El lloc de vulnerabilitat al SARS-CoV-2 Spike indueix anticossos de protecció àmplia contra subvariants Omicron antigènicament diferents

La ràpida evolució de les variants d'Omicron de la síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha posat èmfasi en la necessitat d'identificar anticossos amb àmplies capacitats de neutralització per informar les futures teràpies monoclonals i estratègies de vacunació. Aquí, vam identificar S728-1157, un anticòs neutralitzant àmpliament (bnAb) dirigit al lloc d'unió al receptor (RBS) que es va derivar d'un individu infectat prèviament amb WT SARS-CoV-2 abans de la propagació de variants de preocupació (COV). S728-1157 va demostrar una àmplia neutralització creuada de totes les variants dominants, incloses D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu i Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). A més, S728-1157 va protegir els hàmsters contra els reptes in vivo amb els virus WT, Delta i BA.1. L'anàlisi estructural va demostrar que aquest anticòs s'adreça a un epítop de classe 1/RBS-A al domini d'unió al receptor mitjançant múltiples interaccions hidrofòbiques i polars amb la seva regió 3 que determina la complementarietat de la cadena pesada (CDR-H3), a més de motius comuns en CDR-H1/ Anticossos CDR-H2 de classe 1/RBS-A. És important destacar que aquest epítop era més fàcilment accessible en estat obert i de prefusió, o en les construccions d'espiga estabilitzades amb hexaprolina (6P), en comparació amb les construccions de diprolina (2P). En general, S728-1157 demostra un ampli potencial terapèutic i pot informar els dissenys de vacunes dirigits a objectius contra futures variants del SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Introducció

Des de l'inici de la pandèmia el desembre de 2019, el virus de la síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha provocat més de 660 milions de casos de malaltia coronavirus 2019 (COVID{-19) i més de 6,5 milions de morts a tot el món. Tot i que el desenvolupament i la distribució ràpids de vacunes i terapèutiques han frenat en gran mesura l'efecte de la COVID-19, l'aparició de variants de preocupació circulants (COV) continua representant una amenaça important a causa del potencial d'una evasió immune addicional. i una major patogenicitat. La variant D614G va ser la variant més primerenca que va sorgir i es va convertir en universal a partir de llavors. En comparació amb WT, la variant D614G presentava una transmissibilitat més gran en lloc d'una patogenicitat més gran i, per tant, era poc probable que reduís l'eficàcia de les vacunes en els assaigs clínics (1). Entre l'aparició de D614G i l'octubre de 2021, 4 COV significatius addicionals van evolucionar a tot el món, inclosos Alpha, Beta, Gamma i Delta. Entre aquestes variants, Delta es va convertir en una amenaça global greu a causa de la seva transmissibilitat, l'augment de la gravetat de la malaltia i l'evasió immune parcial, com ho demostra la capacitat reduïda del sèrum policlonal i els mAbs per neutralitzar aquesta soca (2-6). Poc després, el novembre de 2021, la variant Omicron es va identificar i es va anunciar com un nou COV. Aquesta variant posseïa el major nombre de mutacions fins ara i semblava que s'estenia més ràpidament que les soques anteriors (7, 8). Actualment, hi ha una àmplia gamma de sublíniatges d'Omicron que condueixen a nous casos de COVID-19, amb BQ.1, BQ.1.1 i XBB.1.5 dominant sobre BA.5 i representant la majoria de casos nous a tot el món en aquell moment. d'escriptura. Les variants d'Omicron poden escapar del reconeixement de la immunitat associada a la vacuna COVID-19 en diferents graus, reduint així significativament la potència neutralitzadora dels anticossos sèrics d'individus convalescents i totalment vacunats amb ARNm i d'individus potenciats amb el nou bivalent WT/BA.5. Vacuna d'ARNm (9, 10). De la mateixa manera, les variants d'Omicron van poder escapar de la unió de diversos mAbs terapèutics d'autorització d'ús d'emergència (EUA), tot i que anteriorment s'havien demostrat que eren eficaços contra els COV anteriors (10-12). A causa de la reducció de la neutralització contra Omicron i de l'amenaça continuada dels COV futurs, hi ha una necessitat urgent d'identificar anticossos neutralitzants amplis i potents que puguin protegir contra llinatges SARS-CoV-2 diversos i en evolució. En aquest estudi, vam identificar un potent mAb reactiu al domini d'unió al receptor (RBD-reactiu) de la sang perifèrica d'un individu convalescent del SARS-CoV-2 que va neutralitzar eficaçment Alpha, Beta, Kappa, Delta, Mu, i variants Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 i XBB). Aquest mAb, S728-1157, va reduir significativament les càrregues virals BA.1 Omicron, Delta i WT als pulmons i la mucosa nasal després del desafiament in vivo en hàmsters. S728-1157 s'uneix al lloc d'unió del receptor (RBS) que està totalment exposat quan el RBD de l'espiga està en la conformació amunt. El mAb utilitza motius que es troben a CDR-H1 i CDR-H2 que són comuns als anticossos IGHV3-53/{3-66 classe 1/RBS-A (13, 14), però també a través de contactes únics extensos amb CDR. -H3 per evitar mutacions en els pics de COV. Això suggereix que s'hauria de modificar el disseny racional dels futurs augments de la vacuna que cobreixen variants d'Omicron per presentar un pic estabilitzat en la configuració majoritàriament amunt per induir de manera òptima els mAbs de classe 1/RBS-A que tinguin característiques CDR-H3 similars.

Beneficis de cistanche: enforteix el sistema immunitari

Resultats

Aïllament de mAbs reactius a RBD que presenten patrons diversos de neutralització i potència. Abans de la propagació dels llinatges Omicron, prèviament vam caracteritzar 43 mAbs dirigits a diferents epítops de la proteïna espiga, inclòs el domini N-terminal (NTD), RBD i la subunitat 2 (S2). Cap d'aquests anticossos va ser capaç de neutralitzar les variants del SARS-CoV-2 que circulaven en aquell moment (15). En aquest estudi, es va expressar un panell addicional de mAbs reactius a RBD a partir de 3 individus amb gran resposta que van muntar respostes robustes d'IgG anti-spike, tal com es va definir anteriorment (16) (Taules suplementàries 1 i 3; material suplementari disponible en línia amb aquest article; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Tot i que la proporció de cèl·lules B que s'uneixen a RBD d'espiga va ser similar en els que responen alts en comparació amb els de resposta mitjana i baixa (figura 1, A-C), les taxes d'hipermutació somàtica de cadena pesada eren significativament més grans en el grup de resposta alta (figura 1). , D i E), cosa que suggereix que aquests individus poden tenir el potencial més alt per generar potents mAbs de reacció creuada (16). Aquests anticossos es van investigar més contra mutants RBD per identificar les seves classificacions d'epítops (17). Entre 14 mAbs reactius a RBD, vam identificar 4 mAbs de classe 2, 2 mAbs de classe 3 i 8 mAbs no classificats que van mostrar poca o cap reducció de la unió contra cap mutant RBD clau provat (figura 1F). Cal destacar que els anticossos de classe 2, classe 3 i classe 4 corresponen aproximadament als epítops RBS BD, S309 i CR3022 definits en estudis anteriors (13, 18). Els mAb RBD de classe 2 i 3 no van reconèixer un mutant RBD multivariant que contenia substitucions K417N/E484K/L452R/N501Y, un RBD dissenyat artificialment per incloure mutacions clau per a la fugida del virus (17, 18), ni van demostrar cap reactivitat creuada amb el RBD del SARS-CoV-1 i la síndrome respiratòria de l'Orient Mitjà (MERS)-CoV (figura 1F). Funcionalment, els mAbs RBD de classe 2 i 3 van neutralitzar potentment les variants D614G i Delta, però l'activitat neutralitzadora era més limitada contra Beta, Kappa i Mu (figura 1G). Cap dels anticossos de classe 2 o 3 analitzats va neutralitzar cap variant d'Omicron provada.

