per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef ³, Harold Taeter⁴, Tomas Norton⁴, Pieter Baatsen ⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte ⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²i Elena Levtxenko^1,*

^{Part I: Manifestacions renals i extrarenals en peixos zebra adults model de cistinosi}

¹Laboratori de Nefrologia Pediàtrica, KU Leuven, 3000 Leuven, Bèlgica; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Departament de Patologia, Centre Mèdic de la Universitat de Leiden, 2300 RC Leiden, Països Baixos; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Grup de recerca en desenvolupament i regeneració de circuits neuronals, KU Leuven, 3000 Leuven, Bèlgica; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Grup de M3-BIORES, Divisió d'Enginyeria de Salut Animal i Humana, KU Leuven, 3000 Leuven, Bèlgica; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Neurobiologia molecular, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Bèlgica; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Departament de Medicina Pediàtrica, Unitat de Laboratori de Bioquímica Metabòlica, Hospital Infantil Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Roma, Itàlia; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Laboratory for Molecular Biodiscovery, KU Leuven, 3000 Leuven, Bèlgica; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Departament de Nefrologia Pediàtrica, Centre Mèdic de la Universitat de Radboud, 6525 GA Nijmegen, Països Baixos

^*Correspondència: elena.levtchenko@uzleuven.be; Tel.: més 32-16-34-38-22

^† Aquests autors han contribuït per igual a aquest treball.

Resum:Cistinosiés una malaltia rara, incurable i autosòmica recessiva causada per mutacions en el gen CTNS. Aquest gen codifica la cistinosi transportadora de cistina lisosomal, donant lloc a l'acumulació de cistina lisosomal a totes les cèl·lules del cos, sent els ronyons els primers òrgans afectats. El tractament actual amb cisteamina disminueix l'acumulació de cistina però no reverteix la disfunció tubular proximal, la lesió glomerular o la pèrdua derenalfunció. En el nostre estudi anterior, hem desenvolupat un model de cistinosi de peix zebra mitjançant una mutació sense sentit en el gen CTNS i hem demostrat que les larves de peix zebra recapitulen elronyófenotip descrit en humans. En l'estudi actual, hem caracteritzat l'adultcistinosimodel de peix zebra i va avaluar els efectes a llarg termini de la malaltiaronyói extrarenals òrgans mitjançant estudis bioquímics, histològics, de fertilitat i d'activitat locomotora. Hem trobat que l'adultcistinosiEl peix zebra presenta acumulació de cistina en diversos òrgans, alteració de la morfologia renal, alteració de la pigmentació de la pell, disminució de la fertilitat, alteració de l'activitat locomotora i anomalies oculars. En general, les nostres dades indiquen que l'adultcistinosiEl model de peix zebra reprodueix diversos fenotips humans de cistinosi i pot ser útil per estudiar la fisiopatologia i els efectes a llarg termini de noves teràpies.

Paraules clau:ronyómalaltia;cistinosi; model de peix zebra;renali extrarenals manifestació; Característiques fenotípiques de l'adult

1. Introducció

Cistinosiés un trastorn d'emmagatzematge autosòmic recessiu causat per mutacions en el gen CTNS que codifica la cistinosi cotransportadora de protons de la cistina lisosomal, transportant la cistina des del lumen lisosomal fins al citosol. Diversos òrgans estan implicats en la malaltia, com els músculs, els testicles, els ulls i el cervell, i entre tots,ronyonssón els primers òrgans i els més greument afectats [1]. La variant clínica més freqüent i greu és la nefropàtica infantilcistinosi, en què la primera manifestació clínica és larenalSíndrome de Fanconi, caracteritzat per una cèl·lula epitelial tubular proximal deteriorada

