Sidt2 és una proteïna clau en la via de degradació autofàgia-lisosomal i és essencial per al manteniment de l'estructura renal i la funció de filtració
Nov 07, 2023
La regulació i l'homeòstasi de l'autofàgia són essencials per mantenir la morfologia i la funció dels òrgans. Com a proteïna de membrana lisosomal, l'efecte deSidt2activatestructura renaliautofàgia renalencara es desconeix. En aquest estudi, hem trobat que els ronyons deSidt2−/−els ratolins van mostrar canvis en l'engrossiment de la membrana basal, la fusió del procés del peu i la inflor mitocondrial, cosa que suggereix que ell'estructura del ronyó estava danyada. L'augment de la proteïna de l'orina a les 24 h va indicar que elfunció renaltambé va quedar malmès. Al mateix temps, l'absència deSidt2va provocar una disminució del nombre de lisosomes àcids, una disminució de l'activitat i l'expressió de la hidrolasa àcida al lisosoma i un augment del pH al lisosoma, cosa que suggereix que la funció lisosomal es va deteriorar desprésSidt2supressió. L'acumulació d'autofagolisosomes, l'augment dels nivells de proteïnes LC3-II i P62 i la disminució dels nivells d'ARNm de P62 van indicar que l'absència delSidt2el gen va causar una via d'autofàgia anormalfloi. Experiment amb cloroquina, immunològicflautofagosoma d'urescència, assaig de fusió de lisosomes i Ad-mcherry-GFP-LC3B van indicar a més que, desprésSidt2la supressió, la producció d'autofagosomes no va augmentar, però la fusió d'autofagosomes i lisosomes i la degradació dels autofagolisosomes es van veure deteriorades. En incubarSidt2−/−cèl·lules amb l'activador de l'autofàgia rapamicina, vam trobar que podia activar l'autofàgia, que es va manifestar com un augment dels autofagosomes, però no podia millorar la degradació de l'autofagolisosoma. Mentrestant, va il·lustrar més que elSidt2El gen té un paper important en el bon progrés dels processos autofagolisosomes. En resum, l'absència delSidt2El gen va causar alteracions en la funció dels lisosomes i una disminució del nombre de lisosomes àcids, donant lloc a trastorns de formació i degradació dels autofagolisosomes, que finalment es van manifestar com aestructura i funció renal anormal. Sidt2és essencial per mantenir la funció normal dels lisosomes i l'estabilitat fisiològica dels ronyons.
INTRODUCCIÓ
La visió tradicional és que els lisosomes són les escombraries de les cèl·lules per eliminar els residus produïts per les cèl·lules [1–3]. No obstant això, molts estudis han demostrat que el paper dels lisosomes és molt més complex i pot implicar la transducció del senyal cel·lular, la tumorigènesi, el desenvolupament i altres aspectes que afecten les activitats vitals del cos [4–10]. Els lisosomes solen estar enriquits en teixits com el fetge i el ronyó [11]. Per tant, la disfunció lisosomal també està estretament relacionada amb malalties dels teixits del fetge i del ronyó, com la malaltia de Gaucher [12], la mucopolisacaridosi [13], la malaltia de Niemann-Pick [14], la glomeruloesclerosi retardada [15], la nefropatia membranosa idiopàtica [16] Les proteïnes de membrana lisosomals (LMP) són els components de la membrana la funció dels quals no és només mantenir la integritat del lisosoma sinó que també intervenen en diversos aspectes com la transducció i la regulació del senyal intracel·lular que són essencials per mantenir la funció del lisosoma. i activitats de la vida cel·lular [17–19].
Fins ara, s'han descobert més de 100 LMP, però encara es desconeixen les funcions de la majoria d'ells [20]. El membre 1 de la superfamília transmembrana 7 (TM7SF1) és essencial per al manteniment de la funció dels podòcits renals [21] i té un paper important en el procés de desenvolupament del ronyó [22]. El canal 5 de voltatge de clorur (ClC-5) és un canal d'ions clorur (Cl(−)) expressat en túbuls renals, que és essencial per a la funció tubular renal normal [23]; quan està mutat, pot causar la malaltia de Dent [24]. La sobreexpressió del canal 7 de voltatge de clorur (ClC-7) impedeix l'apoptosi de les cèl·lules epitelials tubulars renals causada per un estat redox deteriorat [25]. Aquests estudis demostren que, com a components del teixit renal enriquit amb lisosomes, els LMP són essencials per mantenir la funció normal, però encara no està clar el mecanisme específic de la seva patogenicitat relacionada.