En canvi, la majoria dels mAb no classificats es van unir a la multivariant RBD i van reaccionar creuament amb el SARS-CoV -1 RBD (figura 1F). Entre aquests, vam identificar 3 mAb, S451-1140, S626-161 i S{728-1157, que mostraven una alta potència de neutralització contra D614G i Beta, Delta, Kappa, Mu i neutralitzats creuats. Omicron BA.1 amb una concentració inhibidora del 99% (IC99) en el rang de 20-2.500 ng/mL (figura 1G). Donada l'àmplia potència de neutralització d'aquests 3 mAb, a més de la plataforma d'assaig de placa, també vam realitzar l'activitat de neutralització contra l'autèntic BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, Els virus BA.5 i XBB utilitzen la prova de neutralització de reducció de focus (FRNT) (figura 1G). D'aquests, S728-1157 va mostrar activitats neutralitzants elevades contra el panell de variants d'Omicron incloent BA.1, BA.2, BA.4 i BA.5, amb un IC99 de fins a 100 ng/mL mesurat per un assaig de placa. Es va observar un escenari similar amb FRNT, on S728-1157 va mantenir la seva alta activitat de neutralització contra BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 i XBB amb un IC50 en el rang de 8-300 ng. /mL (figura 1G). S451-1140 va neutralitzar BA.1, BA.2, BA.2.75 i BL.1 potentment, però no BA.4 i BA.5, tal com s'observa a les dues plataformes d'assaig de neutralització. D'altra banda, S626-161 no va demostrar activitat neutralitzant contra variants d'Omicron més enllà de la variant BA.1 (figura 1G). Tot i que S626-161 tenia una potència de neutralització més baixa contra els COV provats que els altres 2 anticossos, va ser l'únic mAb que va mostrar reactivitat creuada no només amb SARS CoV-1 RBD sinó que també va poder neutralitzar els ratpenats. coronavirus WIV-1 i RsSHC014 (figura 1, F i G). Aquestes dades suggereixen que S626-161 reconeix un epítop conservat que es comparteix entre aquests llinatges d'arbovirus però que està absent a les soques BA.2 i posteriors. A més, en comparació amb S728-1157 i S{451-1140, S{626-161 té un CDR-H3 més llarg que podria proporcionar una capacitat millorada per reconèixer una part altament conservada de residus compartits entre arbovirus, tal com es descriu. en un estudi anterior (19) (figura suplementària 1). En comparar els gens variables d'immunoglobulina pesada (IGHV) i de cadena lleugera (IGLV o IGKV) d'aquests 3 mAbs amb la base de dades d'mAbs neutralitzant SARS-CoV-2 disponible (13, 15, 20-27), vam trobar que la cadena pesada. Els gens variables utilitzats per S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV{3-23) i S626-161 (IGHV{4-39) tenen S'ha informat anteriorment que codifica diversos anticossos potentment neutralitzants del SARS-CoV-2 dirigits al RBD (21, 22, 28, 29). Tanmateix, només S728-1157 tenia aparellaments únics de gens variables de cadena pesada i lleugera que no s'han informat a la base de dades (taula suplementària 3), cosa que indica que no és un clonotip públic.

Figura 1. Caracterització dels mAb reactius a RBD aïllats d'individus convalescents de COVID-19

Aquests 3 mAb (S451-1140, S626-161 i S{728-1157) es van caracteritzar encara més per determinar la seva amplitud d'unió contra els COV SARSCoV-2 (figura 2, A i B) . S'ha demostrat que l'espiga estabilitzada per prefusió que conté 2-substitucions de prolina a la subunitat S2 (2P; diprolina) és un immunogen superior en comparació amb l'espiga WT i és la base de diversos SARS-CoV actuals-2 vacunes, incloses les vacunes basades en ARNm (30, 31). Més recentment, es va informar que la proteïna d'espiga estabilitzada amb 6 prolines (6P; hexaprolina) augmentava l'expressió i era encara més estable que la construcció de diprolina original; com a resultat, s'ha proposat per utilitzar-lo en la propera generació de vacunes COVID-19 (32, 33). Per determinar si hi ha diferències d'antigenicitat entre les construccions d'espiga de diprolina i hexaprolina, es van incloure tots dos immunògens al nostre panell de prova. Tal com es va mesurar per ELISA, vam trobar que 3 mAbs unien l'antigen d'espiga 6P-WT en major mesura en comparació amb l'espiga WT-2P (figura 2, A i B). Els 3 mAbs van mostrar una unió comparable amb els pics dels virus Alpha, Beta, Gamma i Delta, en relació amb el de WT-2P (figura 2, A i B). Tanmateix, les reactivitats d'unió d'aquests 3 mAb es van reduir substancialment contra un panell d'antígens de la família Omicron (figura 2, B i C). La unió de S451-1140 era sensible a les mutacions trobades a BA.1 i BA.2, la qual cosa va provocar una gran disminució de la unió i una disminució 31-plegada de la neutralització contra aquestes variants en comparació amb WT-2 Antigen P i virus D614G, respectivament (figura 2B). El mAb neutralitzador de creus de sarbecovirus, S626-161, també va mostrar una unió reduïda d'1,2- a 3,5-vegades a l'antigen de l'espiga BA.1, que pot explicar un {{45} }reducció de vegades de l'activitat de neutralització contra BA.1 (Figura 1G i Figura 2, B i C). Per a l'anticòs neutralitzant àmpliament més potent (bnAb), S728-1157, la unió als antígens d'Omicron es va reduir en menor mesura (oscil·lant d'1,1- a 4,4- vegades) en comparació amb WT -2P va augmentar i no es va veure afectat en l'activitat neutralitzant (figura 1G i figura 2, B i C). La disminució substancial de la unió de mAb neutralitzant Omicron a l'espiga BA.1 pot ser deguda a alteracions en la seva mobilitat i relacionada amb l'empaquetament ajustat de les estructures de descens de l'RBD d'Omicron 3- i la preferència per 1- up RBD que ajuden a evadir anticossos, tal com va informar un estudi anterior (34). Les mutacions estabilitzadores 2P i 6P també tenen efectes diferencials en les variants d'Omicron on els 3 mAb van mostrar un augment de la unió a l'espiga BA.1-6P en comparació amb el BA.8-P. versió, però només va augmentar marginalment la vinculació a les versions d'espiga BA.2 i BA.4/5 6P en comparació amb les seves versions 2P en 1,2 × a 1,4 ×, cosa que suggereix una accessibilitat lleugerament millor dels mAb neutralitzadors d'Omicron a les versions hexapols, especialment per a la construcció d'espiga BA.1. A més de l'ELISA, es va utilitzar la interferometria de biocapa (BLI) per quantificar la velocitat d'unió i les constants d'equilibri (kon, koff i KD) d'aquests 3 mAb a un panell d'antígens de punta (figura suplementària 2). Les taxes de reconeixement de la unió de l'antigen del fragment (Fab) als pics d'hexaprolina van ser d'1,5- a 3,3- vegades més ràpid en comparació amb els pics de diprolina (figura suplementària 2, B i C), cosa que demostra que els anticossos s'uneixen a la construcció 6P més ràpidament que a la construcció 2P. Això podria haver estat esperat si els epítops fossin més accessibles al RBD en estat obert a l'espiga d'hexaprolina. Excepte per a S626- 161, Fabs es va dissociar de l'espiga d'hexaprolina més lentament (tenien un koff més baix) que l'espiga de diprolina, de manera que el KD global va mostrar que S728-1157 i S451-1140 es van unir a l'espiga d'hexaprolina amb major afinitat (figura suplementària 2, B i C). L'augment de la unió a l'espiga d'hexaprolina va ser encara més notable per a la IgG intacta pel model d'interacció 1:2 tal com es mostra amb els mAb S728-1157 i S{451- 1140, coherent amb l'exposició de múltiples epítops amb estabilització 6P que permet avidesa millorada (figura suplementària 2, A i C). En conjunt, aquests resultats suggereixen que els epítops orientats poden ser comparativament més accessibles a l'espiga estabilitzada amb 6P quan el RBD està en estat obert. A continuació, es van realitzar anàlisis estructurals per verificar aquesta conjectura.

