disponibles en els aliments [5]. Per tant, les opinions estan separades amb el temps si els antioxidants sintètics ofereixen o no beneficis per a la salut similars als antioxidants naturals [32]. S'acosta la necessitat de disminuir l'ús de suplements antioxidants sintètics i buscar fonts alternatives, barates, renovables, naturals i possiblement més segures d'antioxidants naturals efectius.
Un dels mecanismes més importants és la via del factor nuclear eritroide-2 relacionat amb el factor-2 (Nrf2) que generalment protegeix les cèl·lules de l'estrès oxidatiu induït per estressors exògens o endògens [27]. Els antioxidants efectius indueixen l'expressió de Nrf2, que es mou encara més al nucli i s'uneix a l'element de resposta antioxidant (ARE) que provoca l'expressió del gen antioxidant i desintoxicant de fase II NQO1 [33, 34]. NQO1 s'expressa àmpliament i diferencialment d'una manera específica del teixit. NQO1 és una flavoproteïna antioxidant citosòlica que catalitza la 2-reducció d'electrons de quinones a hidroquinones, donant lloc a la desintoxicació dels electròfils i a l'anticipació del cicle redox [35]. Segons un estudi anterior [36], -lapachone activa NQO1, que augmenta encara més el nivell de NAD més intracel·lular i protegeix el ronyó de lesions agudes induïdes pel cisplatí.
Se sap que el cisplatí va provocar danys a la membrana de filtració glomerular a través de l'estrès oxidatiu, la inflamació i l'apoptosi que en conjunt condueixen a una taxa de filtració glomerular reduïda i a la pèrdua de la permeabilitat normal de la membrana [37]. Per tant, el nivell de creatinina sèrica va augmentar. La creatinina sèrica és un dels possibles marcadors de funcionalitat renal. El tractament amb cisplatí va augmentar el contingut de MDA al teixit renal, que és un producte secundari de la peroxidació lipídica i aquest informe és constant amb estudis anteriors [27, 35, 37, 38]. El tractament amb RVE va reduir significativament el contingut de MDA al teixit renal. Al mateix temps, el nivell de creatinina també es va reduir, indicant l'efecte millorador de l'RVE.
A més, l'expressió NQO1 es va reduir significativament i l'expressió p53 i Bcl-2 es va incrementar significativament després de l'exposició al cisplatí. Pel que fa a l'expressió de NQO1 i p53 in vivo, el nostre resultat és coherent amb un estudi previ [13]. Un estudi recent [39] va demostrar que el cisplatí va disminuir significativament l'expressió de Bcl-2 al ronyó de ratolins, però sorprenentment vam trobar una expressió elevada. Aquesta diferència pot ser el resultat de la diferència de dosi [40], ja que Mohamed i els seus col·legues [39] van utilitzar 8 mg/kg durant 12 dies, mentre que nosaltres vam utilitzar 2,5 mg/kg durant només 5 dies. Un altre estudi [41] va afirmar que el cisplatí pot augmentar l'expressió de Bcl-2 a una dosi quan no és citotòxic. De nou, l'augment de l'expressió de Bcl-2 sensibilitza les cèl·lules cap a l'estrès oxidatiu [40].