reabsorció (PTE) que resulta en la pèrdua urinària d'aminoàcids, glucosa, proteïnes de baix pes molecular a intermedi i altres metabòlits. El dany del PTEC va seguit d'una disfunció glomerular progressiva i, quan no es tracta, condueix a la fase final.ronyómalaltia [1]. L'enfocament terapèutic actual consisteix en cisteamina, que és un aminotiol que esgota la cistina que trenca el pont disulfur de la cisteïna, donant lloc a la formació d'aminoàcids cisteïna i un disulfur mixt de cisteamina-cisteïna. Aquesta darrera molècula pot sortir dels sosomes mitjançant el transportador d'aminoàcids PQLC2 [2]. Tanmateix, el tractament amb cisteamina, tot i que disminueix l'acumulació de cistina lisosomal, només retarda la progressió de la malaltia [3–5]. Per tant, una major comprensió de la patogènesi decistinosii el desenvolupament de noves opcions rapèutiques encara estan a l'agenda de la investigació. S'han desenvolupat diversos models animals per tal de recapitular el fenotip de cistinosi [6,7]. Un dels models més utilitzats és el ratolí Ctns−/− C57BL/6, que desenvolupa acumulació de cistina i tubulopatia proximal lleu. Tanmateix, no mostra danys glomerulars i s'ha trobat que el fenotip depèn del fons genètic [8].

Fins ara, els models de peix zebra s'han convertit en una eina atractiva per investigar malalties humanes a causa de diversos avantatges com el seu desenvolupament ràpid, alta fecunditat, menor cost de manteniment i la disponibilitat de tecnologies d'edició de gens fàcilment aplicables [9]. En un estudi anterior, vam presentar un model de larves de peix zebra congènic amb una mutació homozigota sense sentit a l'exó 8 del gen ctns-/-, que va provocar una pèrdua funcional de cistinosi [10], que va provocar un augment de l'acumulació de cistina a tot el cos. deformitat de les larves, desenvolupament retardat ironyódany. Tanmateix, fins ara no s'han estudiat les conseqüències de la malaltia a llarg termini en els peixos zebra adults. En el present estudi, hem volgut caracteritzarrenali manifestacions extrarenals en el model de peix zebra adult decistinosi.

Feu clic a OrgànicCistanche per a la malaltia renal

2. Resultats

2.1. La cistina s'acumula en Ctns−/− peix zebra

CistinosiEs considera un trastorn multisistèmic que provoca l'acumulació de cistina a totes les cèl·lules del cos. En el nostre treball anterior, vam trobar que el peix zebra de cistinosi (ctns-/-) mostra una acumulació de cistina a partir de l'etapa de desenvolupament larvari i en diversos òrgans fins als 8 mesos [9]. Per avaluar si el nostre model manté l'acumulació de cistina en les etapes posteriors de la malaltia, hem mesurat els nivells de cistina a tot el cos,ronyó, testicles, ulls, músculs i cervell en 18-mesos ctns−/− peixos zebra en comparació amb peixos zebra mascles de tipus salvatge de l'edat. Hem trobat un augment de 54- vegades en el contingut de cistina a tot el cos (figura 1A) i un augment de 146- vegades al ronyó (figura 1B) del peix zebra ctns-/- en comparació amb el peix zebra de tipus salvatge. A més, vam observar una gran acumulació de cistina al testicle, els ulls, el múscul i el cervell (figura 1C-F) en ctns-/- peix zebra.

2.2. Manifestació renal

2.2.1. Ctns−/− El peix zebra presenten danys PTEC

Des delronyóés l'òrgan més greument afectat, vam examinar les característiques histològiques del ronyó mitjançant la tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) i periòdica d'àcid-shiff (PAS). Hem observat la presència d'inflor ennuvolada, gotes eosinòfiles semblants a hialines i vacúols citoplasmàtics al PTEC de ctns -/- peix zebra (figura 2B, D), però no en peix zebra de tipus salvatge (figura 2A, C). Cal destacar que no es va trobar cap dany tubular distal. Els cristalls de cistina es van observar prèviament a PTEC com a vacúols citoplasmàtics amb formes rectangulars o polimorfes [11]. Per tant, vam investigar si aquestes estructures també estaven presents en túbuls de peix zebra. Hem trobat nombrosos vacúols citoplasmàtics al PTEC del peix zebra ctns-/- mitjançant la tinció de blau de toluidina (figura 3B, D, indicada amb asteriscs). A més, hem trobat espai vacuolar amb formes rectangulars o polimorfes (figura 3B, D, indicada amb puntes de fletxa). Vam confirmar aquesta troballa mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) (figura 3F). Aquestes estructures no estaven presents al PTEC del peix zebra de tipus salvatge (figura 3A, C, E). Curiosament, a més de la presència de vacúols amb forma polimorfa, vam observar una pèrdua parcial de la vora del raspall a la ultraestructura PTEC (figura 3F).

