Resum
Antecedents L'AKI és una seqüela comuna de la infecció per SARS-CoV-2 i contribueix a la gravetat i la mortalitat de la COVID-19. Aquí, vam provar la hipòtesi quealteracions renalsinduït per l'AKI associada a COVID-19 es podria detectar a les cèl·lules recollides de l'orina. Mètodes Hem realitzat la seqüenciació d'ARN unicel·lular (scRNAseq) en cèl·lules recuperades de l'orina de vuit pacients hospitalitzats amb COVID-19 amb (n55) o sense AKI (n53), així com quatre pacients amb AKI no COVID-19. (n54) per avaluar les diferències en la composició cel·lular i l'expressió gènica durant l'AKI. Resultats L'anàlisi de 30.076 cèl·lules va revelar una varietat diversa de tipus cel·lulars, la majoria dels quals erenronyó, cèl·lules urotelials i immunes. L'anàlisi de les vies de cèl·lules tubulars de pacients amb AKI va mostrar un enriquiment de les transcripcions associades a vies relacionades amb el dany en comparació amb aquelles sense AKI. L'expressió ACE2 i TMPRSS2 va ser més alta a les cèl·lules urotelials entre els tipus de cèl·lules recuperades. En particular, en un pacient, vam detectar ARN viral del SARS-CoV-2 a les cèl·lules urotelials. Aquestes mateixes cèl·lules es van enriquir per a transcripcions associades a vies antivirals i antiinflamatòries. Conclusions Hem realitzat amb èxit scRNAseq en sediments urinaris de pacients hospitalitzats amb COVID-19 per estudiar de manera no invasiva les alteracions cel·lulars associades amb AKI i vam establir un conjunt de dades que inclou cèl·lules renals lesionades i no lesionades. A més, oferim proves preliminars de la infecció directa de les cèl·lules de la bufeta urinària per SARS-CoV-2. El sediment urinari conté una gran quantitat d'informació i és un recurs útil per estudiar la fisiopatologia i les alteracions cel·lulars que es produeixen enmalalties renals.
ALIMENTS ECOLÒGICS PER A LA SALUT DEL RONDON
Introducció
La infecció per coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la síndrome respiratòria aguda severa desencadena patologia en diversos sistemes, inclòs el ronyó, i l'IRA s'associa a una morbiditat i mortalitat significatives en la malaltia coronavirus 2019 (COVID-19) (1 –5). Diversos estudis han demostrat taxes elevades d'IRA entre els pacients hospitalitzats amb COVID-19 (6), amb alguns que han informat que fins al 50% de les persones infectades desenvolupen AKI (7–9). El receptor primari del SARS-CoV-2 ACE2 s'expressa a les cèl·lules epitelials de tot el sistema urinari, incloses les cèl·lules del túbul proximal i les cèl·lules urotelials (10-13), tot i que no està clar si AKI en pacients amb COVID-19 es deu a una infecció viral directa dels túbuls proximals o és el resultat de la resposta sistèmica al SARS-CoV-2 (14-22). De la mateixa manera, no està clar si el SARS-CoV-2 pot causar cistitis viral mitjançant la infecció directa de cèl·lules urotelials, tot i que s'ha proposat aquesta possibilitat (23–26). Malgrat l'alta prevalença d'AKI associada a COVID-19, les alteracions cel·lulars subjacents que es produeixen en l'entorn de l'AKI segueixen sent poc enteses.
L'AKI associada a COVID-19 s'ha mantingut en gran mesura poc estudiada, ja que l'accés al teixit renal requereix una biòpsia o una anàlisi postmortem (27). Estudis recents han detectat una varietat diversa de cèl·lules renals, vesicals i immunitàries a l'orina (28-30). Així, l'orina pot oferir una visió valuosa de l'estudi no invasiu dels canvis renals durant l'IRA associada a COVID-19. Aquí, vam realitzar la seqüenciació d'ARN unicel·lular (RNA-Seq) per caracteritzar la diversitat cel·lular a l'orina de pacients hospitalitzats amb COVID-19 amb i sense AKI. Vam provar la hipòtesi que es podrien detectar alteracions renals en l'AKI associada a COVID-19 a les cèl·lules recollides de l'orina. També vam recollir mostres de pacients sense COVID-19 i amb AKI (que no és COVID-19). Hem trobat diverses poblacions de cèl·lules immunes inflamatòries i vies activades de manera diferencial en l'IRA associada a COVID-19, així com proves preliminarsper a la infecció directa de cèl·lules urotelials per SARS-CoV-2.
Materials i mètodes
Participants i variables Els adults de 18 anys i més van ser examinats durant l'ingrés o el trasllat a l'hospital de la Universitat d'Alabama a Birmingham (UAB) entre març i maig de 2021. Els casos d'IRA es van identificar mitjançant elMalaltia renalMillora de la definició dels resultats globals com un augment de la creatinina sèrica (sCr) .0,3 mg/dl en 48 hores o 0,1,53 de creatinina basal. Els controls sense canvis en la creatinina es van seleccionar en funció de la concordança d'edat i sexe quan era possible i es van processar amb cada mostra d'AKI respectiva. El sCr basal es va determinar mitjançant el valor sCr més recent entre 7 i 365 dies abans de l'hospitalització. Es van extreure dades clíniques addicionals sobre la demografia, la història clínica, les característiques clíniques i els valors de laboratori dels gràfics de pacients mitjançant l'equip i2b2 del Centre de Ciències Clíniques i Translacionals de la UAB. Es van incloure vuit pacients hospitalitzats amb COVID-19, cinc amb IRA i tres sense IRA. Aquest estudi i la col·lecció d'exemplars van ser aprovats per la Junta de Revisió Institucional de la UAB. L'equip de consulta de nefrologia aguda de la UAB també va recollir mostres de pacients amb AKI no COVID-19 (n54) per comparar els canvis cel·lulars amb l'IRA associada a COVID-19. Es van recollir sota un protocol diferent de la junta de revisió institucional que permet la recollida de mostres d'orina restants i, per tant, és anònima.
