Progressos de la investigació i aplicacions dels anticossos de proteïnes fluorescents: una revisió centrada en nanocossos

Resum: Des del descobriment de les proteïnes fluorescents (FP), els seus rics espectres de fluorescència i propietats fotoquímiques han promogut aplicacions de recerca biològica generalitzades. Els FP es poden classificar en proteïna fluorescent verda (GFP) i els seus derivats, proteïna fluorescent vermella (RFP) i els seus derivats i FP d'infraroig proper. Amb el desenvolupament continu dels FP, han sorgit anticossos dirigits als FP. L'anticossos, una classe d'immunoglobulines, és el component principal de la immunitat humoral que reconeix i s'uneix explícitament els antígens. L'anticòs monoclonal, originari d'una única cèl·lula B, s'ha aplicat àmpliament en immunoassaig, diagnòstic in vitro i desenvolupament de fàrmacs. El nanobody és un nou tipus d'anticossos compost completament pel domini variable d'un anticòs de cadena pesada. En comparació amb els anticossos convencionals, aquests nanocossos petits i estables es poden expressar i funcionar a les cèl·lules vives. A més, poden accedir fàcilment a solcs, costures o epítops antigènics ocults a la superfície de l'objectiu. Aquesta revisió ofereix una visió general de diversos FP, el progrés de la investigació dels seus anticossos, especialment els nanocossos, i les aplicacions avançades de nanocossos dirigits als FP. Aquesta revisió serà útil per a més investigacions sobre nanocossos dirigits als FP, fent que els FP siguin més valuosos en la investigació biològica.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Paraules clau: proteïna fluorescent; anticossos monoclonals; nanobody; progrés de la recerca; aplicació

1. Introducció

La proteïna fluorescent (FP) és la proteïna d'eina més utilitzada en la investigació biomèdica. Després de l'augment de l'ús de FP, també s'han desenvolupat anticossos de FP. En comparació amb l'anticossos tradicional (figura 1A), els anticossos de cadena pesada (HCAb) del camèlid (figura 1B) i els nous receptors d'antígens d'immunoglobulina (IgNAR) dels taurons (figura 1C) naturalment no tenen cadenes lleugeres. L'anticòs d'un domini únic (sdAb) és un anticòs format completament per dominis variables de HCAb o IgNAR. El seu pes molecular és de 12-15 kDa, que és aproximadament 1/10 de la mida d'un anticòs monoclonal; per tant, també es coneix com a nanocos. El nanobody, amb una mida més petita, alta estabilitat contra l'àcid i la calor, una forta capacitat de penetració, facilitat d'enginyeria i expressió genètica i alta afinitat, ha estat aplicat en diversos camps per investigadors científics. Pot accedir fàcilment a solcs, costures o epítops antigènics ocults a la superfície de l'objectiu, reconeixent molts antígens que els anticossos convencionals no poden reconèixer [1]. Per tant, els nanocossos s'han utilitzat com a biomolècules en organismes i sistemes de cultiu cel·lular en biologia del desenvolupament, chaperones cristal·lines per a l'estat conformacional en biologia estable, reguladors o inhibidors de l'activitat enzimàtica, reactius immunohistoquímics per a anàlisis bioquímiques i anticossos secundaris en immunoblotting i immunofluorescència [2]. –6]. Els nanocossos que s'uneixen específicament a la FP s'utilitzen àmpliament en la localització subcel·lular, estudis de vies de senyalització intracel·lular, imatges de cèl·lules vives i nanomaterials dirigits [7–9]. En particular, els nanocossos tenen avantatges únics respecte als anticossos IgG tradicionals en imatges d'alta resolució.

Figura 1. Esquemes d'estructura d'IgG (A), HCAb de camèlids (B) i IgNAR de tauró (C). VH, la regió variable de la cadena pesada; VL, la regió variable de la cadena lleugera; CH/C, la regió constant de la cadena pesada; CL, la regió constant de la cadena lleugera; VHH, el domini variable de HCAb; VNAR, el domini variable d'IgNAR.

2. Visió general de les proteïnes fluorescents

2.1. El descobriment de proteïnes fluorescents

La luminescència és un fenomen comú en els invertebrats marins. Els celenterats, incloses les meduses, la hidra i el corall, emeten fluorescència verda sota llum ultraviolada (UV) o blava, mentre que els ctenòfors emeten fluorescència blava. La proteïna fluorescent verda (GFP) es va identificar per primera vegada a Aequorea victoria per Shimomura et al. el 1962 [10], i després clonat i expressat el 1985 [11]. Les propietats úniques i l'estructura estable de la GFP de tipus salvatge (wtGFP) han atret, en conseqüència, molts investigadors a estudiar-la. Des de llavors, basant-se en el coneixement existent i la seva estructura cristal·lina, Tisen i els seus col·legues van generar diverses proteïnes GFP amb diferents propietats fluorescents per mutació i van elaborar el mecanisme de luminescència de GFP [12]. Pel que fa a la investigació relacionada amb la GFP, tres científics (Shimomura, Chalfie i Tsien) van guanyar el Premi Nobel de Química 2008 per descobrir la GFP i les seves contribucions destacades a la seva aplicació.

La proteïna fluorescent vermella ancestral (RFP), és a dir, DsRed, es va clonar a partir de coralls d'escull no bioluminescents el 1999 [13]. RFP es pot utilitzar juntament amb GFP per resoldre problemes científics que GFP per si sol no pot resoldre. El més important és que a causa del baix rerefons de RFP en imatges intracel·lulars, és més adequat per a aplicacions en investigació en biociència [14,15]. Amb els esforços de molts científics, s'ha informat que els espectres de fluorescència dels FP cobreixen tota la regió visible i fins i tot la regió de l'infraroig proper, proporcionant una gran quantitat d'eines per visualitzar i quantificar proteïnes a les cèl·lules vives [16]. La figura 2 resumeix el desenvolupament dels FP.

Figura 2. El desenvolupament de proteïnes fluorescents. GFP, proteïna fluorescent verda; BFP, proteïna fluorescent blava; EGFP, proteïna fluorescent verda millorada; YFP, proteïna fluorescent groga; RFP, proteïna fluorescent vermella; VHH, domini variable de la cadena pesada; VNAR, nou receptor d'antigen variable. El marcador verd pàl·lid indica el progrés de la investigació sobre l'aplicació de GFP i el marcador verd groc indica el progrés de la investigació sobre l'anticossos GFP.

2.2. Estructura i propietats funcionals de GFP

La GFP és una FP àcida natural, globular i soluble. L'estructura primària de GFP consisteix en un monòmer compost per 238 residus d'aminoàcids, amb un pes molecular de 27-30 kDa. La seva estructura de cristall mostra un centre format per 11 cadenes antiparal·leles, formant una estructura de barril cilíndrica i ben empaquetada. El centre del barril està protegit per un grup emissor de llum de 4-(p-hidroxibenzilidè)-5-imidazolinona connectat a la seva hèlix, amb els dos extrems segellats per segments d'hèlix curt [17,18]. La maduració del cromòfor no requereix cap cofactor diferent de l'O2 [19]. GFP absorbeix llum blava o llum UV i emet fluorescència verda, amb el pic d'excitació principal a 395 nm, el pic d'excitació més baix a 475 nm i el pic d'emissió a 509 nm. GFP és extremadament estable i pot suportar fàcilment el tractament a altes temperatures. La fixació de formaldehid o la incrustació de parafina no afecta les seves característiques de fluorescència. A través de la investigació en profunditat de l'estructura i el procés de maduració dels FP, cada cop més investigadors redissenyen l'estructura dels FP per oferir-los noves funcions i propietats, promovent encara més el seu desenvolupament i aplicació.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

2.3. Derivats GFP

Els factors limitants en les aplicacions GFP són el pH, la sensibilitat als ions clorur i la mala fotosestabilitat. Les modificacions dirigides de GFP corregeixen aquests defectes, augmentant el seu rendiment quàntic, la brillantor, el coeficient d'extinció molar i la fotoestabilitat. A més, s'han establert diversos derivats de la GFP per ampliar la gamma de colors emesos, inclosos el blau, ultramar, cian i groc.