Figura 1. Contingut de cistina en homogeneïtats de peix zebra de tipus salvatge i ctns−/−. (A–F) Contingut de cistina a tot el cos (A),ronyó(B), testicles (C), ulls (D), múscul (E) i cervell (F) en peix zebra mascle de tipus salvatge i ctns−/− 18-mes d'edat. La concentració de cistina s'expressa en nmol/mg de proteïna. Cada punt representa un peix zebra, per a un total de n=3 tipus salvatge i n=3 cèntims−/− 18-pesix zebra mascle d'un mes; prova t sense aparellament amb correcció de Welch, de dues cues: * p < 0,05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Figura 2.Ronyóhistologia en peixos zebra de tipus salvatge i ctns−/−. (A, B) Imatges representatives derenaltúbuls de tipus salvatge (A) i ctns−/− (B) 18-peix zebra d'un mes. Detalls dels túbuls proximals amb gotes eosinòfiles semblants a hialines (puntes de fletxa negre) i vacúols citoplasmàtics (*). Tinció H&E. Les barres d'escala representen 50 µm. (C, D) Imatges representatives de la tinció de PAS de túbuls renals de tipus salvatge (C) i ctns-/- (D) 18- peix zebra d'un mes. Detalls de túbuls proximals amb gotes semblants a hialines (puntes de fletxa negre) i vacúols citoplasmàtics (*). Tinció de PAS. Les barres d'escala representen 50 µm. PT: túbul proximal; DT: túbul distal.

Figura 3.Ronyócristalls de cistina en PTEC de peix zebra de tipus salvatge i ctns-/-. (A, B) Imatges representatives de blau de toluidinarenaltúbuls proximals en peix zebra de tipus salvatge (A) i ctns-/- (B) 18-mes d'edat. Les barres d'escala representen 50 µm. (C, D) Les figures 3C, D mostren una ampliació més alta de la figura 3A, B. Detalls dels túbuls proximals renals amb vacúols citoplasmàtics ((D); *), espais vacuolars rectangulars i polimorfs ((D); puntes de fletxa negre). (E, F) Imatges TEM representatives del túbul proximal renal del peix zebra de tipus salvatge (E) i ctns-/- 18- d'un mes (F). (F) Es va observar una pèrdua parcial de les vores del raspall del túbul proximal (PB) i l'acumulació de vacúols rectangulars i polimorfs (*) al túbul proximal renal del peix zebra ctns-/-. La vista d'alta magnificació del rectangle a la cantonada inferior dreta mostra els vacúols polimorfs i un vacúol gran amb segments rectes de vora de membrana (una línia recta). Les barres d'escala representen 5 µm.

2.2.2. Ctns−/− Mostra hipertròfia glomerular del peix zebra

Com que el dany glomerular sol seguir les lesions PTEC, vam avaluar la histologia glomerular dels peixos zebra -/- i vam observar que els peixos malezebra mostraven un augment significatiu de la càpsula de Bowman (Figura 4B, E) i el tuf glomerular (Figura 4B, F'B), però no (Figura 4B, F'B). , G) en comparació amb el peix zebra mascle de tipus salvatge (figura 4A, E-G). El mateix es va confirmar per al glomerulartuf en peixos zebra femella que portaven la mutació ctns-/- (figura 4F) i es va observar una tendència similar en les mesures de l'espai de Bowman i la càpsula de Bowman (figura 4E, G). No es va observar proliferació de cèl·lules mesangials ni glomeruloesclerosi. A les imatges TEM, no vam observar alteracions a la membrana basal glomerular, l'esborrament del procés del peu del podòcit o les cèl·lules endotelials fenestrades anormalment als glomèruls del peix zebra ctns-/- (figura 4D) en comparació amb el peix zebra de tipus salvatge (figura 4C).