Figura 2. Ample d'unió dels mAbs neutralitzadors d'Omicron

Anàlisi estructural d'Abs neutralitzants àmpliament. Com a primera aproximació dels epítops units, es va utilitzar un assaig de competència ELISA per determinar si aquests 3 mAbs àmpliament neutralitzants compartien cap superposició amb el nostre panell actual d'mAbs, una col·lecció d'mAbs amb especificitats d'epítops conegudes d'estudis anteriors (15, 25, 35) , i altres 2 mAbs actualment en ús clínic, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) i REGN10933 (Regeneron) (37). Els llocs d'unió de S451-1140 i S728-1157 es van solapar parcialment amb CC12.3 (23, 25), un anticossos neutralitzant de classe 1 i la majoria dels anticossos de classe 2, inclosos LY-CoV555 i REGN10933, però no amb anticossos de classe 3 i classe 4 (figura 3A). S626-161 va compartir un solapament notable a la regió d'unió amb la classe 1 CC12.3, diversos anticossos de classe 4, inclòs CR3022, i altres anticossos no classificats, tot i que tenia algun solapament parcial amb diversos anticossos de classe 2 i un sol de classe 3 (figura 3A). De manera anàloga, un assaig de competició BLI va revelar que S451-1140 i S728-1157 competien fortament entre si per unir-se a l'espiga WT-6P, mentre que S{626-161 no ho feia (figura suplementària 3). En general, aquestes dades suggereixen que S451-1140 i S{728-1157 reconeixen epítops similars que són diferents de S626-161.

Figura 3. Mecanisme de neutralització àmplia de S728-1157

L'anticòs S728-1157 va ser codificat per IGHV3-66 i posseïa una breu regió 3 que determina la complementarietat (CDR-H3). En particular, els mAb que uneixen l'RBS en el mode d'enllaç 1 (és a dir, RBS-A o lloc de classe 1), caracteritzats per CC12.1, CC12.3, B38 i C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), solen utilitzar IGHV3-53 o 3-66 i són sensibles a les mutacions de VOC (40). Tanmateix, la regió CDR-H3 de S728-1157 és molt diferent d'altres anticossos d'aquesta classe, la qual cosa podria explicar la seva activitat més àmplia. Per entendre la base estructural de la neutralització àmplia per S728-1157 en aquest epítop, vam resoldre una estructura de microscòpia crioelectrònica (crio-EM) (figura 3B) d'IgG S728-1157 en complex amb espiga WT{ {31}}P-Mut7, una versió de l'espiga WT-6P que posseeix un enllaç disulfur interprotòmer a C705 i C883, amb una resolució global d'aproximadament 3,3 Å (figura suplementària 4E). Utilitzant mètodes d'expansió de simetria, classificació focalitzada i perfeccionament, vam aconseguir una resolució local a la interfície RBD-Fv a aproximadament 4 Å (figura suplementària 4E i taula suplementària 8). Es va determinar una estructura cristal·lina de S728-1157 Fab a una resolució de 3,1 Å i es va utilitzar per construir el model atòmic a la interfície RBD-Fv. Les nostres estructures confirmen que S728-1157 uneix l'epítop RBS-A (o classe 1) a la conformació RBD-up (figura 3B i figura suplementària 4E), similar a altres IGHV3-53/{{55} } anticossos (figura 3C). El bloqueig estèric del lloc d'unió de l'enzim convertidor d'angiotensina 2 (ACE2) per part de S728-1157 explica la seva alta potència de neutralització contra SARS-CoV-2. El motiu 32NY33 i el motiu 53SGGS56 (23) a S728-1157 CDR-H1 i -H2 interaccionen amb el RBD gairebé de la mateixa manera que CC12.3 (figura suplementària 4, B i C). Tanmateix, en comparació amb VH 98DF99 a CC12.3, VH 98DY99 a S728-1157 CDR-H3 forma interaccions més extenses, incloses les interaccions tant hidrofòbiques com polars, amb el RBD, que poden explicar l'àmplia neutralització contra els COV (figura 3D i taules complementàries 6 i 7). La diglicina VH 100GG101 a S728- 1157 CDR-H3 també pot facilitar una unió més extensa en comparació amb VH Y100 a CC12.3, probablement a causa de la flexibilitat dels residus de glicina que condueixen a una conformació diferent de la punta de la CDR. -Bucle H3 i un desplaçament relatiu de residus a 98DY99.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Tot i que els COV d'Omicron tenen mutacions extenses al RBD, la majoria d'aquests residus no interaccionen amb S728-1157, ja que encara s'observa la unió (figura suplementària 4A). Des del nostre model de pic WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157, es preveu que Y505 a VL Q31 i E484 a VH Y99 facin enllaços d'hidrogen (figura suplementària 4D i taula suplementària 6). ), que tenen el potencial de ser interromputs per les mutacions Omicron Y505H i E484A. Tanmateix, una mutació Y505H encara permetria un enllaç d'hidrogen amb VL Q31, i una mutació E484A afegiria una altra cadena lateral hidrofòbica a prop dels residus hidrofòbics VL Y99, F456 i Y489. Aquests contactes poden explicar, en part, el mecanisme que permet a S728-1157 retenir l'activitat neutralitzant, encara que reduïda, contra l'antigen de l'espiga BA.1 (figura 1G i figura 2B). L'antigen BA.1, al seu torn, possiblement està relacionat amb les mutacions d'Omicron que alteren el paisatge conformacional de la proteïna espiga (34). Tanmateix, diversos residus mutats somàticament, és a dir, VH L27, L28, R31, F58 i VL V28 i Q31, a S728-1157 estan implicats en la interacció amb SARS-CoV-2 RBD (figura suplementària 1 i Taula suplementària 7), que també pot contribuir a la seva àmplia reactivitat en comparació amb CC12.3. En general, els nostres estudis estructurals van revelar la base d'una neutralització àmplia de S728-1157 que pot acomodar la majoria de mutacions en els COV del SARS-CoV-2.

Figura 4. Eficàcia protectora dels bnAbs contra la infecció per SARS-CoV-2 en hàmsters.

S728-1157 redueix la replicació del SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta i WT SARS-CoV-2 en hàmsters sirians. Per avaluar l'eficàcia protectora dels nostres mAbs àmpliament neutralitzants, vam utilitzar un model d'infecció de hàmster sirià daurat que s'ha utilitzat àmpliament per al SARS-CoV-2. Els hàmsters van rebre 5 mg/kg dels nostres mAb de prova o un control d'isotip dirigit a un antigen irrellevant (glicoproteïna de l'ebolavirus) mitjançant injecció intraperitoneal 1 dia després de la infecció amb virus SARS CoV-2. Els teixits pulmonars i nasals es van recollir 4 dies després de la infecció (figura 4A). L'administració terapèutica de S728-1157 va donar lloc a títols reduïts de variants WT, BA.1 Omicron i Delta tant als cornets nasals com als pulmons dels hàmsters infectats (figura 4, B-D). Curiosament, l'efecte de S728-1157 als pulmons va ser espectacular, reduint les càrregues virals de WT i BA.1 Omicron en aproximadament 104PFU, i els títols virals de la variant BA.1 Omicron es van abolir completament (figura 4C). A diferència de la neutralització in vitro (figura 1G), S451-1140 no va reduir la replicació viral de BA.1 Omicron als cornets pulmonars i nasals, cosa que indica una desconnexió entre la neutralització in vitro i la protecció in vivo per a aquest clon (figura 4E) . En comparació, l'administració de S626-161 va donar lloc a reduccions marginalment significatives dels títols virals pulmonars després del repte WT i BA.1 (figura 4, F i G). Aquestes dades subratllen que, per definir amb precisió els mAb de protecció àmplia, cal avaluar l'eficàcia de la protecció en paral·lel amb l'activitat de neutralització. Avançant, serà interessant examinar fins a quin punt la capacitat protectora de S728-1157 depèn de Fc. En general, S728-1157 representa un mAb prometedor amb una àmplia eficàcia de neutralització contra les variants del SARS CoV-2 que són capaços de reduir dràsticament la replicació de WT, Delta i BA.1 in vivo.