En resposta a la baixa intensitat de fluorescència de wtGFP sota excitació de llum blava i la seva expressió inestable a les cèl·lules de mamífer, Zhang et al. va dissenyar una substitució d'aminoàcids de GFP (F64L i S65T), és a dir, GFP millorada (EGFP), la intensitat de fluorescència de la qual augmenta 35- vegades [20]. EGFP segueix sent el mutant FP més utilitzat a la regió de llum verda, donada la seva bona fotoestabilitat i la seva gran brillantor. A més, s'han optimitzat les propietats de plegament de GFP, obtenint una supercarpeta GFP (sfGFP) amb capacitat de superplegament. El sfGFP té sis noves mutacions, incloses S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V i A206V. sfGFP es pot plegar de manera eficient fins i tot quan s'expressa en fusió amb proteïnes insolubles, assegurant la brillantor de la seva fluorescència [21]. GFPuv, una altra forma modificada de GFP, està optimitzada per a la fluorescència sota llum UV. Genera una fluorescència verda més brillant en presència de llum UV amb un pic d'excitació a 395 nm i un pic d'emissió a 509 nm i es pot utilitzar per identificar la ubicació de diferents proteïnes intracel·lulars [22, 23]. A GFPuv es produeixen tres substitucions d'aminoàcids, incloent F99S, M153T i V163A. Aquestes mutacions indueixen una expressió 18- vegades més forta de GFPuv que wtGFP a E. coli. El gen GFPuv és un gen sintètic on els cinc codons Arg de baixa freqüència es substitueixen per codons adequats per a E. coli per garantir l'expressió eficaç de GFPuv.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

La mutació dirigida al lloc de Y66H construeix la proteïna fluorescent blava (BFP) amb un pic d'excitació a 384 nm i un pic d'emissió a ~ 445 nm. El seu espectre d'excitació és proper a la llum UV, que danya les cèl·lules durant el funcionament, i la seva curta longitud d'ona d'emissió indueix l'autofluorescència a les cèl·lules. El BFP millorat (EBFP) és dèbilment luminiscent i poc resistent al fotoblanqueig i l'àcid, amb un senyal de fons elevat per a la imatge cel·lular. S'han desenvolupat tres mutants d'EBFP més brillants, inclosos Azurita [24], EBFP2 [25] i mTagBFP [26], que són 1.6-, 2.0- i 3.{{13} }pleguen més brillant que EBFP, respectivament. mTagBFP, el BFP més brillant, es deriva d'un mutant de la proteïna fluorescent vermella (RFP) TagRFP [27], amb un coeficient d'extinció de 52,000 M−1 cm−1 i un rendiment quàntic de {{19 }}.63, que millora significativament la seva resistència al fotoblanqueig. La mutació de Y66F en wtGFP dóna lloc a una proteïna fluorescent ultramar amb una longitud d'ona d'emissió de 442 nm [28]. Tanmateix, el baix rendiment quàntic de fluorescència de la variant GFP-Y66F limita severament la seva aplicabilitat a la imatge. Una mutació addicional de GFP-Y66F amb substitucions d'aminoàcids de T65Q, Y145G, H148S i T203V dóna lloc a la proteïna fluorescent ultramar Sirius, que és 25 vegades més brillant que GFP-Y66F [29].

La proteïna fluorescent cian (CFP) té un pic d'excitació a 449 nm i un pic d'emissió a ~ 482 nm, amb propietats espectrals que oscil·len entre BFP i EGFP. De manera similar a la BFP, s'utilitza una mutació dirigida al lloc de Y66W per construir CFP. CFP té àmplies aplicacions en recerca d'imatges i localització multicolor a causa de la seva fotoestabilitat excepcional. Per exemple, el gen que codifica CFP s'ha optimitzat per a la preferència de codons humans i ara està disponible comercialment amb el nom comercial AmCyan1 (Clontech). A més, hi ha diversos mutants més brillants que el CFP millorat (ECFP), com ara Cerulean, mTFP (dues vegades més brillant que Cerulean) i turquesa (aproximadament el doble de brillant que ECFP) [21,30].

Les mutacions de la proteïna fluorescent groga (YFP) no estan restringides al motiu central del cromòfor Y66, sinó als residus estructuralment adjacents a Y66. El pic d'excitació de YFP és ~ 518 nm, amb un pic d'emissió de ~ 531 nm. En comparació amb GFP, la fluorescència de YFP es desplaça cap a l'espectre vermell, que es deu principalment a la substitució de Thr per Tyr a la posició 203. L'YFP millorat (EYFP) és un dels biosensors FP més fluorescents i àmpliament utilitzats per detectar pH intracel·lular i concentracions d'ions clorur. Tanmateix, és molt susceptible als ions àcids i clorur i és menys fotostable que molts FP derivats de meduses [31]. mCitrine i mVenus, versions millorades d'EYFP, són actualment les YFP més utilitzades [32,33]. Les propietats fotofísiques de la GFP i els seus derivats es resumeixen a la taula 1.

Taula 1. Propietats fotofísiques de GFP, RFP i els seus derivats.

Taula 1. Cont.

2.4. Derivats de RFP

RFP és un altre FP àmpliament utilitzat. DsRed és un tetràmer que tendeix a formar multímers en realitzar fusions de proteïnes i que pot ser tòxic quan s'expressa intracel·lularment, per la qual cosa ha estat dissenyat per obtenir monòmers. La RFP més notable és la família "mFruit", que inclou mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine i mStrawberry (taula 1), de les quals mCherry, amb mutacions de K163Q i K83L, és la més preferida. mCherry té una maduració ràpida, bones propietats monomèriques i una millor fotoestabilitat, tot i que és menys brillant [34]. Tanmateix, TagRFP en la seva forma de monòmer és aproximadament de tres a quatre vegades més brillant que mCherry, el que la converteix en una RFP monomèrica relativament brillant que està disponible actualment [27]. mKate és una nova proteïna fluorescent monomèrica de color vermell llunyà derivada d'una mutació de quatre llocs de TagRFP amb un pic d'excitació a 588 nm i un pic d'emissió a 635 nm, que només és un 45% tan brillant com EGFP; la seva proteïna de dimerització, Katushka, és un 67% tan brillant com EGFP [35]. mKate2, un mutant de mKate amb substitucions d'aminoàcids de V38A, S165A i K238R, té aproximadament el doble de la brillantor de mKate [36]. En comparació amb GFP i RFP, mKate i Katushka presenten una millor profunditat d'imatge i senyals òptics més rics per a imatges de fluorescència intra-objecte [35]. Per tant, el desenvolupament de proteïnes fluorescents de color vermell llunyà és més valuós per a la bioimatge in vivo.

2.5. FP d'infrarojos propers

Els FP d'infrarojos propers (NIR) són molt desitjats com a etiquetes de proteïnes en aplicacions d'imatge. La majoria dels FP NIR estan dissenyats a partir de fotoreceptors de fitocroms bacterians (BphP) [37]. El primer NIR FP que s'utilitza en imatges d'animals vius és IFP1.4, una proteïna fluorescent derivada de BphP que fluoresce en unir-se a un cromòfor de biliverdina (BV) [38]. Mitjançant la barreja de l'ADN i la mutagènesi aleatòria, es desenvolupa un IFP2 més brillant.0 [39]. Tot i que els monomèrics IFP1.4 i IFP2.0 es poden aconseguir trencant la interfície de dimerització de BphP, encara tendeixen a dimeritzar-se a concentracions elevades. El 2015 es va dissenyar una proteïna fluorescent infraroja (IFP) monomèrica natural, mIFP [40]. S'ha demostrat que mIFP té efectes d'imatge sonora a les larves i neurones de Drosophila. Shcherbakova et al. Va dissenyar tres FP NIR monomèrics brillants amb espectres diferents, a saber, miRFP670, miRFP703 i miRFP709 [41]. Els FP NIR derivats de BphP requereixen com a mínim dos dominis, PAS (Per-ARNT-Sim) i GAF (cGMP fosfodiesterasa-adenilat ciclasa-FhlA), per unir de manera covalent un cromòfor BV i també posseir una complexa estructura de "nusos en figura de vuit" enllaçant topològicament els dominis GAF i PAS, cosa que afecta el seu plegament. Per tant, s'utilitza una altra classe de fotoreceptors bacterians, les al·loficocianines (APC), per dissenyar FP NIR, com ara smURFP [42]. Tot i que els FP NIR basats en APC són més petits, s'uneixen a BV de manera menys eficient, donant lloc a una brillantor significativament més baixa a les cèl·lules de mamífer que les FP NIR derivades de BphP. Per superar els defectes dels FP NIR basats en BphP i APC, es va desenvolupar un FP NIR d'un sol domini anomenat miRFP670nano a partir de cianobacteriocrom (CBCR), que representa el primer FP NIR derivat de CBCR que pot unir de manera eficient el cromòfor BV endògen i emetre fluorescència brillant en cèl·lules de mamífer [43]. Un avantatge essencial de miRFP670nano sobre els FP NIR derivats de BphP és l'alta fotosestabilitat. El miRFP670nano3 millorat, amb 14 mutacions en relació amb el miRFP670nano parental, presenta una fotoestabilitat similar a la del miRFP670nano [44]. La taula 2 resumeix les propietats fotofísiques dels FP NIR.

Taula 2. Propietats fotofísiques dels FP NIR.

El descobriment i l'aplicació dels FP han proporcionat una potent eina de recerca per a la biologia moderna. Avui en dia, els FP s'han convertit en una de les eines habituals que utilitzen els científics per estendre les seves aplicacions a moltes àrees de recerca, com ara la regulació de l'expressió gènica, l'etiquetatge d'orgànuls, la transmissió de senyals, el cribratge de fàrmacs i les interaccions biomoleculars. La majoria de vectors de clonació que expressen FP s'han comercialitzat i estan disponibles a través d'empreses comercials.

