Immunitat i protecció sinèrgiques en ratolins mitjançant la coimmunització amb vacunes d'ADN que codifiquen la proteïna Spike i altres proteïnes estructurals del SARS-CoV-2

Resum:L'aparició de noves variants de la síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS CoV-2) ha generat brots d'infecció recurrents a tot el món. Aquestes variants altament mutades redueixen l'eficàcia de les vacunes actuals contra la malaltia del coronavirus 2019 (COVID-19), que estan dissenyades per orientar només la proteïna espiga (S) del virus original. Excepte el S del SARS-CoV-2, el potencial immunoprotector d'altres proteïnes estructurals (nucleocàpsida, N; embolcall, E; membrana, M) com a antígens diana de la vacuna encara no està clar i mereix ser investigat. En aquest estudi, es van desenvolupar vacunes d'ADN sintètic que codifiquen quatre proteïnes estructurals SARS-CoV-2 (pS, pN, pE i pM) i els ratolins es van immunitzar amb tres dosis mitjançant injecció intramuscular i electroporació. En particular, la coimmunització amb dues vacunes d'ADN que expressaven les proteïnes S i N va induir anticossos neutralitzants més alts i va ser més eficaç per reduir la càrrega viral del SARS-CoV-2 que la proteïna S sola en ratolins. A més, la coimmunització de pS amb pN o pE + pM va induir una immunitat cel·lular específica de proteïna S més alta després de tres immunitzacions i va provocar canvis histopatològics més lleus que el pS sol després del repte. El paper de les proteïnes estructurals conservades del SARS-CoV-2, incloses les proteïnes N/E/M, s'hauria d'investigar més per a les seves aplicacions en el disseny de vacunes, com les vacunes d'ARNm.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Paraules clau: COVID-19; SARS-CoV-2}}; coimmunització; vacuna d'ADN; proteïna d'espiga; proteïna estructural

1. Introducció

La síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV-2) és la causa de la malaltia coronavirus 2019 (COVID-19), que ha causat milions d'infeccions i morts a tot el món i ha posat en perill la salut humana i l'economia global . Tot i que encara no estan disponibles enfocaments terapèutics efectius, han avançat ràpidament, inclosa l'aplicació de la teràpia amb cèl·lules CAR-T i la nanotecnologia [1,2]. La vacunació és una manera eficaç de controlar la pandèmia i s'han aprovat diverses vacunes per al seu ús per diversos organismes reguladors de la salut [3,4]. El genoma del coronavirus codifica quatre proteïnes estructurals principals, és a dir, les proteïnes d'espiga (S), nucleocàpsida (N), membrana (M) i embolcall (E), que són responsables de l'assemblatge del virió i de la supressió de la resposta immune de l'hoste [5]. ]. La proteïna S està formada per 1273 residus d'aminoàcids que contenen dues subunitats, a saber, S1 i S2. Media l'entrada viral i és un objectiu important per desenvolupar vacunes contra el coronavirus [6-11]. Tanmateix, la proteïna SARS-CoV-2 S té una freqüència de mutació elevada. No és sorprenent que en el SARS-CoV-2, un virus d'ARN, la mutació sigui contínua i inevitable. Hi ha hagut cinc variants de preocupació per SARS-CoV-2 (VOC) que han sorgit des del setembre de 2020, incloent B.1.1.7 (Regne Unit, Alfa), B.1.351 (Sud-àfrica, Beta), P.1 (Brasil, Gamma), B.1.617.2 (Índia, Delta) i B.1.1.529 (Sud-àfrica, Omicron) (Andreano i Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Tots tenen diverses mutacions a la proteïna espiga [12]. Aquestes variants amenacen l'eficàcia de les vacunes COVID-19 actuals, que estan dissenyades per orientar només la proteïna de l'espiga.

La proteïna N del SARS-CoV-2 s'uneix a l'ARN viral a través d'un 140-domini d'unió d'ARN llarg d'aminoàcids al nucli d'una manera "perla en una corda". Està altament conservat entre els coronavirus, compartint una identitat de seqüència del ~ 90% amb la del SARS-CoV, i també és l'única proteïna estructural dins del virió [13]. A més, té un paper important a l'hora d'empaquetar l'ARN viral al complex de la càpsida ribonucleo i és necessari per a la replicació de l'ARN viral, el muntatge de virions i l'alliberament de les cèl·lules hostes [14]. A partir de l'alta similitud de seqüències de la proteïna N en els coronavirus, es pot suggerir com a objectiu de la vacuna de protecció creuada. Abans vam trobar que la coimmunització amb dues vacunes d'ADN que expressen proteïnes E i M proporciona una protecció parcial contra SARS-CoV -2, i aquest mètode s'ha de tenir en compte durant el desenvolupament de la vacuna [15]. Segons el document panoràmic de l'OMS, normalment hi ha set estratègies per a candidats a la vacuna SARS-CoV-2, que es poden dividir en tres categories: en primer lloc, vacunes basades en proteïnes, incloses les vacunes de virus inactivats, similars a virus. vacunes de partícules i subunitats de proteïnes; segon, vacunes basades en gens, incloses vacunes vectoritzades per virus, vacunes d'ADN i vacunes d'ARNm; tercer, una combinació d'enfocaments basats en proteïnes i basats en gens, com les vacunes de virus vius atenuats. Les tecnologies d'ADN, com a noves estratègies de vacuna basades en gens, poden comparar ràpidament múltiples candidats a vacunes i estratègies durant les proves preclíniques [16,17]. Teòricament, gairebé totes les proteïnes virals són immunògens potencials i dianes de la vacuna. Tanmateix, segons el que sabem, la immunogenicitat i el potencial protector de les vacunes d'ADN sintètic en la codificació de proteïnes SARS-CoV-2 S i altres proteïnes estructurals encara no s'han informat de manera sistemàtica. Es van avaluar quatre vacunes d'ADN que expressaven proteïnes SARS-CoV-2 S, N, E i M l per la seva immunogenicitat i eficàcia protectora en ratolins per explorar els efectes immunològics de S en combinació amb altres proteïnes estructurals.