Figura 4. Morfologia glomerular en peix zebra de tipus salvatge i ctns−/−. (A, B) Imatges representatives del glomèrul de tipus salvatge (A) i ctns-/- (B) 18- peix zebra d'un mes. Tinció de PAS. Les barres d'escala representen 50 µm. (C, D) Imatges TEM representatives del glomèrul del peix zebra de tipus salvatge (ctns-/- (D). Les barres d'escala representen 1 µm. (E-G) La quantificació de les àrees superficials de la càpsula de Bowman (E), floc glomerular (F) i espai de Bowman (G) de tipus salvatge i peix zebra en ambdós gèneres.

2.2.3. Ctns−/− El peix zebra mostra un augment de l'apoptosi a nivell de PTEC

A continuació, vam investigar sicistinosiva provocar la mort cel·lular al nostre model de peix zebra [10, 12]. Hem realitzat una immunotinció de caspasa-3 escindida a larenalteixits de peix zebra de tipus salvatge i ctns-/- i vam observar un augment significatiu dels nivells de proteïna caspasa3 escindida en PTEC de peix zebra ctns-/- (figura 5B, D, G) en comparació amb el peix zebra de tipus salvatge (figura 5A, C, G) en ambdós gèneres. L'expressió de la caspasa escindida -3 estava present principalment a les cèl·lules que mostraven els vacúols citoplasmàtics polimorfs (figura 5B, D). No hi havia cap expressió de caspasa escindida -3 als glomèruls, tant en peix zebra de tipus salvatge com en ctns-/- (figura 5E, F).

Figura 5. Augment de l'apoptosi en PTECs amb vacúols en ctns-/- peix zebra. (A, B) Imatges representatives de la caspasa escindida -3 immunotinció de túbuls de peix zebra antic de tipus salvatge (A) i ctns. Les barres d'escala representen 50 µm. (C,D) Els panells inferiors mostren una major ampliació de les zones encaixades als panells superiors. Detalls de PTEC amb vacúols citoplasmàtics (*). Les barres d'escala representen 50 µm. (E, F) Imatges representatives de la caspasa escindida -3 immunotinció del glomèrul de tipus salvatge (E) i ctns-/- (F) 18- peix zebra d'un mes. Les barres d'escala representen 50 µm. (G) La quantificació de l'àrea positiva de tinció de caspasa tubular-3 en tipus salvatge i peix zebra en ambdós gèneres. Cada punt representa un peix zebra, per a un total de n=3 tipus salvatge i ctns−/− 18-pesix zebra d'un mes. ANOVA bidireccional amb prova de diferència menys significativa de Fisher (PLSD): ** p <0,01; ***="" p=""><>

2.3. Manifestacions extra renals

2.3.1. Ctns−/− El peix zebra mostra un patró característic de la pell amb taques hipopigmentades

Cistinosiels pacients solen mostrar un envelliment prematur de la pell, hipopigmentació i cabell ros [1,13]. Curiosament, vam observar un patró tacat hipopigmentat de la pell del peix zebra ctns-/-, mentre que els peixos de tipus salvatge presentaven el típic patró de ratlles negres. El fenotip està present en ambdós gèneres durant tota la seva vida (figura 6A, B). Per investigar la diferència de pigmentació, vam realitzar una tinció de PAS a la pell del peix zebra i vam trobar que el peix zebra ctns -/- mostrava una distribució alterada de la capa de melanina a l'epidermis, cosa que va provocar el patró de taques de llum (figura 6C, D).