La infecció per SARS-CoV-2 rarament provoca mAbs neutralitzadors creuats com S{728-1157. Atesa la neutralització creuada i el potencial profilàctic de S728-1157, vam intentar avaluar si els anticossos semblants a S728-1157 s'indueixen habitualment entre les respostes policlonals en pacients amb SARS-CoV-2. Per avaluar-ho, vam realitzar ELISA de competició mitjançant sèrum convalescent per detectar títols d'anticossos anti-RBD que podrien competir per unir-se amb S728-1157 (figura 5A). Els subjectes es van dividir en 3 grups en funció de la magnitud de les respostes d'anticossos, tal com es va definir anteriorment (15, 16). Tot i que els que responen alt i moderat tenien títols més alts d'anticossos sèrics competitius S728-1157 en comparació amb els que responen baix (figura 5B), els títols eren bastant baixos en tots els grups, cosa que suggereix que és poc freqüent adquirir nivells elevats de S{{ 18}}-anticossos semblants al sèrum policlonal després de la infecció per WT SARS-CoV-2. A més de S728-1157, vam provar la competència del sèrum convalescent amb altres mAb, inclosos S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 i CC12.3. De manera similar a S728-1157, vam observar títols relativament baixos d'anticossos que competeixen amb S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 i CC12.3 en sèrum policlonal de la majoria dels convalescents. individus (figura 5, C–F i H). No obstant això, els que responen alts tendeixen a tenir títols significativament més alts contra els mAb neutralitzadors que els que responen baix (figura 5, B-F i H). En canvi, els anticossos dirigits al lloc de l'epítop CR3022 eren més pronunciats en individus convalescents, cosa que suggereix l'enriquiment dels anticossos RBD de classe 4 en sèrum policlonal (figura 5G). En particular, no hi va haver cap diferència significativa en els títols de CR3022 entre els 3 grups de resposta, cosa que suggereix que els anticossos del lloc CR3022-es van induir constantment durant la infecció per WT SARS-CoV-2 en la majoria d'individus. Curiosament, en comparació amb CC12.3, S728-1157 es va detectar a nivells 4-vegades més baixos en el sèrum dels pacients amb resposta alta. Així, tot i que els anticossos de classe 1 són induïts freqüentment per infecció natural i vacunació (14, 20, 28, 29, 41–43), les nostres dades suggereixen que els anticossos semblants a S728–1157 que representen un subconjunt d'aquesta classe són comparativament rars.

A més, es va examinar la diferència de reactivitat amb l'espiga estabilitzada amb 2P versus 6P en els sèrums de la nostra cohort convalescent (figura 5, I-K). Vam trobar que els 3 grups de resposta van muntar anticossos reactius anti-spike contra l'espiga WT estabilitzada amb 6P en una mesura més gran que l'espiga WT estabilitzada amb 2P, per un factor de 6 a 11 vegades (figura 5J), cosa que indica que el els epítops antigènics principals estaven millor exhibits o estabilitzats a l'antigen estabilitzat amb 6P. Utilitzant les mateixes mostres, els responents alts i moderats també tenien títols més baixos d'anticossos anti-espiga contra BA.1-2P que BA.1-6P, de 4 a 5 vegades (figura 5K). Cal destacar que les persones amb resposta baixa van tenir un canvi de plec més petit en la reactivitat d'unió contra l'espiga BA.1 Omicron-2P i 6P (2-reducció de vegades) en comparació amb l'espiga WT{-2P i 6P (2-). {28}}reducció de vegades) (Figura 5, J i K), cosa que suggereix que l'anticossos sèrics contra els epítops reactius a l'omicron BA.1 poden estar més limitats en subjectes amb resposta baixa. En general, aquestes dades suggereixen que hi ha una unió policlonal millorada induïda per la infecció natural a l'espiga estabilitzada amb 6P, tant per als virus WT com per als virus Omicron.

Els anticossos semblants a S728-1157 s'indueixen de manera òptima en el context de la immunitat híbrida. La infecció primària per SARS-CoV-2 sense vacunació s'ha tornat poc freqüent en l'entorn global actual, i diversos estudis han informat que la immunitat per SARS-CoV{-2 difereix entre individus amb antecedents específics de vacunació/infecció. Com a resultat, a continuació, vam intentar investigar quines exposicions comunes, a part de la infecció per WT només amb SARS-CoV-2 ancestral, induirien eficaçment anticossos semblants a S728-1157 en plasma de vacunats basats en ARNm monovalent amb i sense prèviament. infecció. Hem obtingut l'espècimen biològic necessari de la cohort d'estudi de protecció associada a la immunitat ràpida al SARS-CoV-2 (PARIS), que ha seguit els treballadors sanitaris de manera longitudinal des de l'inici de la pandèmia (44). Hem seleccionat mostres de plasma de participants de l'estudi totalment immunitzats (2 × vacunats) amb i sense infecció, així com de participants reforçats (3 × vacunats) amb i sense infecció. A més, també vam incloure mostres de participants de l'estudi que havien rebut la vacuna d'ARNm bivalent (WA1/2020 ancestral més Omicron BA.5) (figura 6A i taula suplementària 2). Les infeccions innovadores en participants que havien rebut vacunacions de reforç es van produir en un moment en què els llinatges Omicron havien desplaçat tots els altres llinatges SARS-CoV-2 a l'àrea metropolitana de Nova York. Vam trobar que els individus vacunats amb doble vacuna tenien els títols més baixos d'anticossos sèrics competitius S728-1157 entre els 5 grups de mostres provats (figura 6B). En particular, aquests nivells eren similars als observats per a la nostra cohort de convalescents no vacunats (tots els que van respondre; figura 5B). En comparació, els individus amb antecedents d'infecció natural, inclosos els convalescents amb 2 de 3 dosis de vacuna, i els individus que havien experimentat una infecció innovadora i van rebre un reforç bivalent, van mostrar nivells significativament més alts d'obtenció de S728-1157 en comparació amb els no infectats. però individus vacunats (figura 6B). Tot i que el grup de dosis 3-no infectat només va mostrar un augment no significatiu en comparació amb el grup de dosis 2-, el desglossament aparellat per tipus de vacuna va indicar que les terceres dosis homòlogues de BNT162b2 i ARNm-1273 van augmentar significativament S{{ 38}}com els títols d'anticossos neutralitzants en 2,72 × i 2,85 ×, respectivament (figura 6, C i D). Cal destacar que, entre els participants amb 3 contactes totals amb pic per qualsevol mitjà, els títols d'anticossos com S728-1157-eren 3 vegades més alts en les vacunes dobles convalescents en comparació amb les vacunes triples ingènues a la infecció, cosa que suggereix que SARS-CoV{{ 51}} la infecció indueix aquest clonotip de manera més òptima. Entre els grups d'immunitat híbrida, vam observar que la majoria dels individus potenciats amb un avenç que van rebre la dosi de la vacuna de reforç bivalent només tenien un títol d'anticossos S728-1157 marginalment més alt en comparació amb els grups vacunats pre omicrons convalescents, cosa que suggereix que la S{{53} }} El títol probablement s'apropava a un altiplà després de 3 exposicions. També vam investigar els títols d'anticossos policlonals que competien amb CC12.3 i CR3022 a més de S728-1157. Tots els individus presentaven títols relativament alts d'anticossos com CC12.3- i CR{3022-, independentment del nombre i tipus d'exposicions (figura suplementària 5), ​​al contrari del que vam observar per a S728-1157- com els anticossos. En general, aquestes dades indiquen que la infecció per SARS-CoV-2 i la vacunació amb ARNm contribueixen a la inducció d'anticossos semblants a S728-1157-, amb la infecció que juga un paper més dominant en els individus vacunats.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Finalment, en comparar les respostes contra l'espiga estabilitzada amb 2P versus 6P a la cohort de vacunació d'ARNm, vam trobar que la majoria dels grups van provocar nivells similars d'anticossos contra ambdues construccions. L'excepció d'això va ser el grup triple vacunat no infectat, que va demostrar una reactivitat estadísticament més alta, encara que només lleugerament augmentada, amb el 2P en comparació amb el pic estabilitzat amb 6P (figura 6E). Aquestes dades suggereixen que, a diferència de la infecció natural (figura 5, J i K), la vacunació sola produeix una resposta policlonal que està més restringida als epítops de la construcció Spike-2P, en línia amb la Spike{{12} }}P formulació de les vacunes actuals. En última instància, aquestes troballes donen suport a la idea que l'estabilització 6P de les futures vacunes SARS-CoV-2 podria ser de gran benefici per induir clonotips d'anticossos de protecció àmplia com S728-1157.