2. Materials i Mètodes

2.1. Cèl · lules

Les cèl·lules Huh7.5 i les cèl·lules 293T de ronyó embrionari humà es van cultivar a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada al 5% de CO2 durant tot l'estudi. Les cèl·lules es van cultivar en medi DMEM (HyClone, Logan, UT, EUA), complementat amb un 10% de FBS (GEMINI Co., Xangai, Xina) i un 1% de penicil·lina-estreptomicina (Gibco, Nova York, NY, EUA). Totes les línies cel·lulars es van confirmar negatives per a la contaminació per micoplasma.

2.2. Construcció de vacunes d'ADN que codifiquen SARS-CoV-2 S/N/E/M

El gen que codifica la proteïna SARS-CoV-2 S/N, que conté una seqüència Kozak N-terminal (GCCACC) seguida d'un codó d'iniciació (ATG), es va sintetitzar mitjançant un codó optimitzat per a mamífers (GenScript Co., Nanjing). , Xina). Després es va clonar al vector d'expressió pcDNA3.1 (+) mitjançant la digestió EcoRI i XbaI i es va anomenar pS/pN (vacunes d'ADN) (figura 1A). La proteïna pE/PM es va construir i identificar tal com es va descriure anteriorment [15]. Les vacunes es van preparar mitjançant kits Maxiprep lliures d'endotoxines (Qiagen, Beijing, Xina) i les seqüències es van confirmar mitjançant la seqüenciació d'ADN de Sanger. L'expressió de la proteïna S/N es va confirmar mitjançant western blotting i anticossos anti-S (Sino Biological, Beijing, Xina)/anti-N diluïts a 1:1000. Aquests experiments es van dur a terme tal com es va descriure anteriorment [15, 18].

Figura 1. Disseny i expressió de construccions de vacuna de proteïnes SARS-CoV-2 S/N basades en ADN recombinant. (A) Diagrama esquemàtic de les vacunes basades en ADN recombinant que codifiquen proteïnes SARS-CoV-2 espiga (PS), nucleocàpsida (pN), embolcall (pE) i/o proteïnes de membrana (PM). (B) L'expressió de la proteïna objectiu a les vacunes d'ADN es va validar mitjançant l'anàlisi de western blot de cèl·lules 293T transfectades amb els plasmidis pS/pN/pE/pM.

2.3. Immunització i repte

Les femelles de ratolins BALB/c (Charles River Laboratories, França) a les 6 setmanes d'edat es van allotjar a l'Institut Nacional de Salut Ocupacional i Control de Verí en un entorn de 21 ◦ C i humitat controlada amb cicles de llum/foscor de 12 h. Mentrestant, es van proporcionar menjar i aigua ad libitum i tots els experiments amb animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica dels Experiments amb Animals del Centre Xinès per al Control i la Prevenció de Malalties (Xina CDC). La investigació va complir amb les normes ètiques pertinents.

Els ratolins es van dividir aleatòriament en cinc grups i es van immunitzar amb pS/pN sol o coimmunitzats amb pS + pN o pS + pE + PM els dies 0, 21 i 42 mitjançant injecció intramuscular més electroporació (35 mg/50 mL) (Figura 2) [19,20]. Breument, es van injectar vacunes d'ADN al múscul tibial anterior (TA) i immediatament es van polsar amb electricitat mitjançant un elèctrode de matriu de dues agulles de 5 mm de distància (ECM830; BTX) amb agulles. Es van recollir sèrums dels ratolins per a l'anàlisi de la resposta immune humoral i es van processar les melses del ratolí per mesurar la resposta immune cel·lular (figura 2).

Figura 2. Esquema del repte d'immunització i SARS-CoV-2. Curs temporal de vacunació, desafiament i mostreig de sang/teixit. Els ratolins BALB/C es van dividir aleatòriament en grups.