No obstant això, l'expressió de p53 és baixa en condicions fisiològiques normals, però s'espera que es pugui regular una vegada tractat amb cisplatí perquè aquest agent quimioterapèutic basat en platí activa la via apoptòtica dependent de p53. Un cop vam tractar els ratolins amb cisplatí, p53 va augmentar significativament en els ronyons dels ratolins en comparació amb el control. Un altre proto-oncogen Bcl-2 també es correlaciona amb el nivell d'expressió NQO1. Imitant l'expressió p53, també vam trobar que els nivells de Bcl- 2 van augmentar amb el tractament amb cisplatí, però es van recuperar significativament amb el tractament amb RVE. Això és possible, en resposta a l'estrès oxidatiu, el gen p53 s'activa i provoca l'aturada del cicle cel·lular, la senescència o l'apoptosi [6]. Amb la desintoxicació, sovint es considera que la sobreexpressió de NQO1 està correlacionada amb l'apoptosi a les cèl·lules canceroses [10], tot i que el mecanisme subjacent de l'apoptosi i la sobreexpressió de NQO1 encara és controvertit. A més, en el carcinoma hepatocel·lular, la sobreexpressió de NQO1 disminueix l'expressió Bcl-2 [10]. El proto-oncogen Bcl- 2 també té p53 com la correlació amb l'expressió NQO1. p53 és un factor de transcripció específic de la seqüència que s'activa per nombrosos tipus d'estrès cel·lular [42], mentre que la sobreexpressió de Bcl-2 va actuar com a estabilitzador de porus mitocondrial per facilitar l'alliberament de citocrom-c a l'estrès oxidatiu [12]. En el nostre cas, vam comprovar ambdues respostes gèniques amb tractament amb cisplatí en teixit renal normal i vam trobar la seva expressió augmentada. El tractament amb RVE va revertir l'expressió de p53 i Bcl-2 gairebé normal de manera dependent de la dosi. Aquest tipus d'abrogació d'expressió Bcl-2 també es va mostrar mitjançant l'eliminador de ROS Trolox [43]. A més, el nivell d'H2O2 també va augmentar notablement a les cèl·lules HK-2 a causa del tractament amb cisplatí in vitro. Després del tractament amb RVE, el nivell d'H2O2 es va restaurar significativament a la normalitat. Això potser es deu a l'efecte del tractament RVE que va augmentar l'expressió de NQO1 [44], que exerceix protecció contra l'estrès oxidatiu [6].
El cromatograma GC-MS va confirmar l'existència de deu compostos en RVE. Entre aquests, "4H-Pyran- 4-un, 2, 3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-", "Àcid hexadecanoic" i " L'esqualè" són antioxidants coneguts [45–47]. Aquests tres compostos en conjunt possiblement van exercir un efecte nefroprotector sinèrgic. Estudis anteriors també van informar sobre la inducció de l'expressió de NQO1 per la vitamina A [48], la vitamina C [49], la vitamina E [50], els flavonoides [51] i els polifenols [50]. Per tant, aquest informe suggereix dilucidar si aquest extracte en particular conté alguna cosa entre vitamina A, vitamina C, vitamina E, flavonoides i polifenols, o no.
Conclusió
La troballa general suggereix que RVE és fisiològicament eficaç per protegir els ronyons dels danys induïts pel cisplatí. Per tant, és crucial dilucidar els compostos exactes responsables de mitigar la nefrotoxicitat induïda per cisplatí que poden arribar a ser beneficioses per a l'aplicació humana.
extracte de cistanche tubolosa
Agraïments
Els autors agraeixen al Consell d'Investigació Científica i Industrial de Bangla Desh (BCSIR), la branca de Rajshahi, per oferir suport de laboratori per quantificar l'ARN.
Aportacions dels autors
MMH va realitzar disseny experimental, experimentació, anàlisi i preparació de dades, redacció i edició de manuscrits, revisió i redacció de manuscrits; MST i MME van fer experimentació i anàlisi de dades; AME & MAR van contribuir en supervisió i recursos; AH va ser responsable de la conceptualització, la supervisió, els recursos i l'edició de manuscrits. Tots els autors
revisat el manuscrit. Els autors van llegir i aprovar el manuscrit final.
Finançament
El treball actual va ser finançat pel número de projecte de suport als investigadors de la Universitat de Taif (TURSP - 2020/75), Universitat de Taif, Taif, Aràbia Saudita.
Disponibilitat de dades i materials.
Totes les dades rellevants estan disponibles i es poden facilitar a petició de l'autor corresponent.