Figura 5. Competició d'anticossos sèrics convalescents amb mAbs reactius a RBD neutralitzant àmpliament i comparació de la resposta d'anticossos sèrics contra pics estabilitzats amb 6P versus 2P

Figura 6. Competició d'anticossos sèrics vacunats amb ARNm amb mAbs reactius a RBD neutralitzant S728-1157 i comparació de la resposta d'anticossos sèrics contra pics estabilitzats amb 6P versus 2P.

Discussió

En aquest estudi, identifiquem un bnAb potent aïllat d'una cèl·lula B de memòria d'un individu que s'havia recuperat de la infecció per SARS-CoV-2 durant l'onada inicial de la pandèmia de COVID-19. Aquest bnAb, S728- 1157, va mantenir una reactivitat d'unió substancial i va tenir una activitat neutralitzant constant contra tots els COV del SARS-CoV-2 provats, inclosos Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 i XBB, i va poder reduir substancialment els títols virals infecciosos després de la infecció per Delta i BA.1 en hàmsters.

Vam trobar que el sèrum convalescent de la nostra cohort contenia concentracions baixes d'anticossos que competeixen amb S728-1157 (un anticòs de classe 1/RBS-A) i mAbs d'epítop de classe 2. Això suggereix que S728-1157 és una mica únic d'altres anticossos que tenen com a objectiu els epítops de classe 1 i que s'indueix amb poca freqüència al conjunt de cèl·lules B de memòria específica de RBD. En canvi, la nostra cohort d'infeccions naturals semblava induir anticossos dirigits a l'epítop CR3022 (classe 4); Els anticossos d'aquesta especificitat són sovint reactius creuats, però són menys potents que els anticossos dirigits a RBS (14, 17). Aquestes dades són complementàries de les nostres troballes anteriors que demostren que l'abundància d'anticossos de classe 3/S309 en sèrums convalescents pot contribuir a neutralitzar l'activitat contra variants alfa i gamma, mentre que la manca d'anticossos de classe 2 pot explicar la capacitat de neutralització reduïda contra Delta (15). . No obstant això, s'informa que l'amplitud d'activitat de la majoria d'aquests anticossos dirigits a RBS (RBS-A/classe 1, RBS-B, C/classe 2 i RBS-D, S309/classe 3) contra les variants d'Omicron és molt limitada. (11, 40, 45).

El repte clau per avançar serà determinar com millorar l'obtenció d'anticossos de reacció creuada àmpliament als epítops RBS conservats. En aquest sentit, vam observar aquí que els individus amb immunitat híbrida van muntar títols significativament més alts d'anticossos semblants a S728-1157-que els individus vacunats sense infecció prèvia. És important destacar que aquest fenomen es va observar fins i tot quan es va controlar el nombre d'exposicions (és a dir, en vacunats dobles convalescents versus vacunats triples no infectats), cosa que suggereix que algun element d'immunitat associada a la infecció (o una formulació de vacuna que pot imitar aquest tipus d'immunitat) és important per a l'obtenció d'aquest clonotip. Això és coherent amb l'evidència experimental que documenta que els individus amb immunitat híbrida tenen perfils de reactivitat d'anticossos més amplis en comparació amb els que només tenen una resposta immune induïda per la vacunació o la infecció primària (9).

Les estructures aquí il·lustrades que S728-1157 uneix l'epítop RBS-A/classe 1 a l'RBD de conformació superior. Aquest epítop sembla ser més fàcilment accessible en pics estabilitzats amb 6P, que s'ha informat que presenten 2 RBD al nord de l'estat, en comparació amb pics 2P, que només presenten 1 (30, 33, 46, 47) i als quals els nostres anticossos. específic per a l'espiga de conformació superior mostra una unió millorada. S728-1157 es va aïllar després d'una infecció natural; en aquests contextos, les probabilitats d'induir clons semblants a S728-1157 són probablement més altes atès que el RBD ha de ser capaç d'adoptar una conformació superior, fins i tot de manera transitòria, per unir-se a ACE2, exposant així aquest epítop. A diferència de la majoria dels anticossos IGHV{3-53/{3-66 RBS-A/classe 1, S728-1157 pot acomodar mutacions clau en pics de VOC mitjançant interaccions extenses entre CDR-H3 i RBD (29, 48–50). S728-1157 també utilitza una cadena lleugera diferent (IGLV3-9) en comparació amb altres anticossos menys amplis com CC12.3 (IGKV3-20), que pot afectar les interaccions d'unió globals; tanmateix, la nostra anàlisi indica que hi ha menys enllaços d'hidrogen entre la cadena lleugera S728-1157 i la RBD en comparació amb CC12.3 (taula suplementària 7). Tot i que la majoria dels residus de contacte CDR-H3 crítics per a la reactivitat creuada de VOC en aquesta interacció estan codificats per la línia germinal i no introduïts per mutacions somàtiques, hi ha diversos residus mutats somàticament a les regions marc o CDR-H1, CDR-H2 i CDR-L1. implicats en la interacció amb SARS-CoV-2 RBD. D'una banda, això suggereix que les cèl·lules B de memòria que codifiquen anticossos de la classe IGHV3-53/66 podrien adquirir un grau similar de reactivitat creuada mitjançant una major maduració de l'afinitat. D'altra banda, això també indica la possibilitat de dissenyar immunògens dirigits a la línia germinal que s'orientin a cèl·lules B ingènues com S728-1157-. Tot i que pot ser difícil dissenyar vacunes que puguin provocar específicament anticossos semblants a S728-1157 amb CDR-H3 selectes capaços de superar les mutacions de VOC, és encoratjador que s'observi la restricció del gen IGHV en altres SARS-CoV potents{ {58}} estudis neutralitzants de mAbs (13, 15, 20–27). Alternativament, això també pot ser factible mitjançant la immunització iterativa amb immunògens RBD optimitzats, com s'ha informat anteriorment per a altres patògens (51-55).

Tot i que s'han observat moltes mutacions al lloc antigènic RBS-A/classe 1 (18), pel que fa a l'epítop S728-1157, 13 de 15 residus totals de contacte RBD i 2 de 3 CDR-H{{9} }Els residus de contacte RBD units es conserven dins d'Omicron i de tots els altres VOC. Això suggereix que la regió RBD on es troba l'epítop S728-1157 pot incloure residus crítics per a la seva funció dinàmica i la seva aptitud viral i, per tant, seria menys tolerant a les mutacions i la deriva antigènica que els residus del lloc RBS-A/classe 1 circumdants. Si aquest és el cas, s'hauria de reduir la tendència a que aquest epítop en particular es perdi a mesura que evolucionen les variants virals, de manera que la caracterització de S728-1157 i anticossos i epítops similars sigui important per a les vacunes resistents a variants o el desenvolupament terapèutic de mAb. En resum, el nostre estudi identifica bnAbs que poden informar el disseny d'immunogen per a vacunes contra el coronavirus de nova generació a prova de variants o servir com a terapèutics mAb resistents a l'evolució del SARS CoV-2. En particular, pel que fa a la potència i l'amplitud combinades, S728-1157 sembla ser el millor anticòs aïllat fins ara. Atès que aquest anticòs s'uneix més fàcilment amb l'estabilització de 6P, es preveu que sigui induït preferentment per proteïnes d'espiga recombinants estabilitzades per 6P o virus sencers, cosa que suggereix que la modificació de l'hexaprolina podria beneficiar les futures construccions de vacunes per protegir-se de manera òptima contra el SARS-CoV futur. -2 variants i altres arbovirus.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Mètodes

Aïllament d'anticossos monoclonals. Els PBMC es van aïllar dels filtres de leucoreducció i es van congelar tal com es va descriure anteriorment (24). Les cèl·lules B es van enriquir a partir de PBMC mitjançant FACS. Les cèl·lules es van tacar amb CD19, CD3 i sondes d'antigen conjugades amb oligo-fluoròfor; les cèl·lules d'interès es van identificar com CD3– CD19+ Antigen+. Tots els mAb es van generar a partir de cèl·lules classificades amb esquers d'antigen marcades amb oligo i identificades mitjançant RNA-Seq unicel·lular, tal com es va descriure anteriorment (15, 24). Les dades de cèl·lules B individuals generades en aquest estudi s'han dipositat a Gene Expression Omnibus: GSE171703 i GSM5231088–GSM5231123.