Recollida i processament de mostres
Tots els passos es van fer sobre gel. L'orina es va recollir com a mostra buida o d'un catèter urinari. Les mostres es van transferir immediatament a un laboratori de nivell de bioseguretat 21 per al seu processament. Les mostres d'orina es van transferir a un tub cònic de 50-ml i es van centrifugar a 10.003 g durant 10 minuts a 4ºC. Els pellets de cèl·lules es van rentar amb PBS fred amb gel, es van filtrar a través d'un filtre de 40- mm i es van centrifugar de nou. Les cèl·lules vives es van purificar mitjançant el kit d'eliminació de restes MACS (Miltenyi Biotec) seguit del kit d'eliminació de cèl·lules mortes EasySep Annexin V (StemCell). Breument, les cèl·lules es van tornar a suspendre en PBS gelat i es van barrejar amb una solució d'eliminació de residus. Es va sobreposar PBS fred a la barreja i es va centrifugar a 3003 g durant 10 minuts a 4 C. Es van aspirar les dues fases superiors i, a continuació, es van rentar les cèl·lules restants amb PBS. Les cèl·lules es van tornar a suspendre i es van barrejar amb Dead Cell Removal Cocktail, Biotina Selection Cocktail i, després, RapidSpheres abans de la separació en un imant EasySep. Les cèl·lules es van rentar i es van tornar a suspendre en 52 ml de PBS (sense calci ni magnesi) 10, 04% BSA (Fisher Scientific) per al processament de scRNAseq
scRNAseq
Les cèl·lules purificades es van transferir a la citometria de flux de la UAB i al nucli cel·lular únic i es van processar immediatament mitjançant el kit de seqüenciació d'ARN monocel·lular Chromium 39 (103Genòmica) segons el fabricant'instruccions s.Es va comptar la suspensió cel·lular, combinada amb 103 Mescla de reactiu de crom, i carregat en un microfluídicdispositiu de partició unicel·lular en què es fa la lisi i la inversala transcripció es produeix en microgotes. L'ADNc resultantera amplifieditat per PCR i posteriorment processat per produir-lo
biblioteques de seqüenciació amb codi de barres. La seqüenciació d'extrems aparellats es va dur a terme a la plataforma de seqüenciació Illumina NovaSeq6000 o NextSeq500 (Illumina). S'han processat les lecturesutilitzant el 103 Programari d'una cèl·lula Genomics Cell RangerSuite versió 6.0 a la UAB Cheaha High-PerformanceClúster d'Informàtica. BCLfiels es van convertir a FASTQfiutilitzant la funció ràpida CellRanger. CellRangerFast es va utilitzar per alinear FASTQfiles a un genoma personalitzatformat pel genoma humà hg38 (GRCh38.p13) amb
el genoma SARS-CoV-2 (NC_045512.2) inserit com a exó (31). Per a l'anàlisi es van crear la taula de gens, la taula de codis de barres i les matrius d'expressió transcripcionalindicat a continuació.
Anàlisis de dades
Les anàlisis es van realitzar mitjançant paquets creats per a l'entorn d'anàlisi estadística R (versió 4.06). Les dades es van analitzar principalment a la versió 3.2.3 (32,33) de Seurat i la sevadependències associades. Dades de cada pacients'han importat mitjançant Read103 funció i després strucconvertit en un objecte Seurat mitjançant CreateSeuratObject. Percontrol de qualitat, les cèl·lules amb característiques úniques compten més de 2500o menys de 200 i cèl·lules amb proporcions mitocondrials de.el 15% ho erenfifiltrat. Les dades es van normalitzar mitjançant LogNormalitzar i escalar per preparar-se per a una dimensionalitat linealreducció. Els objectes de pacients individuals es van etiquetaramb identitat de grup únicfications i després es van fusionar en aúnic objecte utilitzant la funció de combinació de Seurat. Pacient sames van integrar amb la funció RunHarmony utilitzantel paquet Harmony R (34). Anàlisi de components principalses va realitzar i, després, es van agrupar les cèl·lules en funcióexpressió gènica diferencial determinada pel SeuratLa funció FindAllMarkers s'ha establert en una resolució d'un. DimensióLa reducció sional es va realitzar mitjançant un col·lector uniformeaproximació i projecció. Els tipus cel·lulars eren idènticsfiedcomparant les transcripcions expressades de manera diferencial percada clúster amb transcripcions conegudes associades a especific tipus de cèl·lules (29, 35, 36). Es va utilitzar el paquet Escape R per executar-seAnàlisi d'enriquiment del conjunt de gens (GSEA) (37). WebGestaltRes va utilitzar per a l'anàlisi d'ontologia gènica per identificar viesutilitzant el procés biològic i l'enciclopèdia de Kyoto deBases de dades de gens i genomes (38).