3. Avenços de la investigació sobre anticossos proteïnes fluorescents

3.1. Anticòs monoclonal dirigit a proteïnes fluorescents

L'anticòs és un tipus d'immunoglobulina secretada pels limfòcits B. Els anticossos monoclonals consisteixen en dues cadenes pesades i dues cadenes lleugeres, amb la cadena pesada formada per una regió variable (VH) i tres regions constants (CH), i la cadena lleugera formada per una regió variable (VL) i una regió constant (CL). ). Les cadenes pesades estan enllaçades covalentment per enllaços disulfur, i la regió CL de la cadena lleugera està enllaçada de manera no covalent al domini CH1 de la cadena pesada per formar una molècula d'anticossos estable [45]. A causa de la seva capacitat específica d'unió al receptor, els anticossos monoclonals produeixen una varietat d'activitats biològiques, com ara el bloqueig clàssic, la neutralització, l'activació del complement, la destrucció de cèl·lules diana a través del receptor Fc i la regulació de l'activitat immune. Són macromolècules biològiques crítiques àmpliament aplicades en immunoassaig, diagnòstic in vitro i desenvolupament de fàrmacs. Els anticossos policlonals són una barreja d'anticossos heterotípics derivats del procés de resposta immune de múltiples cèl·lules B, i cada anticòs reconeix un epítop diferent del mateix antigen [45]. En comparació amb els anticossos policlonals, els anticossos monoclonals detecten específicament un epítop a l'antigen i tenen menys probabilitats de reaccionar creuament amb altres proteïnes, produint així senyals de tinció de fons baixos. A més, la reproductibilitat dels resultats sobre anticossos monoclonals és superior a la dels anticossos policlonals en les mateixes condicions experimentals.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>El 90%) es purifica mitjançant una tècnica senzilla de 2-pasos mitjançant mAb FMU-GFP.5-resina Sepharose 4B acoblada. A més, totes les proteïnes objectiu recombinants funcionals acoblades a GFP es poden aïllar fàcilment i directament de les cèl·lules, a causa de l'epítop GFP. Aquestes dades suggereixen que aquest mètode és més eficaç per purificar la GFP que qualsevol mètode disponible i resol el repte de baix rendiment i puresa en la majoria dels mètodes de purificació de GFP.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

3.2. Nanobody dirigit a proteïnes fluorescents

3.2.1. Introducció de Nanobody

Les propietats inherents dels anticossos monoclonals, com ara el seu gran pes molecular, estructura complexa i activitat biològica limitada, han restringit cada cop més les seves aplicacions posteriors. Per tant, és urgent desenvolupar alternatives als anticossos monoclonals. El 1989, Ward et al. va preparar un domini variable d'anticossos només de cadena pesada amb una capacitat d'unió feble cap al lisozima, augmentant l'interès en la investigació de sdAb [48]. El 1993, Hamers Casterman et al. va descobrir per primera vegada un nou tipus d'anticossos en sèrum de camell, que és completament diferent de l'anticòs tradicional de mamífers [49]. Aquest tipus d'anticossos s'anomena HCAb per la seva manca natural de cadenes lleugeres. L'HCAb consisteix en CH2, CH3, la regió frontissa i el domini variable de l'HCAb (VHH), però encara té capacitat d'unió a l'antigen total. El 1995, Greenberg et al. va descobrir anticossos només de cadena pesada, coneguts com IgNAR, en taurons nodrisses [50]. Existeix tant en formes secretores com lligades a membrana, i consta d'una regió variable, anomenada receptor d'antigen nou variable (VNAR) i diverses regions constants. Posteriorment, s'ha trobat IgNAR en taurons wobbegong, gossets espinosos, taurons banyes i taurons de bambú amb taques blanques, complementant els repertoris sdAbs. Un nanobody posseeix les característiques de petit pes molecular, alta afinitat, forta estabilitat, bona solubilitat, forta penetració en els teixits i reconeixement d'epítops d'antigen ocults. Ha atret una major atenció en el diagnòstic de malalties, reactius immunitaris, detecció de patògens i desenvolupament de fàrmacs [51]. Amb el desenvolupament de tècniques de biologia molecular i la millora de la tecnologia de preparació d'anticossos d'enginyeria genètica, nanobody s'ha convertit en un camp de recerca popular en immunoassaig. La figura 3 resumeix el desenvolupament del nanobody fins ara.

Figura 3. El desenvolupament del nanobody. El marcador blau clar indica el progrés de la investigació sobre fàrmacs nanobody. FDA, Food and Drug Administration; EMA, Agència Europea del Medicament; NMPA, Administració Nacional de Productes Mèdics; HCAb, anticossos de cadena pesada; IgNAR, receptors d'antigens Ig nous; sdAb, anticossos de domini únic; VHH, domini variable de HCAb; VNAR, domini variable d'IgNAR; PD-L1, mort cel·lular programada 1 lligand 1.

3.2.2. Nanobody dirigit a proteïnes fluorescents

Les proteïnes fluorescents han canviat la biologia cel·lular i la bioquímica oferint marcadors de proteïnes fluorescents codificades per gens senzills d'utilitzar. S'han desenvolupat diversos agents d'unió estreta per a la investigació i els objectius de fàrmacs mitjançant la síntesi i la selecció de biblioteques de bastides de proteïnes durant el desenvolupament paral·lel [52]. Un exemple és el desenvolupament de nanobody, que és més fàcil de seleccionar amb una estabilitat, solubilitat i rendiment millorats [53]. A diferència dels anticossos tradicionals, aquests nanocossos petits i estables són funcionals a les cèl·lules vives. Per tant, el nanobody amb activitat d'unió específica a la FP és una eina potent per a la fusió, la separació i l'enginyeria cel·lular de la FP en diverses àrees de la investigació biològica.

• Nanocossos derivats de camèlids dirigits a GFP

Diverses proteïnes amb excel·lents característiques de localització subcel·lular s'han fusionat amb GFP, creant antígens visuals per detectar proteïnes directament en diversos compartiments subcel·lulars. El 2006, Rothbauer et al. va examinar un fragment d'anticossos específic de GFP (cAbGFP4) immunitzant l'alpaca amb GFP [54]. L'assaig de ressonància plasmònica superficial (SPR) de la interacció entre cAbGFP4 i l'antigen GFP va mostrar una alta afinitat (KD=0.23 nM). A més, el nanobody anti-GFP es va combinar amb una RFP monomèrica, produint l'anticòs visible d'unió a GFP emprat per examinar la distribució del nanobody anti-GFP a les cèl·lules vives. Mitjançant assajos de filtració en gel, immunoblot i microscòpia confocal, es va demostrar que el nanobody específic de GFP es distribueix de manera estable a les cèl·lules de mamífers sense degradació o agregació de proteïnes detectables que es troben habitualment amb fragments variables d'una sola cadena. A més, Kubala et al. va caracteritzar el complex GFP:cAbGFP4 (figura 4A) mitjançant cristal·lografia de raigs X i calorimetria de titulació isotèrmica (ITC) [55], revelant la base d'una gran afinitat i especificitat dels nanocossos en la unió de proteïnes. El 2020, es van identificar quatre nanocossos anti-GFP diferents, anomenats A12, B9, D5 i E6, mitjançant la visualització de fags [56]. Els assajos natius de PAGE i d'immunoprecipitació van revelar que aquests nanocossos podrien unir GFP in vitro i in vivo.

Figura 4. Diagrama del complex GFP–nanobody. (A) cAbGFP4 (PDB: 3OGO, taronja); (B) GBP1 (PDB: 3K1K, blau clar); (C) GBP4 (PDB: 3G9A, rosa); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, groc); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, magenta). (F) Superposició estructural dels nanocossos anteriors amb complex GFP. GFP es mostra en color verd.

La conformació de proteïnes està estretament relacionada amb la funció i normalment està controlada per factors reguladors. Axel et al. va identificar set aglutinants específics de GFP, és a dir, proteïnes d'unió a GFP (GBP) 1-7 [57]. Entre ells, GBP1 va augmentar la fluorescència de GFP 10- vegades, mentre que GBP4 va induir una disminució de 5- vegades en la fluorescència de GFP; per tant, aquests es van denominar "potenciadors" i "minimitzadors", respectivament. Les anàlisis estructurals del complex GFP-nanobody (figura 4B, C) van revelar que els dos nanocossos van provocar canvis oposats modestos en el medi cromòfor, alterant les seves característiques d'absorció [58]. A més, es van identificar 25 nanocossos (LaG) específics de GFP, amb valors de KD que van des de 0.5 nM a més de 20 µM [59]. Un nanocossos bivalent (LaG-16-LaG{-2) va mostrar l'afinitat més alta, amb un valor KD de 36 pM. A més, la intensitat màxima de fluorescència de GFP va augmentar un ~ 60% quan es va incubar amb un excés de proteïna LaG. Zhang et al. va informar de l'estructura cristal·lina de GFPuv complexada amb LaG16 (figura 4D) a una resolució d'1, 67 Å [60]. El lloc d'unió de LaG16 al barril de GFP es trobava a l'altre costat del potenciador de GFP. Per tant, LaG16 i el potenciador de GFP es van fusionar amb un enllaçador (GS) 4. El nanocossos bivalent tenia una afinitat de 0, 5 nM, cosa que demostra la viabilitat de dissenyar aglutinants de proteïnes diana d'alta afinitat mitjançant la dimerització de 2 nanocossos que s'uneixen amb diferents epítops.