Les cèl·lules B específiques de l'antigen es van seleccionar per generar mAb basats en la intensitat de la sonda d'antigen analitzada per JMP Pro 15. Els gens de la cadena lleugera i pesada d'anticossos es van sintetitzar mitjançant Integrated DNA Technologies (IDT) i es van clonar en IgG1 humana i cadena lleugera κ o λ humana. vectors d'expressió per muntatge de Gibson, tal com es va descriure anteriorment (56). Les cadenes pesades i lleugeres del mAb corresponent es van cotransfectar de manera transitòria en cèl·lules HEK293T (ATCC). Després de la transfecció durant 18 hores, les cèl·lules transfectades es van complementar amb un sobrenedant de medi hibridoma lliure de proteïnes (PFHM-II, Gibco). El sobrenedant que contenia mAb secretat es va recollir el dia 4 i es va purificar mitjançant perles de proteïna A-agarosa (Thermo Fisher Scientific) tal com es va detallar anteriorment (56). Les seqüències de cadenes pesades i lleugeres dels anticossos ben caracteritzats es van derivar del Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) i REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) i es van sintetitzar tal com es descriu anteriorment. El CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) va ser proporcionat per Meng Yuan al Scripps Research Institute (San Diego, Califòrnia, EUA). Expressió de proteïna espiga recombinant. L'espiga de longitud completa (FL) D614G SARS-CoV-2 recombinant, BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, mutants RBD únics (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493Y, N, Q493Y, N Y505A i Y505F), la combinació de mutants RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD i MERS-CoV RBD es van generar internament. Breument, els antígens recombinants es van expressar mitjançant cèl·lules Expi293F (Thermo Fisher Scientific). El gen d'interès es va clonar en un vector d'expressió de mamífers (AbVec modificat internament) i es va transfectar mitjançant el kit ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) segons el protocol del fabricant. El sobrenedant es va recollir el dia 4 després de la transfecció i es va incubar amb agarosa d'àcid Ni-nitrilotriacètic (Ni-NTA) (Qiagen). La purificació es va dur a terme mitjançant una columna de flux per gravetat i es va eluir amb un tampó que contenia imidazol tal com es va descriure anteriorment (57, 58). L'eluat es va tamponar i es va intercanviar amb PBS mitjançant una unitat centrífuga Amicon (Millipore). Els pics FL recombinants es van estabilitzar per mutacions 2P de les variants B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 i BA.4 Omicron i van ser produït al Laboratori Sather del Seattle Children's Research Institute. Els RBD K417V, N439K i E484K i l'espiga FL recombinant WT-2P i 6P es van produir al laboratori Krammer de la Icahn School of Medicine a Mount Sinai. El SARS-CoV-2-6P-Mut7 i l'espiga BA.1-6P es van dissenyar i produir tal com es va descriure en un estudi anterior (59). Les seqüències de proteïnes i els recursos per a cada antigen es mostren a la taula suplementària 4. ELISA. Les proteïnes d'espiga/RBD recombinants SARS-CoV-2 es van recobrir sobre plaques de microtitulació d'alta unió a proteïnes (Costar) a 2 ug/mL en PBS a 50 µl/pou i es van mantenir durant la nit a 4 graus. Les plaques es van rentar amb PBS que contenia un 0, 05% de Tween 20 (PBS-T) i es van bloquejar amb 150 μL de PBS que contenia un 20% de FBS durant 1 hora a 37 graus. Els anticossos monoclonals es van diluir en sèrie 3-a partir de 10 ug/ml en PBS i es van incubar als pous durant 1 hora a 37 graus. A continuació, es van rentar les plaques i es van incubar amb anticòs de cabra anti-IgG humana conjugada amb HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,{000) durant 1 hora a 37 graus. Després del rentat, es van afegir 100 μL de substrat ELISA Super AquaBlue (eBioscience) per pou. L'absorbància es va mesurar a 405 nm en un espectrofotòmetre de microplaques (Bio-Rad). Els assaigs es van estandarditzar mitjançant l'anticòs de control S144-509 (15), amb característiques d'unió conegudes a cada placa, i les plaques es van desenvolupar fins que l'absorbància del control va assolir una DO de 3,0. Tots els mAb es van provar per duplicat i cada experiment es va realitzar dues vegades.

ELISA sèrica. Les plaques de microtitulació d'alta unió a proteïnes es van recobrir amb antígens recombinants d'espiga SARS-CoV-2 a 2 ug/mL en PBS durant la nit a 4 graus. Les plaques es van rentar amb PBS 0.05% Tween i es van bloquejar amb 200 μL PBS 0,1% Tween + 3% llet desnatada en pols durant 1 hora a temperatura ambient (RT). Les mostres de plasma es van inactivar per calor durant 1 hora a 56 graus abans de realitzar l'experiment de serologia. El plasma es va diluir en sèrie 2- vegades en PBS 0,1% Tween + 1% llet desnatada en pols. Les plaques es van incubar amb dilucions sèriques durant 2 hores a RT. L'anticòs secundari de cabra anti-Ig humana conjugada amb HRP diluït a 1:3,000 amb PBS 0,1% Tween + 1% de llet desnatada en pols es va utilitzar per detectar la unió d'anticossos. Després d'1 hora d'incubació, es van desenvolupar plaques amb 100 μL de solució SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) durant 10 minuts. A continuació, es van utilitzar 50 μL de HCl 3M per aturar la reacció de desenvolupament. L'absorbància es va mesurar a 490 nm en un espectrofotòmetre de microplaques (Bio-Rad). Els títols finals es van extrapolar a partir de la corba estàndard 4PL sigmoïdal (on x és la concentració logarítmica) per a cada mostra. El límit de detecció (LOD) es defineix com la + 3 SD mitjana del senyal OD registrat mitjançant plasma d'individus pre-SARS-CoV-2. Tots els càlculs es van realitzar amb el programari GraphPad Prism (versió 9.0).

Concurs ELISA. Per determinar la classificació de l'epítop objectiu dels mAbs reactius a RBD, es van realitzar ELISA de competició mitjançant altres mAbs amb característiques d'unió a l'epítop conegudes com a mAb competidors. Els mAb competidors es van biotinilar mitjançant EZ-Link sulfo-NHS-biotina (Thermo Fisher Scientific) durant 2 hores a RT. L'excés de biotina dels mAb biotinilats es va eliminar amb columnes de dessalació de spin Zeba de tall de pes molecular de 7k (MWCO) (Thermo Fisher Scientific). Les plaques es van recobrir amb 2 ug/mL d'antigen RBD durant la nit a 4 graus. Les plaques es van bloquejar amb PBS–20% FBS durant 2 hores a TA i es va afegir la 2-dilució dels mAb d'una classe o sèrum indeterminat, a partir de les 20 ug/mL de mAbs i una dilució 1:10 de sèrum. Després de la incubació d'anticossos durant 2 hores a RT, es va afegir el mAb competidor biotinilat a una concentració el doble de la seva constant de dissociació (KD) i es va incubar durant 2 hores més a RT juntament amb el mAb o sèrum que es va afegir prèviament. Les plaques es van rentar i es van incubar amb 100 μL d'estreptavidina conjugada amb HRP (Southern Biotech) a una dilució d'1:1, 000 durant 1 hora a 37 graus. Les plaques es van desenvolupar amb el substrat Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Per normalitzar els assajos, el mAb biotinilat competidor es va afegir a un pou sense cap mAb o sèrum competidors com a control. Les dades es van registrar quan l'absorbància del pou de control va assolir una DO d'1,0-1,5. A continuació, es va calcular el percentatge de competència entre mAb dividint la DO observada d'una mostra per la DO aconseguida pel control positiu, restant aquest valor a 1 i multiplicant per 100. Per al sèrum, les DO es van transformar log10 i es van analitzar mitjançant regressió no lineal per determinar els 50. Valors de concentració d'inhibició del % (IC50) mitjançant el programari GraphPad Prism (versió 9.0). Les dades es van transformar a Log1P i es van representar en un gràfic representatiu de la dilució sèrica recíproca de l'IC50 de la dilució del sèrum que pot aconseguir un 50% de competència amb el mAb competidor d'interès. Tots els mAb es van provar per duplicat, cada experiment es va realitzar 2 vegades de manera independent i es van promediar els valors de 2 experiments independents.