Figura 6. Patró de pell tacada hipopigmentada en ctns−/− peix zebra. (A, B) Imatges representatives de tipus salvatge (A) i ctns-/- (B) 18- peix zebra d'un mes. Les barres d'escala representen 0,5 cm. Les puntes de fletxa negre indiquen els diferents patrons de pell ratllada. (C, D) Imatges tacades de PAS de l'epidermis del peix zebra de tipus salvatge (C) i ctns-/- (D) 18- d'un mes. Les puntes de fletxa negre destaquen la capa de melanina. La interrupció de la capa de melanina està present a ctns-/- (D) mentre que està absent en el peix zebra de tipus salvatge (C). Les barres d'escala representen 50 µ

2.3.2. Ctns−/− El peix zebra mostra quists espermatogènics enriquits en espermatozoides

Cistinosise sap que afecta les funcions testiculars, donant lloc a azoospèrmia i infertilitat en pacients masculins [14–16]. L'origen de l'azoospèrmia encara no està clar, tot i que s'ha demostrat que l'espermatogènesi està intacta a nivell testicular. En contrast amb els pacients masculins, les dones amb cistinosi són fèrtils [17]. En el nostre model de peix zebra, tant els peixos zebra femenins com els mascles -/- són fèrtils. Per investigar si la mutació ctns−/− afecta l'anatomia del testicle, hem realitzat una tinció de PAS i hem trobat una acumulació d'espermatozoides augmentada en els quists espermatogènics en ctns−/− peix zebra.

Figura 7. Quistes espermatogènics enriquits en espermatozoides en ctns−/− peix zebra. (A, B) Imatges representatives tenyides d'H&E de testicles de tipus salvatge (A) i ctns-/- (B) 18- peix zebra d'un mes. La tinció blava fosc i arrodonida representen els espermatozoides acumulats en els quists espermatogènics (indicats amb asteriscs). Les barres d'escala representen 200 µm.

2.3.3. Ctns−/− Les femelles de peix zebra mostren una disminució de la producció d'ous

Per investigar la funcionalitat del sistema reproductor, vam mesurar la producció d'ous i el percentatge d'ous fecundats tant en peix zebra de tipus salvatge com en ctns-/-. Vam trobar que les femelles ctns-/- mostren una disminució de la producció d'ous (figura 8A) i un percentatge reduït d'ous fecundats (figura 8B) en comparació amb les femelles de tipus salvatge.

Figura 8. Producció d'ous i percentatge d'ous fecundats en peixos zebra de tipus salvatge i ctns−/−. (A) La producció d'ous es va mesurar com a nombre total d'ous de tipus salvatge i ctns -/- peix zebra 18- peix zebra d'un mes. La taxa de producció d'ous és d'1,941 alta en el peix zebra de tipus salvatge en comparació amb el peix zebra ctns-/- de 18 mesos (proporció de taxa=1,941); IC del 95 per cent (límit inferior=1,165, límit superior=3,234); Anàlisi de regressió de Poisson; p=0.011. (B) Es va mesurar el percentatge d'ous fecundats sobre el nombre total d'ous. Les probabilitats dels ous fecundats són de 3,504 altes en el peix zebra de tipus salvatge en comparació amb el peix zebra ctns−/− 18-mesos d'edat (odds ratio=3,504); IC del 95 per cent (límit inferior=2,005, límit superior=6,124); Anàlisi de regressió logística; p <0,001; n/a:="" no="">

2.3.4. Ctns−/− El peix zebra mostra una disminució de l'activitat locomotora

Atès que s'ha diagnosticat la pèrdua muscular i la debilitatcistinosipacients, generalment de la segona dècada de la vida [1,18], vam avaluar l'activitat locomotora en el nostre model de peix zebra. Vam descobrir que el peix zebra ctns -/- d'ambdós gèneres mostrava una disminució de l'activitat locomotora en comparació amb el peix zebra de tipus salvatge, cosa que suggereix una funció muscular deteriorada (figura 9). Tanmateix, l'anàlisi histològica del teixit muscular esquelètic no va revelar anomalies aparents en ctns-/- peix zebra.