El 2014, Twair et al. va preparar sfGFP i va immunitzar un camell adult d'una gepa. Es van aïllar set nanocossos anti-sfGFP dirigits a tres epítops (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 i 08) [61]. Basant-se en assajos ELISA i immunoblotting, aquests nanocossos van reconèixer sfGFP etiquetat com a lliure o fusionat a l'hormona del creixement. A més, es va establir l'estructura cristal·lina del nanobody NbsfGFP02 complexat amb sfGFP (figura 4E) amb una resolució de 2, 2 Å. Es va determinar que l'afinitat entre NbsfGFP02 i sfGFP era de 15, 8 nM mitjançant interferometria de biocapa (BLI). La temperatura de fusió va ser de 75,6 graus per a NbsfGFP02 [62]; per tant, és un candidat potencial a nanobody GFP en aplicacions que exigeixen condicions de prova dures. La majoria de nanocossos es poden expressar funcionalment in vivo mitjançant la transfecció de plasmidis a cèl·lules eucariotes. Per tant, els nanocossos són una eina excel·lent per identificar característiques estructurals o dinàmiques de les cèl·lules vives. El 2020, Zhou et al. va proposar un nou mètode per expressar els nanocossos que s'uneixen a GFP (cAbGFP4) construïts com a ARNm de transcripció in vitro (IVT), anomenat nanobody-mCherry [63]. L'ARNm amb regions no traduïdes i anàlegs de tapa inversa tapats amb nucleòtids modificats químicament i cua de poli (A) es va preparar in vitro i es va utilitzar per a la transfecció. A diferència del nanobody expressat mitjançant l'ADN plasmidi, el nanobody anti-GFP expressat mitjançant l'ARNm d'IVT es va identificar a les 3 h de la transfecció i es va degradar en 48 h. Per tant, expressar l'ARNm codificat del nanobody a les cèl·lules vives permet un lliurament eficient del nanobody.

• Nanocossos derivats de taurons dirigits a GFP.

Wei et al. va demostrar que els taurons de bambú van produir una resposta immune eficaç contra la immunització GFP, caracteritzada per un recompte elevat de limfòcits i IgNAR específics d'antigen [64]. En total, es van aïllar 7 nanocossos anti-GFP, inclosos BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 i 105, amb una afinitat de fins a 0,3 nM, dels taurons de bambú immunitzats, la qual cosa implica que els taurons de bambú fabricar IgNAR d'alta afinitat. A més, es van construir els VNAR biparatòpics amb la més alta afinitat amb la GFP (20, 7 pM) i es va validar el caràcter dels nanocossos anti-GFP com a intracossos en cèl·lules de mamífer. Aquestes troballes acceleraran la investigació i el progrés dels sdAbs del tauró de bambú per proporcionar nanocossos de baix cost i fàcils d'utilitzar per a la indústria biomèdica.

• Nanocossos dirigits a altres proteïnes fluorescents.

Masabi és una proteïna fluorescent de color verd monomèric brillant. Li et al. va construir amb èxit una biblioteca d'anticossos de 4 × 107 transformants immunitzant camells amb mWasabi com a antigen i va examinar 3 nanocossos específics de mWasabi d'alta afinitat, anomenats Nb4, Nb6 i Nb27 [65]. Aquests nanocossos van reconèixer el wasabi sol o quan es van combinar amb la mort programada 1 (PD-1). En total, es van identificar 6 nanocossos (LaMs) dirigits a mCherry amb una alta especificitat, amb valors de KD que oscil·laven entre 0,18 nM i 63 nM [59]. A més, es van aïllar tres nanocossos específics d'iRFP713- (BSR1, BSR3 i BSR4) amb afinitats d'unió nanomolar [64]. Aquestes dades suggereixen que la immunització dels taurons de bambú pot produir nanocossos d'alta afinitat. En general, la capacitat dels nanocossos per unir proteïnes cel·lulars i atraure proteïnes de fusió FP permet un control precís dels processos i estructures cel·lulars de les cèl·lules vives. Aquesta trampa FP-nano multifuncional permet anàlisis microscòpiques, bioquímiques i funcionals amb una combinació única de la mateixa proteïna. Els nanocossos dirigits als FP es resumeixen a la taula 3.

Taula 3. Resum de nanocossos dirigits a FP.

4. Aplicacions del Nanobody de proteïnes fluorescents

4.1. Aplicacions en la detecció de proteïnes

4.1.1. Detecció de proteïnes intracel·lulars

Entendre la funció de les proteïnes requereix una localització de proteïnes d'alta resolució fiable i quantificable. Tot i que l'ús d'anticossos per marcar proteïnes diana ha estat ben establert en biologia molecular, aquesta tècnica es veu limitada per la mida i la multivalència dels anticossos convencionals. Donada la petita mida dels nanocossos, es poden utilitzar com a traçadors per a imatges intracel·lulars després de la lligadura amb molècules fluorescents, enzims, pèptids, receptors, biotina i altres fàrmacs. Per exemple, els nanocossos contra FP es van utilitzar en imatges de microscòpia de super-resolució quan es van etiquetar amb colorants orgànics [66,67]. Les cèl·lules Ptk2 que expressen contínuament tubulina YFP es van fer imatges mitjançant aquest enfocament, i la resolució es va millorar a 269 ± 37 Å, a diferència d'aproximadament 450 Å amb anticossos convencionals.

L'etiquetatge mediat per nanobody ofereix un mètode ràpid i versàtil per etiquetar gairebé qualsevol estructura de fusió derivada de FP accessible habitualment per a imatges sofisticades de microscòpia de localització d'una sola molècula (SMLM). Concretament, l'SMLM de dos colors pot investigar la localització subcel·lular de qualsevol construcció funcional de fusió GFP i RFP quan s'utilitzen nanocossos contra GFP i RFP simultàniament [68]. Així, es poden solucionar ràpidament nombrosos problemes biològics mitjançant imatges SMLM de dos colors. Ariotti et al. va proposar un enfocament modular per a l'etiquetatge de proteïnes basat en enzims, que permetia millorar la velocitat i el mostreig per analitzar les distribucions de proteïnes subcel·lulars a la resolució EM [7]. En dissenyar GBP4 directament a l'etiqueta d'ascorbat peroxidasa de soja modificada (APEX), es va demostrar que APEX es podia dirigir a qualsevol proteïna d'interès marcada amb GFP. La fusió APEX-GBP4 proporciona una localització de proteïnes d'alta resolució notable als subdominis dels orgànuls i escurça significativament el temps per caracteritzar les distribucions de proteïnes subcel·lulars. A més, permet la resolució EM de proteïnes marcades amb GFP expressades a nivells endògens.

Es va generar una caixa d'eines de plasmidis que codifiquen nanocos específics de FP i es va fusionar en mòduls funcionals. Aquesta caixa d'eines permet la visualització i la manipulació de les vies de senyalització intracel·lular a les cèl·lules vives, ampliant significativament els seus usos in vivo [9]. Aquests inclouen sensors fluorescents per a la visualització dinàmica de Ca2+, H+ i ATP/ADP, i mòduls oligomèrics o heterodimèrics que permeten el reclutament o aïllament de proteïnes i el reconeixement dels llocs de contacte de la membrana entre els orgànuls. El 2017, Herce et al. va utilitzar el pèptid penetrant cel·lular (CPP) per transportar anticossos directament a les cèl·lules per a l'immunomarcació i la manipulació d'antigens [69]. Es va construir un sistema que aprofitava l'alta afinitat del CPP ric en arginina cíclica cap a l'ARN del nuclèol. En enllaçar el CPP ric en arginina cíclica al nanobody GFP, es pot observar directament la relocalització de GFP al nuclèol a ​​les cèl·lules (figura 5A). Per tant, aquest sistema visualitzat es pot utilitzar per fer un seguiment de la ubicació de la proteïna i per comparar quantitativament l'eficiència de diferents CPP.

La tècnica de transferència d'energia per ressonància de fluorescència (FRET) s'utilitza àmpliament en la investigació en ciències de la vida perquè permet la detecció dinàmica en temps real de molècules de senyalització en condicions fisiològiques a les cèl·lules vives. A causa de la seva excepcional sensibilitat i especificitat, l'anàlisi basada en la transferència d'energia de ressonància de Förster (TR-FRET) amb resolució temporal és cada cop més popular en la investigació biomèdica. El mètode TR-FRET basat en nanobody permet una quantificació fàcil de proteïnes fluorescents (fusió) en lisats amb una sensibilitat molt més alta que les lectures d'intensitat de fluorescència convencionals [70].