Assajos de plaques. Els assajos de plaques es van realitzar amb virus variants SARS-CoV-2 a cèl·lules Vero E6/TMPRSS2 (Col·lecció japonesa de biorecursos de recerca (JCRB)) (Taula suplementària 5). Les cèl·lules es van cultivar per aconseguir un 90% de confluència abans de ser tripsinitzades i sembrades a una densitat de 3 × 1{04 cèl·lules/pou en plaques 96-pous. L'endemà, es van incubar 102 PFU de la variant del SARS-CoV-2 amb mAb 2-diluïts per vegades durant 1 hora. La barreja d'anticossos-virus es va incubar amb cèl·lules Vero E6/TMPRSS2 durant 3 dies a 37 graus. Les plaques es van fixar amb metanol al 20% i després es van tenyir amb una solució de cristall violeta. Les concentracions inhibidores completes (IC99) es van calcular mitjançant el log (inhibidor) versus la resposta normalitzada (pendent variable), realitzada a GraphPad Prism (versió 9.0). Tots els mAb es van provar per duplicat i cada experiment es va realitzar dues vegades. Prova de neutralització de reducció de focus. Les proves de neutralització de reducció del focus (FRNT) es van utilitzar per determinar les activitats de neutralització com a plataforma addicional a part de l'assaig de placa. Les dilucions en sèrie de sèrum a partir d'una concentració final d'1:20 es van barrejar amb 103 unitats formadores de focus de virus per pou i es van incubar durant 1 hora a 37 graus. Una mostra de sèrum prepandèmic agrupada va servir de control. La barreja d'anticossos-virus es va inocular a cèl·lules Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) en 96-plaques de pous i es va incubar durant 1 hora a 37 graus. Es va afegir un volum igual de solució de metilcel·lulosa a cada pou. Les cèl·lules es van incubar durant 16 hores a 37 graus i després es van fixar amb formalina. Després d'eliminar la formalina, les cèl·lules es van immunocolorir amb un mAb de ratolí contra la nucleoproteïna SARS-CoV-1/2 [clon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], seguida d'una immunoglobulina anti-ratolí de cabra marcada amb HRP (Sigma- Aldrich; A8924). Les cèl·lules infectades es van tacar amb TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) i després es van rentar amb aigua destil·lada. Després de l'assecat, es van quantificar els números de focus mitjançant un analitzador ImmunoSpot S6, el programari ImmunoCapture i el programari BioSpot (tecnologia cel·lular). L'IC50 es va calcular a partir del valor interpolat del log (inhibidor) versus la resposta normalitzada, utilitzant una regressió no lineal de pendent variable (4 paràmetres) realitzada a GraphPad Prism (versió 9.0).

Referències

1. Hou YJ, et al. La variant SARS-CoV-2 D614G presenta una replicació eficient ex vivo i transmissió in vivo. Ciència. 2020;370(6523):1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF, et al. Múltiples variants del SARS CoV-2 escapen de la neutralització per la immunitat humoral induïda per la vacuna. Cèl·lula. 2021;184(9):2523.

3. Wall EC, et al. Activitat d'anticossos neutralitzant contra SARS-CoV-2 VOCs B.1.617.2 i B.1.351 mitjançant la vacunació BNT162b2. Lanceta. 2021;397(10292):2331–2333.

4. Edara VV, et al. Respostes d'anticossos neutralitzants induïdes per infecció i vacuna a les variants del SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.

5. Zhou D, et al. Evidència d'evasió de la variant B.1.351 del SARS-CoV-2 dels sèrums naturals i induïts per la vacuna. Cèl·lula. 2021;184(9):2348–2361.

6. Weisblum Y, et al. Escapar dels anticossos neutralitzants per variants de proteïnes d'espiga del SARS-CoV-2. Elife. 2020;9:e61312.

7. Graham F. Informació diària: la variant del coronavirus Omicron posa els científics en alerta. Naturalesa. 2021;.

8. Karim SSA, Karim QA. Variant d'Omicron SARS-CoV-2: un nou capítol de la pandèmia de COVID-19. Lanceta. 2021;398(10317):2126–2128.

9. Carreño JM, et al. Activitat del sèrum convalescent i vacunal contra SARS-CoV-2 Omicron. Naturalesa. 2021;602(7898):682–688.

10. Wang Q, et al. Propietats alarmants d'evasió d'anticossos de les subvariants SARS-CoV-2 BQ i XBB. Cèl·lula. 2022;186(2):279–286.

11. VanBlargan LA, et al. Un SARS-CoV-2 infecciós B.1.1.529 El virus Omicron s'escapa de la neutralització per anticossos monoclonals terapèutics. Nat Med. 2022;28(3):490–495.

12. Takashita E, et al. Eficàcia d'anticossos i fàrmacs antivirals contra Covid-19 Variant Omicron. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.

13. Yuan M, et al. Reconeixement del domini d'unió al receptor SARS-CoV-2 mitjançant anticossos neutralitzants. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.

14. Barnes CO, et al. Les estructures d'anticossos neutralitzants del SARS-CoV-2 informen les estratègies terapèutiques. Naturalesa. 2020;588(7839):682–687.

15. Changrob S, et al. Neutralització creuada de variants emergents de SARS-CoV-2 preocupants per anticossos dirigits a diferents epítops a l'espiga. Mbio. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ, et al. La gravetat de la infecció per SARS-CoV-2 està relacionada amb una immunitat humoral superior contra l'espiga. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greaney AJ, et al. Mapeig de mutacions al SARS-CoV-2 RBD que escapen de la unió per diferents classes d'anticossos. Nat Commun. 2021;12(1):4196.

18. Liu H, Wilson IA. Epítops neutralitzadors protectors en SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.

19. Jette CA, et al. Àmplia reactivitat creuada entre arbovirus presentada per un subconjunt d'anticossos neutralitzants derivats de donants de COVID-19. Cell Rep. 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM, et al. Els anticossos neutralitzants potents de pacients amb COVID-19 defineixen múltiples objectius de vulnerabilitat. Ciència. 2020;369(6504):643–650.

21. Pinto D, et al. Neutralització creuada del SARS CoV-2 per un anticòs monoclonal humà SARS-CoV. Naturalesa. 2020;583(7815):290–295.

22. Robbiani DF, et al. Respostes d'anticossos convergents al SARS-CoV-2 en individus convalescents. Naturalesa. 2020;584(7821):437–442.

23. Yuan M, et al. Base estructural d'una resposta d'anticossos compartida al SARS-CoV-2. Ciència. 2020;369(6507):1119–1123.

24. Dugan HL, et al. El perfil de la immunodominància de cèl·lules B després de la infecció per SARS-CoV-2 revela l'evolució d'anticossos cap a dianes virals no neutralitzants. Immunitat. 2021;54(6):1290–1303.

25. Rogers TF, et al. Aïllament de potents anticossos neutralitzants del SARS CoV-2 i protecció de malalties en un model animal petit. Ciència. 2020;369(6506):956–963.

26. Schmitz AJ, et al. Un anticòs públic induït per una vacuna protegeix contra SARS-CoV-2 i variants emergents. Immunitat. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. Shi R, et al. Un anticòs neutralitzant humà s'adreça al lloc d'unió al receptor del SARS-CoV-2. Naturalesa. 2020;584(7819):120–124.