La família transmembrana SID1, membre 2 (Sidt2) és una LMP recentment descoberta que s'expressa molt en els teixits hepàtics i renals [26]. Estudis anteriors han demostrat que la supressió de Sidt2 pot causar malalties relacionades amb el fetge, que es manifesten com a esteatosi hepàtica i trastorns del metabolisme dels lípids del fetge [11, 18]. En un estudi recent, vam trobar que els ronyons dels ratolins Sidt2-/- també van patir danys, però el mecanisme específic no està clar. Els lisosomes són òrgans executius importants per a l'autofàgia [10]. Hi ha implicat la regulació de l'autofàgia? En aquest estudi, vam examinar la correlació entre la funció lisosomal (autofàgia) i la malaltia i vam explorar el mecanisme subjacent que implica Sidt2 que causa danys renals, que serà de gran ajuda per a l'estudi de la correlació entre LMP i malaltia.
RESULTATS
El model Sidt2−/− ho mostradany renals'associa amb l'acumulació d'autofagolisosomes
El mètode de construcció de ratolins Sidt2-/- es mostra a la figura 1A. L'ADN de la cua de ratolí homozigot obtingut es va seqüenciar i el resultat de la seqüenciació va ser unimodal (Fig. 1B), i es va produir una pèrdua de fragment de 199 pb en el segon exó. Mitjançant la identificació del genotip per PCR, vam trobar que els ratolins Sidt2+/+ (Tipus salvatge, WT) tenien segments d'ADN de 685 pb, mentre que els ratolins Sidt2-/- tenien 486 pb (Fig. 1C). Com es mostra a la figura 1D, la proteïna Sidt2 difícilment es va poder detectar en ratolins Sidt2-/- que no pas en WT, la qual cosa va suggerir que el model es va construir amb èxit. Mitjançant una prova d'orina, es va trobar que la proteïna de l'orina de 24 h va augmentar significativament en els ratolins Sidt2-/- en comparació amb el WT (Fig. 1E), cosa que suggereix que la barrera de filtració renal es va deteriorar després de la supressió de Sidt2. Les observacions de microscòpia electrònica de transmissió (Fig. 1F) van mostrar que, en comparació amb els ratolins WT (a–f), els ronyons de ratolí Sidt2-/- presentaven fusió difusa dels processos del peu, engrossiment de la membrana basal glomerular (g, h), epitelial tubular renal. edema cel·lular, dany de microvellositats (i, j), edema mitocondrial, canvis semblants a vacúols i desaparició de les espines (k, l). Curiosament, els ratolins Sidt2-/- també han mostrat un gran nombre d'acumulació d'autofagolisosomes (mostrats per fletxes vermelles, m, n), i el nombre era significativament superior al del control (Fig. 1G). A nivell cel·lular, vam trobar que Sidt2 també era essencial per a la supervivència de les cèl·lules renals. La supressió del gen Sidt2 provoca una disminució de la proliferació i un augment de l'apoptosi de les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 (figura suplementària 1).