Figura 5. Aplicacions del nanobody proteic fluorescent. (A) Visualització de les interaccions proteïna-proteïna. Nanobody anti-GFP (Nb) unit a pèptids que penetran les cèl·lules (CPP) poden penetrar al nucli cel·lular. Si la proteïna etiquetada amb GFP no interacciona amb la proteïna etiquetada amb RFP, només la proteïna etiquetada amb GFP es torna a localitzar al nucli mitjançant Nb-CPP, mostrant un color verd. Tanmateix, si les dues proteïnes interaccionen, ambdues proteïnes es tornen a localitzar al nuclèol, mostrant un color groc. (B) GFP nanobody permet l'etiquetatge selectiu de proteïnes vesícules recentment exocitades. Pas 1: la proteïna de la vesícula s'acobla a GFP i s'incuba amb un nanobody no fluorescent (NbGFP), donant lloc a la inaccessibilitat de GFP amb el nanobody que uneix fluorescència (NbGFP *). Passos 2 i 3: després de l'estimulació de l'exocitosi cel·lular, la nova proteïna de la vesícula s'exposa a la membrana plasmàtica i pot ser marcada per NbGFP*. (C) Il·lustració esquemàtica de degradats. La degradació selectiva de proteïnes s'aconsegueix a través de la via de la ubiquitina, que es realitza per una sèrie complexa d'enzims. La proteïna F-box (FBP) dels complexos de proteïna lligasa de la caixa F (SCF) SKP1-CUL1- es fusiona amb el nanobody anti-GFP (Nb) per reconèixer la proteïna de fusió GFP i l'enzim que conjuga la ubiquitina (E2) enllaça de manera covalent múltiples molècules d'ubiquitina a la proteïna diana. Posteriorment, la proteïna poliubiquitinada és degradada pel proteasoma. (D) Descripció esquemàtica de BiCAP. La proteïna HER es fusiona amb fragments N-terminals (GFP1) o C-terminals (GFP2) de GFP. Quan les dues fusions formen un dímer, la GFP es replega i es fluoresc. A continuació, el dímer HER i les seves proteïnes que interactuen s'enriqueixen mitjançant un nanobody GFP, que no té cap capacitat d'unió cap als fragments GFP i, per tant, permet l'aïllament del dímer. (E) Sistema de transcripció dependent de GFP. El domini d'unió a l'ADN (DBD) i el domini d'activació (AD) es fusionen amb GFP nanobody 1 (Nb1) i GFP nanobody 2 (Nb2), respectivament. En presència de GFP, DBD-Nb1 i AD-Nb2 poden activar el gen reporter de la seqüència d'activació aigües amunt (UAS), que condueix a la regulació a l'alça dels gens diana. (F) Reconeixement de proteïnes marcades amb GFP en nanoestructures d'ADN. Les nanoestructures d'ADN amb dos llocs d'unió s'uneixen a la resina magnètica, s'uneixen amb nanobody GFP (Nb) mitjançant un aparellament de bases complementàries i després s'incuben amb proteïnes marcades amb GFP. Per tant, les proteïnes marcades amb GFP es poden unir amb precisió a les nanoestructures.

Figura 5. Cont.

4.1.2. Detecció de proteïnes a la superfície cel·lular

La pantalla de superfície bacteriana és una tecnologia prometedora per produir proteïnes ancorades a cèl·lules i dissenyar catalitzadors de cèl·lules senceres. Tot i que s'utilitzen diverses proteïnes de la membrana externa per a la visualització de superfícies, no hi ha mètodes compatibles simples, universals i d'alt rendiment disponibles per avaluar i desenvolupar sistemes de visualització de superfícies. A més, és difícil distingir entre les proteïnes intracel·lulars i les que es mostren a la superfície. Wendel et al. va construir un sistema de detecció de visualització de superfícies basat en fluorescència fusionant GFP-nanobody amb ancoratges de membrana exterior [71]. Es van escollir dues proteïnes de membrana externa d'ús habitual com a ancoratges: la proteïna A de la membrana externa (OmpA) i l'autotransportador (C-IgAP). Per tant, es construeixen dos mòduls de visualització diferents fusionant OmpA o C-IgAP amb nanocossos específics de GFP, visualitzats afegint GFP purificada externament. Tot i que la GFP mateixa es pot mostrar a la superfície cel·lular, aquest nou mètode evita el problema dels falsos positius, ja que només si la GFP s'uneix al nanocos presentat a la superfície cel·lular, les cèl·lules poden produir un senyal fluorescent. L'assaig és compatible amb molts mètodes de detecció de fluorescència, inclosa la detecció de fluorescència de cèl·lules senceres en placa, fluorescència en gel, microscòpia i citometria de flux. Aquest mètode de visualització de superfície barat i fàcil de llegir ajudarà a demostrar el mecanisme de transport de proteïnes a la superfície de les cèl·lules vives, permetent el desenvolupament racional de sistemes de visualització de superfície bacteriana i biocatalitzadors robusts de cèl·lules senceres en el futur.

L'alliberament de neurotransmissors requereix exocitosi, endocitosi i la formació de noves vesícules de fusió. Què passa amb les proteïnes de les vesícules després de l'exocitosi, quan es deixen a la membrana plasmàtica, no s'entén poc. Aquestes proteïnes es conjuguen amb freqüència amb fragments GFP sensibles al pH (fluor). Com que les imatges de pHluorina solen estar limitades per la difracció de taques diverses vegades més grans que les vesícules, és valuós utilitzar nanocossos anti-GFP per etiquetar selectivament les vesícules exocitades [72]. En enllaçar nanocossos anti-GFP amb fluoròfors químics adequats per a imatges de super-resolució, la mida i la intensitat de les proteïnes marcades amb pHluorina en diverses condicions es poden detectar de maneres que no són possibles només amb pHluorina. Després de l'estimulació de l'exocitosi, s'exposen noves proteïnes de vesícules a la membrana plasmàtica i, a continuació, els nanocossos marcats amb fluorescència s'uniran amb pHluorin (figura 5B). Així, la detecció de pHluorina basada en nanobody és una eina prometedora per estudiar els esdeveniments post-exocitosi a les neurones.

4.2. Aplicacions en la degradació dirigida de molècules de proteïnes

En comparació amb l'edició de gens i la interferència de l'ARN, la manipulació directa de biomolècules a nivell de proteïnes és una ruta més eficient per als estudis de funció de les proteïnes, superant limitacions com ara els efectes potencials fora de l'objectiu, la inactivació de gens i la pèrdua de la funció fenotípica del gen essencial. La degradació de proteïnes dirigida és actualment una estratègia de recerca important per aconseguir la pèrdua de funció i la proteòlisi de les proteïnes d'interès. Un degradador de proteïnes basat en nanocossos pot ajudar a aconseguir una degradació ràpida i una regulació reversible de les proteïnes d'interès. Caussinus et al. va desenvolupar un mètode de degradació de proteïnes per a l'esgotament directe i ràpid de proteïnes de fusió GFP objectiu en qualsevol sistema eucariota [73]. Breument, per enderrocar la proteïna de fusió GFP, es fusiona un nanobody anti-GFP a la proteïna F-box (FBP) als complexos de lligasa E3 SKP1-CUL1-F-box protein (SCF) reconèixer la proteïna de fusió GFP. L'enzim que conjuga la ubiquitina (E2) enllaça de manera covalent múltiples molècules d'ubiquitina a la proteïna de fusió GFP objectiu. Posteriorment, el complex SCF degrada la proteïna poliubiquitinada; per tant, eliminar la proteïna objectiu és fàcil de controlar (figura 5C). Aquesta tècnica, anomenada proteïna fluorescent verda degradada (deGradFP), s'ha utilitzat per a la degradació de la GFP i les seves fusions en cèl·lules de mamífers, embrions de peix zebra [74] i plantes [75].

4.3. Aplicacions en el sistema de purificació per afinitat de complementació bimolecular

El 2016, Croucher et al. va desenvolupar un sistema de purificació d'afinitat de complementació bimolecular (BiCAP) que pot distingir eficaçment el dímer del receptor del factor de creixement epidèrmic humà (HER) (homòleg i heteròleg) del monòmer [76]. En aquest sistema, dos fragments complementaris d'una molècula FP es fusionen amb dues proteïnes HER (HER1, HER2 o HER3). Aquests dos fragments no es poden assemblar espontàniament en proteïnes fluorescents actives. Tanmateix, suposem que les dues proteïnes HER interactuen entre elles. En aquest cas, els dos fragments estaran espacialment propers i complementaris, reconstruint-los en una proteïna fluorescent completa i activa (figura 5D). El dímer HER i les seves proteïnes que interactuen es poden enriquir mitjançant un nanobody GFP, que no tenia afinitat pels fragments GFP, permetent així l'aïllament i l'enriquiment del dímer. En analitzar les proteïnes identificades, es va revelar que els tres dímers (HER2:HER2, HER2:HER3 i HER1:HER2) tenen proteïnes que interactuen comunes i el seu interactoma específic. FAM59A, una proteïna que va interactuar específicament amb el dímer HER1:HER3, va mediar l'activació de la via extracel·lular de la cinasa regulada pel senyal, proporcionant un nou objectiu per a la teràpia del càncer de mama.

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

4.4. Aplicacions en altres àmbits

El diagnòstic precoç in vitro de la malaltia i el seguiment dels efectes terapèutics és un problema important en el diagnòstic de la malaltia. Un agent de contrast ideal ha de tenir una bona penetració en els teixits, una gran afinitat amb l'antigen i una capacitat d'eliminació ràpida amb un dany mínim als teixits normals. Els nanocossos tenen el potencial com a agents d'imatge ideals que poden creuar els vasos sanguinis i entrar als teixits per obtenir millors imatges i aplicacions terapèutiques.

Els FP no només il·luminen cèl·lules i processos biològics, sinó que també fan excel·lents bastides a causa de la seva aparent manca d'enllaç amb nombroses xarxes de proteïnes hoste. Utilitzant GBP i GFP com a bastida per impulsar la formació de complexos biològicament actius, Tang et al. va crear una biblioteca de factors de transcripció híbrids que controlen exclusivament l'expressió gènica en presència de GFP i els seus derivats [77]. La producció de GFP controla l'expressió de gens específics de la cèl·lula (figura 5E) i promou la disfunció de la retina i el cervell del ratolí. A més, es modifiquen els ratolins transgènics GFP i les soques de peix zebra per aconseguir una transcripció dependent de GFP per al seguiment fotogenètic dels circuits neuronals. Aquest treball estableix la posició de GFP com a bastida versàtil i obre la porta a la manipulació selectiva de diverses cèl·lules etiquetades amb GFP en soques transgèniques. A partir d'això, altres productes intracel·lulars també es poden desenvolupar com a bastides específiques de cèl·lules en organismes pluricel·lulars.