Declaracions
Aprovació ètica i consentiment per participar
L'ètica per dur a terme aquest experiment va ser aprovada pel Comitè Institucional d'Animals, Ètica Mèdica, Bioseguretat i Bioseguretat (IAMEBBC), Institut de Ciències Biològiques (IBSc), Universitat de Rajshahi, i es va proporcionar amb la nota número 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Tots els mètodes es van dur a terme d'acord amb les directrius i les normatives proporcionades pel comitè d'ètica esmentat anteriorment. Aquest estudi es va realitzar d'acord amb les directrius ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). El "consentiment per participar" no és aplicable a aquest estudi.
Detalls de l'autor
1 Laboratori de Biologia Molecular i Ciència de Proteïnes, Departament d'Enginyeria Genètica i Biotecnologia, Facultat de Ciències de la Vida i de la Terra, Universitat de Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangla Desh. 2 Laboratori de Patologia Molecular, Institut de Ciències Biològiques, Universitat de Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangla Desh. 3Departament de Biotecnologia, Facultat de Ciències, Universitat de Taif, PO Box 11099, Taif 21944, Aràbia Saudita. 4Departament de Genètica, Facultat d'Agricultura, Universitat d'Alexandria, Alexandria 21545, Egipte.
Referències
1. Bagchi K, Puri S. Radicals lliures i antioxidants en salut i malaltia: una revisió. East Mediterr Health J. 1998;4:350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH, et al. El ferulat, un component actiu del germen de blat, millora el desequilibri PTK/PTP induït per l'estrès oxidatiu i la inactivació de PP2A. Toxicol Res. 2018;34(4):333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Alguns perfils genètics al fetge de ratolins portadors de tumors d'ascites d'Ehrlich sota l'estrès de la irradiació. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY, et al. Implicació de l'estrès oxidatiu en la recaiguda de la leucèmia mieloide aguda. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Radicals lliures, antioxidants en malalties i salut. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Rols de NAD (P) H-quinona oxidoreductasa 1 (NQO1) en la progressió del càncer i la quimioresistència. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: quinona oxidoreductasa 1 (NQO1) en la sensibilitat i resistència a les quinones antitumorals. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: oxidoreductasa acceptora de quinona 1 (NQO1), un enzim antioxidant multifuncional i una citoprotecció excepcionalment versàtil. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP, et al. Inhibició del dicumarol del NADPH: la quinona oxidoreductasa indueix la inhibició del creixement del càncer de pàncrees mitjançant un mecanisme mediat per superòxid. Càncer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. La sobreexpressió de NAD (P) H: la quinona oxidoreductasa 1 inhibeix la proliferació de cèl·lules del carcinoma hepatocel·lular i l'apoptosi induïda mitjançant l'activació de la via AMPK/PGC-1. ADN Cel·lular Biol. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. La supressió de la NAD (P) H-quinona oxidoreductasa 1 va millorar la susceptibilitat de les cèl·lules de colangiocarcinoma als agents quimioterapèutics. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1–13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatí en la teràpia del càncer: mecanismes moleculars d'acció. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Alylmercaptocysteine atenua la nefrotoxicitat induïda pel cisplatí mitjançant la supressió de l'apoptosi, l'estrès oxidatiu i la inflamació. Nutrients. 2017;9(2):166.
14. Matkowski A. Cultiu de plantes in vitro per a la producció d'antioxidants: una revisió. Biotecnologia Adv. 2008;26(6):548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Activitat antioxidant de Rumex vicario L. en l'etapa vegetativa de creixement. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) a Austràlia: una reconsideració. Nuitsia. 1984;5:75–122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: activitat inductora de la quinona oxidoreductasa 1 d'algunes plantes medicinals de l'Aràbia Saudita. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Un perfil de compostos bioactius de Rumex vicario L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde- Filho PF, et al. Fonts de carotens alfa, beta, gamma, delta i èpsilon: una revisió del segle XX. Rev Bras. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Cribratge fitoquímic, activitat antioxidant i antibacteriana in vitro de l'extracte vicari de Rumex L.. Res. de l'estudi científic: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.