La supressió del gen Sidt2 condueix a canvis en el nombre i la funció dels lisosomes àcids a les cèl·lules renals del ratolí
La tecnologia Crispr-Cas9 es va utilitzar per eliminar el gen Sidt2 a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 per obtenir els models cel·lulars. Les verificacions del nivell d'ARNm i proteïnes (Fig. 2A-C) es van realitzar mitjançant qRT PCR i western blotting respectivament, que mostren que els models es van construir amb èxit. El sistema de degradació mediat per lisosomes és un pas clau en la degradació de l'autofàgia. Com a LMP indispensable, el knockout del Sidt2 afectarà les expressions de proteïnes relacionades amb els lisosomes? Vam mesurar la proteïna de membrana 1 (LAMP1) associada a lisosomal LMP. Els resultats van mostrar que l'expressió de LAMP1 va disminuir després de la supressió de Sidt2 a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 (Fig. 2D, E). També vam utilitzar LysoTracker per etiquetar els lisosomes àcids i vam trobar que el nombre de lisosomes àcids va disminuir després de la supressió de Sidt2 en ambdós tipus de cèl·lules (Fig. 2F, G). Posteriorment, vam mesurar la catepsina B lisosomal (CTSB) i vam trobar que al teixit renal del ratolí (Fig. 2H, I), cèl·lules MPC5 (Fig. 2J, K) i cèl·lules SV40 MES 13 (Fig. 2L, M), les expressions de CTSB als models Sidt2-/- es van reduir tots, cosa que indica que l'activitat de l'enzim proteolític als lisosomes es va reduir quan es va suprimir el gen Sidt2. De la mateixa manera, l'expressió del precursor CTSB en els dos tipus de cèl·lules del grup Sidt2-/- es va reduir significativament, cosa que indica que el CTSB també es va veure afectat després de la supressió de Sidt2. A més, vam utilitzar LysoSensor per detectar l'entorn àcid dels lisosomes. Com més baixa sigui la relació d'intensitat de fluorescència, més alt serà el valor del pH del lisosoma. Els resultats van mostrar que després de la supressió de Sidt2, el valor del pH augmentava (Fig. 2N, O) i l'acidificació era anormal. Per explorar més si les anomalies lisosomiques anteriors es deuen a un nombre anormal de lisosomes o a funcions lisosomals anormals, vam investigar les cèl·lules mitjançant microscòpia electrònica (Fig. 2P). Hem trobat que no hi ha canvis evidents en el nombre de lisosomes primaris i el nombre total de lisosomes (inclosos els lisosomes primaris i secundaris) després de la supressió de Sidt2 (Fig. 2Q).
La via de l'autofàgia renal és anormal després de l'eliminació de Sidt2
Com s'ha esmentat anteriorment, es va observar un gran nombre d'acumulació d'autofagolisosomes a les cèl·lules renals de ratolins Sidt2-/-, cosa que suggereix que la via de l'autofàgia era anormal. Mitjançant l'anàlisi de western blot, es va demostrar que hi havia un augment significatiu del nivell de proteïnes del conjugat de LC3-fosfatidiletanolamina (LC3-II) i del sequestosome 1 (P62) al ronyó de Sidt2−/− ratolins i un augment de les expressions de proteïnes relacionades amb l'autofàgia de 5 (Atg5), 7 (Atg7) i 12 (Atg12) relacionats amb l'autofàgia (Fig. 3A, B). Tanmateix, el nivell d'ARNm de P62 es va reduir significativament (Fig. 3C), cosa que suggereix que la via de l'autofàgia era anormal després de l'eliminació de Sidt2 in vivo. Aleshores vam trobar que les expressions de les proteïnes autofàgiques LC3-II, P62, Atg5, Atg7 i Atg12 també es van incrementar (Fig. 3D-G) en els dos tipus de cèl·lules renals després de la supressió de Sidt2, que va ser coherent. amb l'in vivo. L'augment de LC3-II va indicar un augment dels autofagosomes a les cèl·lules renals després de la supressió de Sidt2, que pot ser causat per l'activació de l'autofàgia o la degradació bloquejada dels autofagosomes. La immunofluorescència P62 (Fig. 3H) va mostrar clarament un augment del contingut de P62 a les cèl·lules Sidt2-/- (Fig. 3I). Contràriament al nivell de proteïnes, qRT-PCR va mostrar que el P62 va disminuir significativament a nivell d'ARNm (Fig. 3J), cosa que indica que l'augment de P62 estava relacionat amb una degradació insuficient. Els augments d'Atg5, Atg7 i Atg12 van indicar que l'autofàgia va començar i es va formar amb normalitat, però l'acumulació de P62 també va suggerir obstacles al procés d'autofàgia, i aquesta contradicció ens va obligar a explorar més a fons la veritable situació del flux d'autofàgia.
In vitro, l'aplicació de cloroquina indica un flux d'autofàgia reduït després de la pèrdua de Sidt2. L'experiment de la cloroquina és un dels experiments clàssics per observar el flux d'autofàgia. Per entendre els motius dels augments de LC3-II i P62 després de la supressió de Sidt2, hem utilitzat cloroquina (CQ), un inhibidor de l'autofàgia aigües avall, per actuar sobre les cèl·lules per observar el flux d'autofàgia. En primer lloc, hem utilitzat diferents gradients de concentració per confirmar que la concentració de saturació inhibida per CQ era de 50 μM (Fig. 4A-F) a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13. A més d'aquesta concentració, quan la concentració de CQ va continuar augmentant, LC3-II i P62 no van augmentar més per assolir la saturació. Per tant, vam utilitzar una estimulació CQ de 50 μM durant 16 h per inhibir completament el flux d'autofàgia i, en aquest moment, les diferències LC3-II entre el grup Sidt{2+/+ i el grup Sidt2-/- van desaparèixer a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13. De la mateixa manera, després d'un processament CQ de 50 μM, les diferències P62 causades per la supressió de Sidt2 també van desaparèixer (Fig. 4G, H, J, K). Les estadístiques sobre el flux d'autofàgia van mostrar que va disminuir quan faltava Sidt2 (Fig. 4I, L), la qual cosa va confirmar a més que els augments de l'expressió LC3-II i P62 després de la supressió de Sidt2 es van deure a la fallada de l'eliminació de l'autofàgia. més que l'augment del nivell d'autofàgia (l'activació de l'autofàgia).