Les nanoestructures d'ADN s'han convertit en una eina essencial i eficaç per estudiar l'activitat enzimàtica i la funció de les proteïnes. No obstant això, és difícil desenvolupar estratègies universals per formar complexos proteics en nanoestructures d'ADN. Una de les dificultats és la unió de proteïnes d'interès a les nanoestructures d'ADN. Sommese et al. va proposar un nou enfocament per etiquetar nanoestructures d'ADN [78]. En funcionalitzar-los amb un nanobody GFP, es pot controlar amb precisió la capacitat d'unió de proteïnes (figura 5F). En comparació amb els aptàmers d'ADN específics de GFP, els nanocossos presenten una major especificitat, estabilitat i afinitat cap a GFP. Per tant, l'aplicació de nanoestructures d'ADN com a bastida programable en la investigació biològica s'ha simplificat dràsticament connectant les nanoestructures d'ADN amb FP que es troben habitualment a les cèl·lules, la biologia del desenvolupament i la bioquímica de proteïnes.

5. Debat sobre les perspectives de futur

En comparació amb els anticossos tradicionals, els nanocossos tenen millors propietats físiques i químiques i són més fàcils d'expressar i cridar. Els nanocossos tenen una estructura molt més senzilla que els anticossos convencionals. Estan codificats per un únic gen i poden ser produïts fàcilment per microorganismes, reduint significativament el cost de producció. Encara que els nanocossos proporcionen un avenç per a la investigació d'anticossos, encara s'han de resoldre alguns problemes. D'una banda, tenen l'inconvenient d'un funcionament incòmode i un alt cost de la immunització dels animals. A més, com que HCAb i IgNAR són abundants en monòcits de sang perifèrica, els nanocossos dirigits als antígens FP solen ser seleccionats a partir de biblioteques immunes específiques de Camèlidae o taurons. Amb la maduració de les tecnologies de construcció de biblioteques i desenvolupament de nanocossos, el cribratge de nanocossos específics de FP a partir de biblioteques sintètiques és una nova direcció que superarà els inconvenients d'immunitzar animals, escurçarà el període experimental i reduirà significativament el cost. D'altra banda, tot i que el cribratge i l'expressió de nanocossos és relativament senzill, l'obtenció de nanocossos FP amb valors potencials d'aplicació és un procés molt complicat. El cribratge de les biblioteques de nanocossos de fags no pot evitar els falsos positius causats per la unió de la superfície dels fags filamentosos amb l'antigen, mentre que la petita capacitat de les biblioteques de nanocossos de llevats i bacteris és un altre problema difícil en el cribratge de nanocossos.

Les aplicacions de nanocossos contra la FP continuaran augmentant en el futur. (1) Amb el desenvolupament de la tecnologia d'anticossos intracel·lulars, la detecció de molècules intracel·lulars a les cèl·lules vives s'ha tornat accessible. Els nanocossos tenen avantatges únics en aquest sentit, ja que (i) el nanocossos és petit i l'eficiència de l'entrada cel·lular és molt superior a la dels anticossos tradicionals; i (ii) el nanocos es pot expressar i funcionar a les cèl·lules vives. (2) Nanobody biespecífic és una mena d'anticossos modificat artificialment que pot unir específicament dos antígens diferents simultàniament. Es pot construir fàcilment a partir de nanocossos monovalents i expressar-se en microorganismes. Per tant, els nanocossos contra FP ofereixen una àmplia perspectiva d'aplicació per al desenvolupament de nanocossos biespecífics.

6. Conclusions

Aquest article revisa l'origen, l'estructura i les propietats dels FP. També es resumeixen anticossos monoclonals i nanocossos dirigits a FP i les seves aplicacions. Tot i que els anticossos són eines valuoses per mostrar components biològics a les cèl·lules immobilitzades, l'ús d'anticossos tradicionals a les cèl·lules vives es veu limitat pel plegament i el muntatge ineficaços de les seves cadenes pesades i lleugeres variables. La microinjecció directa d'anticossos és el mètode principal utilitzat en aplicacions intracel·lulars d'anticossos, que és tècnicament difícil i estressant per a les cèl·lules. Els anticossos d'un sol domini derivats de camells o taurons reconeixen els antígens a través dels seus dominis variables de cadenes pesades. Aquests nanocossos petits i estables es poden expressar i ser funcionals a les cèl·lules vives. Per tant, generar nanocossos dirigits a FP els farà més valuosos en la investigació biològica.

Referències

1. Muyldermans, S. Nanobodies: Natural Single-Domain Anticossos. Ann. Rev. Biochem. 2013, 82, 775–797. [CrossRef] [PubMed]

2. Helma, J.; Cardoso, MC; Muyldermans, S.; Leonhardt, H. Nanobodies i aglutinants recombinants en biologia cel·lular. J. Cell Biol. 2015, 209, 633–644. [CrossRef] [PubMed]

3. Ashour, J.; Schmidt, FI; Hanke, L.; Cragnolini, J.; Cavallari, M.; Altenburg, A.; Cerveser, R.; Ingram, J.; Sabater, C.; Ploegh, HL L'expressió intracel·lular d'anticossos d'un sol domini de camèlids específics per a la nucleoproteïna del virus de la grip descobreix característiques diferents de la seva localització nuclear. J. Virol. 2015, 89, 2792–2800. [CrossRef] [PubMed]

4. Manglik, A.; Kobilka, BK; Steyaert, J. Nanobodies per estudiar l'estructura i la funció del receptor acoblat a proteïna G. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017, 57, 19–37. [Ref creuat]

5. Harmansa, S.; Hamaratoglu, F.; Affolter, M.; Caussinus, E. L'extensió Dpp és necessària per al creixement del disc de l'ala medial però no lateral. Natura 2015, 527, 317–322. [Ref creuat]

6. Yamagata, M.; Sanes, JR Reporter-fusions nanobody (RANbodies) com a reactius immunohistoquímics versàtils, petits i sensibles. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2018, 115, 2126–2131. [Ref creuat]

7. Ariotti, N.; Hall, TE; Rae, J.; Ferguson, C.; McMahon, K.-A.; Martel, N.; Webb, RE; Webb, RI; Teasdale, RD; Parton, RG Detecció modular de proteïnes marcades amb GFP per a la detecció ràpida per microscòpia electrònica en cèl·lules i organismes. Dev. Cel·la 2015, 35, 513–525. [Ref creuat]

8. Früholz, S.; Fäßler, F.; Kolukisaoglu, Ü.; Pimpl, P. El bloqueig dels VSR provocat per Nanobody revela la recàrrega de lligands al Golgi. Nat. Commun. 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. Prole, DL; Taylor, CW Un conjunt d'eines codificat genèticament de nanocossos funcionalitzats contra proteïnes fluorescents per visualitzar i manipular la senyalització intracel·lular. BMC Biol. 2019, 17, 41. [CrossRef]

10. Shimomura, O.; Johnson, FH; Saiga, Y. Extracció, purificació i propietats de l'aequorina, una proteïna bioluminescent de l'hidromedusà lluminós, Aequorea. J. Cèl·lula. Comp. Physiol. 1962, 59, 223–239. [Ref creuat]

11. Prasher, D.; McCann, RO; Cormier, MJ Clonació i expressió de l'ADNc que codifica per aequorina, una proteïna bioluminescent que s'uneix al calci. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 1985, 126, 1259–1268. [Ref creuat]

12. Heim, R.; Prasher, DC; Tsien, RY Mutacions de longitud d'ona i autooxidació post-traduccional de la proteïna fluorescent verda. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 1994, 91, 12501–12504. [Ref creuat]

13. Matz, M.; Fradkov, AF; Labas, YA; Savitsky, A.; Zaraisky, AG; Markelov, ML; Lukyanov, SA Proteïnes fluorescents d'espècies d'antozous no bioluminescents. Nat. Biotecnologia. 1999, 17, 969–973. [Ref creuat]

14. Parc, N.; Cançó, J.; Jeong, S.; Tran, TT; Ko, HW; Kim, EY Vaccinia-related kinase 3 (VRK3) estableix el període circadià i l'amplitud afectant la localització subcel·lular de les proteïnes del rellotge a les cèl·lules de mamífers. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 2017, 487, 320–326. [Ref creuat]

15. Zhao, D.; Xue, C.; Lin, S.; Shi, S.; Li, Q.; Liu, M.; Cai, X.; Lin, Y. Notch Signaling Pathway regula l'angiogènesi mitjançant cèl·lules endotelials en el model de co-cultura 3D. J. Cèl·lula. Physiol. 2016, 232, 1548–1558. [Ref creuat]

16. Rodríguez, EA; Campbell, RE; Lin, JY; Lin, MZ; Miyawaki, A.; Palmer, AE; Shu, X.; Zhang, J.; Tsien, RY La caixa d'eines de creixement i brillantor de proteïnes fluorescents i fotoactives. Tendències Bioquímica. Ciència. 2017, 42, 111–129. [Ref creuat]