28. Cao Y, et al. Potents anticossos neutralitzants contra SARS-CoV-2 identificats mitjançant la seqüenciació unicel·lular d'alt rendiment de cèl·lules B de pacients convalescents. Cèl·lula. 2020;182(1):73–84.

29. Barnes CO, et al. Les estructures dels anticossos humans units a l'espiga SARS-CoV-2 revelen epítops comuns i característiques recurrents dels anticossos. Cèl·lula. 2020;182(4):828–842.

30. Corbett KS, et al. Disseny de vacuna d'ARNm SARS-CoV-2 habilitat per la preparació de prototips de patògens. Naturalesa. 2020;586(7830):567–571.

31. Amanat F, et al. La introducció de dues prolines i l'eliminació del lloc de clivatge polibàsic van conduir a una major eficàcia d'una vacuna recombinant basada en espigues SARS-CoV-2 en el model de ratolí. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W, et al. Un virus de la malaltia de Newcastle que expressa una proteïna espiga estabilitzada del SARS-CoV-2 indueix respostes immunitàries protectores. Nat Commun. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL, et al. Disseny basat en l'estructura de pics de SARS-CoV-2 estabilitzats per prefusió. Ciència. 2020;369(6510):1501–1505.

34. Gobeil SM, et al. Diversitat estructural de l'espiga Omicron del SARS-CoV-2. Cèl·lula Mol. 2022;82(11):2050–2068.

35. Yuan M, et al. Un epítop críptic altament conservat als dominis d'unió al receptor de SARS-CoV-2 i SARS-CoV. Ciència. 2020;368(6491):630–633.

36. Starr TN, et al. Mapa complet de les mutacions SARS-CoV-2 RBD que escapen de l'anticòs monoclonal LY-CoV555 i el seu còctel amb LY-CoV016. Rep cel·lular Med. 2021;2(4):100255.

37. Baum A, et al. Els anticossos REGN-COV2 prevenen i tracten la infecció per SARS-CoV-2 en macacs rhesus i hàmsters. Ciència. 2020;370(6520):1110–1115.

38. Wu NC, et al. Un mode d'unió alternatiu dels anticossos IGHV3-53 al domini d'unió del receptor SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y, et al. Un parell d'anticossos neutralitzadors humans no competidors bloquegen la unió del virus COVID-19 al seu receptor ACE2. Ciència. 2020;368(6496):1274–1278.

40. Yuan M, et al. Ramificacions estructurals i funcionals de la deriva antigènica en variants recents del SARS-CoV-2. Ciència. 2021;373(6556):818–823.

41. Yan Q, et al. Els anticossos neutralitzadors de RBD codificats per IGHV3-53-de la línia germinal estan presents habitualment als repertoris d'anticossos dels pacients amb COVID-19. Els microbis emergents infecten. 2021;10(1):1097–1111.

42. Zhang Q, et al. Anticossos públics potents i protectors IGHV3- 53/3-66 i el seu mutant d'escapament compartit a l'espiga del SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021;12(1):4210.

43. Wang Z, et al. Anticossos provocats per la vacuna d'ARNm contra SARS-CoV-2 i variants circulants. Naturalesa. 2021;592(7855):616–622.

44. Simon V, et al. PARÍS i ESPARTA: trobant el taló d'Aquil·les del SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN, et al. Anticossos SARS-CoV-2 RBD que maximitzen l'amplitud i la resistència a la fugida. Naturalesa. 2021;597(7874):97–102.

46. ​​Murs AC, et al. Estructura, funció i antigenicitat de la glicoproteïna d'espiga del SARS-CoV-2. Cèl·lula. 2020;181(2):281–292.

47. Henderson R, et al. Control de la conformació de la glicoproteïna de punta del SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.

48. Shrestha LB, et al. Anticossos neutralitzants àmpliament contra les variants emergents del SARS-CoV-2. Front Immunol. 2021;12:752003.

49. Greaney AJ, et al. Els anticossos provocats per la vacunació d'ARNm-1273 s'uneixen més àmpliament al domini d'unió al receptor que els de la infecció per SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM, et al. La infecció de la variant beta del SARS-CoV-2 provoca anticossos de reacció creuada i específics del llinatge potents. Ciència. 2022;375(6582):782–787.

51. Wrammert J, et al. Els anticossos de reacció creuada àmpliament dominen la resposta de les cèl·lules B humanes contra la infecció pandèmica del virus de la grip H1N1 del 2009. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.

52. Guthmiller JJ, et al. Primera exposició a anticossos neutralitzants àmpliament induïts pel virus pandèmic H1N1 dirigits als epítops del cap de l'hemaglutinina. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G, et al. L'enginyeria de l'antigen de la grip se centra en les respostes immunes a un epítop viral subdominant però àmpliament protector. Microbi cel·lular hoste. 2019;25(6):827–835.

54. Nachbagauer R, et al. Un enfocament de vacuna contra el virus de la grip universal basat en hemaglutinina quimèrica indueix una immunitat àmplia i de llarga durada en un assaig de fase I aleatoritzat i controlat amb placebo. Nat Med. 2021;27(1):106–114.

55. Angeletti D, et al. Flanquejant la immunodominància per dirigir-se als epítops neutralitzants àmpliament subdominants. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ, et al. Un mètode eficient per generar anticossos monoclonals a partir de cèl·lules B humanes. Mètodes Mol Biol. 2019;1904:109–145.

57. Amanat F, et al. Un assaig serològic per detectar la seroconversió del SARS-CoV-2 en humans. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.

58. Stadlbauer D, et al. Seroconversió del SARS-CoV-2 en humans: un protocol detallat per a un assaig serològic, producció d'antigen i configuració de proves. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL, et al. Visió estructural d'un anticòs monoclonal humà altamente potent neutralitzant SARS-CoV-2. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C, et al. Microscòpia molecular automatitzada: el nou sistema Leginon. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.

61. Lander GC, et al. Appion: un pipeline integrat, basat en bases de dades per facilitar el processament d'imatges EM. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.

62. Voss NR, et al. DoG Picker i TiltPicker: eines de programari per facilitar la selecció de partícules en microscòpia electrònica d'una sola partícula. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.

63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera--un sistema de visualització per a investigacions i anàlisis exploratòries. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.

64. Punjani A, et al. Refinament no uniforme: la regularització adaptativa millora la reconstrucció crio-EM d'una sola partícula. Mètodes Nat. 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: determinació i correcció de CTF en temps real. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.

66. Zivanov J, et al. Noves eines per a la determinació automatitzada d'estructura crio-EM d'alta resolució a RELION-3. Elife. 2018;7:e42166.

67. Casanal A, et al. Desenvolupaments actuals en coot per a la construcció de models macromoleculars de criomicroscòpia electrònica i dades cristal·logràfiques. Proteïna Sci. 2020;29(4):1069–1078.

68. Frenz B, et al. Correcció automàtica d'errors en estructures de glicoproteïnes amb rosetta. Estructura. 2019;27(1):134–139.

69. Klaholz BP. Derivació i perfeccionament de models atòmics en cristal·lografia i crio-EM: les últimes eines Phenix per facilitar l'anàlisi de l'estructura. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pt 10):878–881.

70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: visualització de l'estructura per a investigadors, educadors i desenvolupadors. Proteïna Sci. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Processament de dades de difracció de raigs X recollides en mode d'oscil·lació. Mètodes Enzimol. 1997;276:307–326.

72. McCoy AJ, et al. Programari cristal·logràfic Phaser. J Appl Crystallogr. 2007;40(pt 4):658–674.

73. Qiang M, et al. Els anticossos neutralitzadors del SARS CoV-2 es van seleccionar d'una biblioteca d'anticossos humans construïda fa dècades. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: eines de construcció de models per a gràfics moleculars. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60(pt 12 pt 1):2126–2132.

75. Adams PD, et al. PHENIX: un sistema complet basat en Python per a la solució d'estructura macromolecular. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(pt 2):213–221.

76. Montiel-Garcia D, et al. Epitope-Analyzer: una eina web basada en l'estructura per analitzar epítops neutralitzadors àmpliament. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.