Alteració de la fusió autofagosoma-lisosoma in vitro després de la supressió de Sidt2 L'eliminació i la degradació són les etapes mitjanes i últimes del procés d'autofàgia, que impliquen la fusió de l'autofagosoma amb una disminució després de la supressió del Sidt2 (Fig. 5D), cosa que indica que la fusió de els autofagosomes i els lisosomes es van deteriorar.
Fig. 1Dany renali acumulació d'autofagolisosomes en ratolins Sidt2-/-. Un esquema d'orientació del gen del sistema Cre-LoxP; B més amunt és el diagrama de seqüència exportat de l'ADN de la cua del ratolí knockout del gen Sidt2; a continuació es mostra el mapa de seqüenciació, la fletxa indica la ubicació del gen que falta. En comparació amb els ratolins WT, es produeix una pèrdua de gens de 199 pb a l'exó 2; C Verificació del nivell d'ADN de Sidt2 (extret del teixit de la cua). El producte amplificat d'imprimació conté la regió d'eliminació de la base, mostrada com Sidt2+ /+(WT), Sidt2+/− o Sidt2−/−; Verificació del nivell de proteïna D per detectar els nivells d'expressió de proteïna Sidt2 mitjançant western blot; Proteïna d'orina de 24 h de ronyó E en ratolins WT i Sidt2−/−; Estructura ultramicromorfològica F dels ronyons de ratolins WT (a, f) i Sidt2−/− (g–n). En comparació amb el ratolí WT, el ronyó del ratolí Sidt2−/− mostra fusió del procés del peu, engrossiment de la membrana basal (g, h), edema de cèl·lules epitelials tubulars renals, dany de microvellositats (i, j), destrucció mitocondrial (k, l) i acumulació d'autofagolisosomes (m, n); G nombre total d'autofagolisosomes renals en ratolins WT i Sidt2-/-. *P < 0.05, **P < 0,01.
Fig. 3 La supressió de Sidt2 altera la via de l'autofàgia. Una detecció de nivells d'expressió de proteïnes relacionats amb l'autofàgia cel·lular WT i Sidt2-/- mitjançant western blot; B gràfics estadístics dels resultats de la prova de western blot; Nivell d'expressió d'ARNm de C P62 en teixits renals de ratolins WT i Sidt2−/−; Nivells d'expressió D de proteïnes de la via d'autofàgia de cèl·lules MPC5 abans i després de la eliminació de Sidt2; E gràfic estadístic del gràfic (D); Nivells d'expressió F de proteïnes de la via de l'autofàgia a les cèl·lules SV40 MES 13 abans i després de la eliminació de Sidt2; G gràfic estadístic del gràfic (F); Immunofluorescència H P62 a cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 abans i després de la eliminació de Sidt2; I gràfics estadístics dels resultats de la immunofluorescència; Nivells d'expressió d'ARNm de J P62 a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 abans i després de la eliminació de Sidt2. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.