17. Yang, F.; Moss, LG; Phillips, GN, Jr. L'estructura molecular de la proteïna fluorescent verda. Nat. Biotecnologia. 1996, 14, 1246–1251. [Ref creuat]

18. Ormö, M.; Cubitt, AB; Kallio, K.; Gross, LA; Tsien, RY; Remington, SJ Estructura de cristall de la proteïna fluorescent verda Aequorea victoria. Ciència 1996, 273, 1392–1395. [Ref creuat]

19. Reid, BG; Flynn, GC Formació de cromòfors en proteïna fluorescent verda. Bioquímica 1997, 36, 6786–6791. [Ref creuat]

20. Zhang, G.; Gurtu, V.; Kain, SR Una proteïna fluorescent verda millorada permet la detecció sensible de la transferència de gens en cèl·lules de mamífers. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 1996, 227, 707–711. [Ref creuat]

21. Pédelacq, J.-D.; Cabantous, S.; Tran, T.; Terwilliger, T.; Waldo, GS Enginyeria i caracterització d'una proteïna fluorescent verda supercarpeta. Nat. Biotecnologia. 2006, 24, 79–88. [CrossRef] [PubMed]

22. Crameri, A.; Whitehorn, EA; Tate, E.; Stemmer, WP va millorar la proteïna fluorescent verda per evolució molecular mitjançant la barreja d'ADN. Nat. Biotecnologia. 1996, 14, 315–319. [CrossRef] [PubMed]

23. Miura, H.; Inoko, H.; Inoue, I.; Tanaka, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M. Estratègia de clonació simple utilitzant el gen GFPuv com a indicador positiu/negatiu. Anal. Bioquímica. 2011, 416, 237–239. [CrossRef] [PubMed]

24. Mena, MA; Treynor, TP; Mayo, SL; Daugherty, proteïnes fluorescents PS Blue amb brillantor i fotoestabilitat millorades d'una biblioteca orientada estructuralment. Nat. Biotecnologia. 2006, 24, 1569–1571. [CrossRef] [PubMed]

25. Ai, H.; Shaner, N.; Cheng, Z.; Tsien, RY; Campbell, RE L'exploració de noves estructures de cromòfors condueix a la identificació de proteïnes fluorescents blaves millorades. Bioquímica 2007, 46, 5904–5910. [Ref creuat]

26. Subach, OM; Gundorov, IS; Yoshimura, M.; Subach, FV; Zhang, J.; Grüenwald, D.; Souslova, EA; Chudakov, DM; Verkhusha, VV Conversió de la proteïna fluorescent vermella en una sonda blava brillant. Chem. Biol. 2008, 15, 1116–1124. [Ref creuat]

27. Merzlyak, E.; Goedhart, J.; Shcherbo, D.; Bulina, ME; Shcheglov, AS; Fradkov, AF; Gaintzeva, A.; Lukyanov, K.; Lukyanov, S.; Gadella, T.; et al. Proteïna fluorescent vermella monomèrica brillant amb una vida útil de fluorescència allargada. Nat. Methods 2007, 4, 555–557. [Ref creuat]

28. Cubitt, AB; Heim, R.; Adams, SR; Boyd, AE; Gross, LA; Tsien, RY Comprendre, millorar i utilitzar proteïnes fluorescents verdes. Tendències Bioquímica. Ciència. 1995, 20, 448–455. [Ref creuat]

29. Tomosugi, W.; Matsuda, T.; Tani, T.; Nemoto, T.; Kotera, I.; Saito, K.; Horikawa, K.; Nagai, T. Una proteïna fluorescent ultramar amb fotoestabilitat augmentada i insensibilitat al pH. Nat. Methods 2009, 6, 351–353. [Ref creuat]

30. Goedhart, J.; van Weeren, L.; Hink, MA; Vischer, NOE; Jalink, K.; Gadella, TWJ Variants de proteïnes fluorescents de cian brillant identificades mitjançant un cribratge de fluorescència durant tota la vida. Nat. Mètodes 2010, 7, 137–139. [Ref creuat]

31. Dia, RN; Davidson, MW La paleta de proteïnes fluorescents: eines per a la imatge cel·lular. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2887–2921. [Ref creuat]

32. Griesbeck, O.; Baird, GS; Campbell, RE; Zacharias, DA; Tsien, RY Reducció de la sensibilitat ambiental de la proteïna fluorescent groga. J. Biol. Chem. 2001, 276, 29188–29194. [Ref creuat]

33. Nagai, T.; Ibata, K.; Park, ES; Kubota, M.; Mikoshiba, K.; Miyawaki, A. Una variant de proteïna fluorescent groga amb maduració ràpida i eficient per a aplicacions biològiques cel·lulars. Nat. Biotecnologia. 2002, 20, 87–90. [Ref creuat]

34. Shaner, NC; Campbell, RE; Steinbach, PA; Giepmans, BN; Palmer, AE; Tsien, RY Proteïnes fluorescents monomèriques vermelles, taronges i grogues millorades derivades de Discosoma sp. proteïna fluorescent vermella. Nat. Biotecnologia. 2004, 22, 1567–1572. [Ref creuat]

35. Shcherbo, D.; Merzlyak, EM; Chepurnykh, televisió; Fradkov, AF; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Lukyanov, KA; Bogdanova, EA; Zaraisky, AG; Lukyanov, S.; et al. Proteïna fluorescent de color vermell llunyà brillant per a imatges de tot el cos. Nat. Methods 2007, 4, 741–746. [Ref creuat]

36. Shcherbo, D.; Murphy, CS; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Chepurnykh, televisió; Shcheglov, AS; Verkhusha, V.; Pletnev, VZ; Hazelwood, KL; Roche, PM; et al. Etiquetes fluorescents de color vermell llunyà per a imatges de proteïnes en teixits vius. Bioquímica. J. 2009, 418, 567–574. [Ref creuat]

37. Oliinyk, OS; Txernov, KG; Verkhusha, fitocroms bacterians VV, cianobacteriocroms i al·loficocianines com a font de sondes fluorescents d'infrarojos propers. Int. J. Mol. Ciència. 2017, 18, 1691. [CrossRef]

38. Shu, X.; Royant, A.; Lin, MZ; Aguilera, TA; Lev-Ram, V.; Steinbach, PA; Tsien, RY Expressió de mamífers de proteïnes fluorescents infrarojes dissenyades a partir d'un fitocrom bacterià. Science 2009, 324, 804–807. [Ref creuat]

39. Yu, D.; Gustafson, WC; Han, C.; Lafaye, C.; Noirclerc-Savoye, M.; Ge, W.-P.; Thayer, DA; Huang, H.; Kornberg, TB; Royant, A.; et al. Una proteïna fluorescent infraroja monomèrica millorada per a imatges neuronals i cerebrals tumorals. Nat. Commun. 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. Yu, D.; Baird, MA; Allen, JR; Howe, ES; Klassen, diputat; Reade, A.; Makhijani, K.; Cançó, Y.; Liu, S.; Murthy, Z.; et al. Una proteïna fluorescent infraroja naturalment monomèrica per a l'etiquetatge de proteïnes in vivo. Nat. Methods 2015, 12, 763–765. [Ref creuat]

41. Shcherbakova, DM; Balaban, M.; Emelyanov, AV; Brenowitz, M.; Guo, P.; Verkhusha, VV Proteïnes fluorescents d'infraroig proper monomèriques brillants com a etiquetes i biosensors per a imatges multiescala. Nat. Commun. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. Rodríguez, EA; Tran, GN; Gross, LA; Crisp, JL; Shu, X.; Lin, JY; Tsien, RY Una proteïna fluorescent de color vermell llunyà va evolucionar a partir d'una ficobiliproteïna cianobacteriana. Nat. Mètodes 2016, 13, 763–769. [CrossRef] [PubMed]

43. Oliinyk, OS; Shemetov, AA; Pletnev, S.; Shcherbakova, DM; Verkhusha, VV La proteïna fluorescent més petita de l'infraroig proper va evolucionar a partir del cianobacteriocrom com a etiqueta versàtil per a la multiplexació espectral. Nat. Commun. 2019, 10, 279. [CrossRef]

44. Oliinyk, OS; Balaban, M.; Clark, CL; Carey, E.; Pletnev, S.; Nimmerjahn, A.; Verkhusha, VV La proteïna d'infraroig proper de domini únic proporciona una bastida per a nanocossos fluorescents dependents de l'antigen. Nat. Mètodes 2022, 19, 740–750. [CrossRef] [PubMed]

45. Tiller, KE; Tessier, PM Avenços en el disseny d'anticossos. Ann. Reverent Biomed. Eng. 2015, 17, 191–216. [Ref creuat]

46. ​​Gengyo-Ando, ​​K.; Mitani, S. 1020 Producció i caracterització d'un anticòs monoclonal contra la proteïna fluorescent verda (GFP). Neurosci. Res. 1997, 28, S122. [Ref creuat]

47. Zhuang, R.; Zhang, Y.; Zhang, R.; Cançó, C.; Yang, K.; Yang, A.; Jin, B. Purificació de proteïnes de fusió GFP amb gran puresa i rendiment mitjançant cromatografia en columna d'afinitat acoblada a anticossos monoclonals. Proteïna Expr. Purif. 2008, 59, 138–143. [Ref creuat]

48. Ward, ES; Güssow, D.; Griffiths, AD; Jones, PT; Winter, G. Activitats d'unió d'un repertori de dominis variables d'immunoglobulines individuals secretades per Escherichia coli. Natura 1989, 341, 544–546. [Ref creuat]

49. Hamers-Casterman, C.; Atarhouch, T.; Muyldermans, S.; Robinson, G.; Martells, C.; Songa, EB; Bendahman, N.; Hammers, R. Anticossos naturals sense cadenes lleugeres. Natura 1993, 363, 446–448. [Ref creuat]

50. Greenberg, AS; Àvila, D.; Hughes, M.; Hughes, A.; McKinney, EC; Flajnik, MF Una nova família de gens receptors d'antigen que pateix una reordenació i una àmplia diversificació somàtica en els taurons. Nat. Biol cel·lular. 1995, 374, 168–173. [Ref creuat]

51. De Meyer, T.; Muyldermans, S.; Depicker, A. Productes basats en nanobody com a eines de recerca i diagnòstic. Tendències Biotecnologia. 2014, 32, 263–270. [Ref creuat]

52. Skerra, A. Bastides alternatives sense anticossos per al reconeixement molecular. Curr. Opina. Biotecnologia. 2007, 18, 295–304. [Ref creuat]

53. Muyldermans, S.; Baral, T.; Retamozzo, VC; De Baetselier, P.; De Genst, E.; Kinne, J.; Leonhardt, H.; Magez, S.; Nguyen, V.; Revets, H.; et al. Immunoglobulines de camèlids i tecnologia nanobody. Veter. Immunol. Immunopatol. 2009, 128, 178–183. [Ref creuat]

54. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Tillib, S.; Nowak, D.; Schermelleh, L.; Gahl, A.; Backmann, N.; Conrath, K.; Muyldermans, S.; Cardoso, MC; et al. Orientació i seguiment d'antígens en cèl·lules vives amb nanocossos fluorescents. Nat. Methods 2006, 3, 887–889. [Ref creuat]

55. Kubala, MH; Kovtun, O.; Alexandrov, K.; Collins, BM Anàlisi estructural i termodinàmica de la GFP: complex GFP-nanobody. Proteïna Sci. 2010, 19, 2389–2401. [Ref creuat]

56. Fang, Z.; Cao, D.; Qiu, J. Desenvolupament i producció de nanocossos específicament contra la proteïna de fluorescència verda. Appl. Microbiol. Biotecnologia. 2020, 104, 4837–4848. [Ref creuat]

57. Kirchhofer, A.; Helma, J.; Schmidthals, K.; Frauer, C.; Cui, S.; Karcher, A.; Pellis, M.; Muyldermans, S.; Casas-Delucchi, CS; Cardoso, MC; et al. Modulació de les propietats de proteïnes en cèl·lules vives mitjançant nanocossos. Nat. Estructura. Mol. Biol. 2009, 17, 133–138. [Ref creuat]

58. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Muyldermans, S.; Schepers, A.; Cardoso, MC; Leonhardt, H. Una nanotrampa versàtil per a estudis bioquímics i funcionals amb proteïnes de fusió fluorescents. Mol. Cèl·lula. Proteoma. 2008, 7, 282–289. [Ref creuat]

59. Fridy, P.; Li, Y.; Keegan, S.; Thompson, MK; Nudelman, I.; Scheid, JF; Oeffinger, M.; Nussenzweig, MC; Fenyö, D.; Chait, BT; et al. Un pipeline robust per a la producció ràpida de repertoris de nanocos versàtils. Nat. Mètodes 2014, 11, 1253–1260. [Ref creuat]

60. Zhang, Z.; Wang, Y.; Ding, Y.; Hattori, M. Enginyeria basada en l'estructura de tàndems de nanocossos anti-GFP com a reactius d'alta afinitat per a la purificació. Ciència. Rep. 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. Twair, A.; Al-Okla, S.; Zarkawi, M.; Abbady, AQ Caracterització de nanocossos de camell específics per a proteïnes de fusió GFP de supercarpeta. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 6887–6898. [CrossRef] [PubMed]

62. Zhong, P.; Wang, Z.; Cheng, S.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Liu, R.; Ding, Y. Coneixements estructurals de dos nanocossos diferents que reconeixen el mateix epítop de proteïna fluorescent verda. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 2021, 565, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

63. Zhou, X.; Hao, R.; Chen, C.; Su, Z.; Zhao, L.; Luo, Z.; Xie, W. Lliurament ràpid de nanocossos/VHH a cèl·lules vives mitjançant l'expressió d'ARNm transcrit in vitro. Mol. Ther.-Mètodes Clin. Dev. 2020, 17, 401–408. [CrossRef] [PubMed]

64. Wei, L.; Wang, M.; Xiang, H.; Jiang, Y.; Gong, J.; Su, D.; Al Azad, MAR; Dong, H.; Feng, L.; Wu, J.; et al. Tauró de bambú com a model d'animals petits per a la producció d'anticossos de domini únic. Davant. Bioeng. Biotecnologia. 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. Li, S.; Shan, H.; Wang, T.; Zheng, X.; Shi, M.; Chen, B.; Lu, H.; Zhang, Y.; Zhao, S.; Hua, Z. Generació de nanocossos fluorescents d'unió a proteïnes mWasabi. Anal. Bioquímica. 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. Ries, J.; Kaplan, C.; Platonova, E.; Eghlidi, HM; Ewers, H. Un mètode senzill i versàtil per a la microscòpia de superresolució basada en GFP mitjançant nanobodies. Nat. Methods 2012, 9, 582–584. [Ref creuat]

67. Beghein, E.; Gettemans, J. Tecnologia Nanobody: un conjunt d'eines versàtil per a la imatge microscòpica, l'anàlisi de la interacció proteïna-proteïna i l'exploració de la funció proteïna. Davant. Immunol. 2017, 8, 771. [CrossRef]

68. Platónova, E.; Winterflood, CM; Junemann, A.; Albrecht, D.; Faix, J.; Ewers, H. Microscòpia d'una sola molècula de molècules etiquetades amb derivats de GFP o RFP en cèl·lules de mamífers utilitzant aglutinants nanobody. Mètodes 2015, 88, 89–97. [Ref creuat]

69. Herce, HD; Schumacher, D.; Schneider, AF; Ludwig, Alaska; Mann, FA; Potreres, M.; Kasper, M.-A.; Reinke, S.; Krause, E.; Leonhardt, H.; et al. Nanocossos permeables a les cèl·lules per a l'immunomarcatge dirigit i la manipulació d'antigens a les cèl·lules vives. Nat. Chem. 2017, 9, 762–771. [Ref creuat]

70. Payne, NC; Mazitschek, R. Tiny Titans: Nanobodies as Powerful Tools for TR-FRET Assay Development. Anal. Sens. 2022, 2, e202200020. [Ref creuat]

71. Wendel, S.; Fischer, EC; Martínez, V.; Seppälä, S.; Nørholm, MHH Un nanobody: plataforma bacteriana GFP que permet una visualització funcional d'enzims i una quantificació fàcil de la capacitat de visualització. Microbi. Cell Factories 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. Seitz, KJ; Els nanocossos de Rizzoli, SO GFP revelen molècules de pHluorina recentment exocitades. Ciència. Rep. 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. Caussinus, E.; Kanca, O.; Affolter, M. Knockout de proteïna de fusió fluorescent mediat per nanobody anti-GFP. Nat. Estructura. Mol. Biol. 2011, 19, 117–121. [Ref creuat]

74. Shin, YJ; Park, SK; Jung, YJ; Na Kim, Y.; Kim, KS; Park, d'acord; Kwon, S.-H.; Jeon, SH; Trinh, LA; Fraser, S.; et al. El complex E3-ubiquitin ligasa orientat a nanocos degrada les proteïnes nuclears. Ciència. Rep 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. Baudisch, B.; Pfort, I.; Sorge, E.; Conrad, U. Nanobody-Directed Specific Degradation of Proteins by the 26S-Proteasome in Plants. Davant. Planta Sci. 2018, 9, 130. [CrossRef]

76. Croucher, DR; Iconomou, M.; Hastings, JF; Kennedy, SP; Han, JZR; Shearer, RF; McKenna, J.; Wan, A.; Lau, J.; Aparicio, S.; et al. La purificació d'afinitat de complementació bimolecular (BiCAP) revela interaccions de proteïnes específiques del dímer per als dímers ERBB2. Ciència. Senyal. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. Tang, JC; Szikra, T.; Kozorovitskiy, Y.; Teixeira, M.; Sabatini, BL; Roska, B.; Cepko, CL Un sistema basat en nanobody que utilitza proteïnes fluorescents com a bastides per a la manipulació de gens específics de cèl·lules. Cèl·lula 2013, 154, 928–939. [Ref creuat]

78. Sommese, RF; Hariadi, RF; Kim, K.; Liu, M.; Tyska, MJ; Sivaramakrishnan, S. Modelant complexos de proteïnes en nanoestructures d'ADN mitjançant un nanobody GFP. Proteïna Sci. 2016, 25, 2089–2094. [Ref creuat]