Ad-mCherry-GFP-
El doble etiquetatge de fluorescència LC3B suggereix que la formació d'autofagolisosomes i la seva via de degradació es van bloquejar després de la supressió de Sidt2. L'experiment de transfecció Ad-mCherry-GFP-LC3B es pot utilitzar per detectar canvis en el flux dinàmic d'autofàgia dins de les cèl·lules. Durant el procés d'autofàgia, mCherry-GFP-LC3B es reuneix a la membrana de l'autofagosoma i es manifesta en forma de taques grogues sota un microscopi de fluorescència. Quan els autofagosomes i els lisosomes es fusionen per formar autofagolisosomes, l'entorn àcid dins del lisosoma apagarà la fluorescència de GFP perquè es manifesti en forma de taques vermelles. Per tant, la GFP unida a LC3 només es pot utilitzar per detectar autofagosomes, mentre que mCherry pot detectar autofagosomes i autofagolisosomes alhora. Quan les taques de fluorescència verdes i vermelles es combinen i es mostren com a taques de fluorescència grogues, això correspon als autofagosomes. En aquest moment, la fluorescència vermella pot indicar autofagolisosomes i també pot indicar la suavitat de la formació d'autofagolisosomes [27]. Les cèl·lules MPC5 i les cèl·lules SV40 MES 13 dels grups Sidt2+/+ i Sidt2-/- es van transfectar amb adenovirus Ad-mCherry GFP-LC3B i es van fotografiar amb un microscopi làser confocal (Fig. 6A). Es va trobar que el nombre de punts fluorescents grocs va augmentar i el nombre de punts fluorescents vermells va disminuir (Fig. 6B, C) després de la supressió de Sidt2, va demostrar que el nombre d'autofagosomes va augmentar i els autofagolisosomes van disminuir en el grup Sidt2-/-. Això es deu al fet que hi havia obstacles per a la formació d'autofagolisosomes i es van bloquejar les vies de degradació de l'autofagolisosoma, cosa que va provocar obstacles de degradació de l'autofagosoma.
La rapamicina no va millorar l'acumulació de P62 causada per la supressió de Sidt2, sinó que la va agreujar. La rapamicina (RAPA) és un inhibidor de mTOR i activa l'autofàgia. Quan RAPA va actuar sobre les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 dels grups Sidt2+/+ i Sidt2−/−, va augmentar les quantitats de LC{3-II en ambdós grups. Això significava que RAPA podria activar la via aigües amunt de l'autofàgia. De la mateixa manera, vam trobar que l'augment del nivell LC3-II al grup Sidt2−/− amb RAPA era més evident que al control (grup Sidt{{2+/+), mostrant que quan actuava RAPA al grup Sidt2−/−, la degradació dels autofagosomes encara no es va millorar. Mentrestant, també vam observar els canvis a P62 i vam trobar que quan RAPA va actuar sobre el grup Sidt2+/+ de cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13, P62 no va canviar significativament, cosa que indica que el flux d'autofàgia era normal. Quan RAPA va actuar sobre el grup Sidt2-/-, el nivell d'expressió de P62 es va incrementar encara més en comparació amb el que havia estat abans de l'administració i també era més evident que el control després del tractament amb RAPA (Fig. 7A, B, D, E). Posteriorment, per explorar les raons de l'expressió inconsistent de la proteïna P62 després de tractar el grup Sidt2+/+ i Sidt2−/− amb RAPA, vam mesurar els nivells d'ARNm de P62 i vam trobar que el nivell augmentava. després del tractament RAPA tant en el grup Sidt2+/+ com en el grup Sidt2−/−, i el grup Sidt{2+/+ va tenir un nivell més alt que el grup Sidt2−/− (Fig. 7C). , F), cosa que podria demostrar encara més que el flux de l'autofàgia era suau al grup Sidt2+/+, mentre que el trastorn del flux de l'autofàgia es va produir al final de l'autofàgia al grup Sidt2−/−, és a dir, la degradació dels autofagolisosomes. enllaç. També vam estudiar l'efecte de Sidt2 sobre la proliferació i l'apoptosi de les cèl·lules renals en condicions d'autofàgia activada i vam trobar que després de l'activació cel·lular de l'autofàgia induïda pel medi sense sèrum, en comparació amb el grup control, la proliferació de Sidt2−/− El grup es va inhibir encara més i l'apoptosi era més evident (figura suplementària 2).
Fig. 5 La fusió d'autofagosoma i lisosoma s'impedeix després de la supressió de Sidt2. Una co-localització d'immunofluorescència de LC3B i LAMP1 en cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 abans i després de la eliminació de Sidt2, anàlisi amb el coeficient de correlació de Pearson; Comparació B dels punts de fluorescència LC3B abans i després de la eliminació de Sidt2 a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13; C comparació del coeficient de correlació de Pearson abans i després de Sidt2 knockout a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13; D comparació de la velocitat de fusió abans i després de la eliminació de Sidt2 a les cèl·lules MPC5 i SV40 MES 13 (la relació entre el nombre de taques fluorescents co-localitzades de LAMP1 i LC3B al nombre de taques fluorescents de LAMP1); *P <0,05, **P <0,01.
Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:
Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