Els experiments de desafiament SARS-CoV-2 es van dur a terme tal com es va descriure anteriorment [15,21]. Breument, els ratolins van ser anestesiats i després transduïts per via intranasal amb 2,5 × 108 PFU d'Ad5-hACE2 en un volum total de 45 µL. Cinc dies després de la transducció, els ratolins van ser anestesiats i després desafiats per via intranasal amb 1 × 105 TCID50 de SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB{-02/2019) en un volum total de 50 µL de solució salina tampó. Tot el treball amb SARS-CoV-2 en viu en models de ratolí es va realitzar en laboratoris de nivell 3 de bioseguretat animal (ABSL-3).

2.4. Assaig immunoabsorbent lligat a enzims

Els assaigs immunosorbents lligats a enzims (ELISA) es van realitzar tal com es va descriure anteriorment [15]. Breument, les proteïnes S (compradas a Sino Biological)/N (un regal de Song) diluïdes en tampó de carbonat (0,1 M, pH 9,6) es van recobrir sobre plaques 96-pous EIA/RIA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) durant la nit a 4 ◦C. Les plaques es van bloquejar amb 200 µL de sèrum de cabra al 10% en PBS a 37 ◦ C durant 2 h, seguit de rentat cinc vegades amb PBST. A continuació, es van afegir mostres de sèrum diluïdes en sèrie en sèrum de cabra al 2% en PBS i es van incubar durant 2 h a 37 ◦ C, seguit de cinc rentats amb PBST. Es va afegir Ab IgG anti-ratolí de cabra conjugada amb HRP (1: 5000) a 37 ◦ C durant 1 h. Es van afegir un total de 100 µL de substrat TMB a cada pou i es van apagar amb 50 µL de H2SO4 2M. L'absorbància es va llegir a una longitud d'ona de 450 nm mitjançant SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, Xina).

planta de cistanche per augmentar el sistema immunitari

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Experiments d'infecció i neutralització per pseudovirus

L'assaig de neutralització de pseudovirus es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [21, 22]. Prèviament es va construir un plasmidi que expressava la proteïna S del virus ancestral [22]. Es va sintetitzar la variant d'Omicron del gen de la proteïna espiga SARS-CoV-2 (GISAID: EPI_ISL{_6590782.2) (un regal de Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Xina) utilitzant un codó optimitzat per a mamífers i clonat al vector pcDNA3.1, tal com es va descriure anteriorment [22]. Breument, els plasmidis que expressaven un reporter de luciferasa i els plasmidis que expressaven la proteïna S es van co-transfectar a cèl·lules HEK 293T mitjançant el reactiu de transfecció d'ADN X-treme GENE HP. El cultiu cel·lular es va refrescar 6 hores després de la transfecció i el sobrenedant que contenia pseudovirus es va recollir després de 48 hores i es va emmagatzemar a -70 ◦ C. En l'assaig de neutralització de pseudovirus, es va incubar una barreja sèrum-virus igual a 37 volums del sobrenedant que contenia pseudovirus i després es va afegir al sèrum diluït. ◦C durant 1 h. A continuació, els medis de cultiu de cèl·lules Huh7.5 es van substituir per 100 µL de la barreja sèrum-virus i es van incubar a 37 ◦ C durant 12 h. Les cèl·lules cultivades només amb pseudovirus SARS-CoV-2 es van executar en paral·lel. A continuació, els mitjans es van substituir per DMEM (2% FBS) i la incubació es va incubar a 37 ◦ C durant 48 h. A continuació, es va mesurar el senyal de luciferasa utilitzant el kit de luciferasa de luciferasa Bright-Glo (Promega).

2.6. Assaig de neutralització del SARS-CoV-2

En aquest experiment es va utilitzar SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Breument, els sèrums es van diluir dues vegades a partir d'una dilució inicial d'1:10, es van barrejar amb un volum igual (10-15 pfu/pou) de SARS-CoV -2 viu i es van incubar durant 1 h a 37 ◦C, després de la qual cosa es van afegir a les cèl·lules Vero sembrades. Després de la incubació a 37 ◦ C durant 48 h, es va observar un efecte citopàtic (CPE) i es van recollir 100 µL del sobrenedant de cultiu per a l'extracció d'àcids nucleics i PCR de transcripció inversa de fluorescència en temps real (RT-PCR). La dosi de neutralització mitjana (ND50) es va calcular mitjançant el mètode Reed-Munch [15].

2.7. Assaig IFN-ELISpot

Scilight Biotechnology, LLC va sintetitzar els conjunts de pèptids que abasten tota la proteïna S/N/E/M com a 15-mers consecutius sobre 10 aminoàcids. Aproximadament 2, 5 mg de cada pèptid purificat del grup de pèptids estaven presents per vial. L'experiment es va dur a terme tal com es va descriure anteriorment [18]. Breument, les plaques de pou (BD ELISPOT Set, EUA) es van recobrir amb Ab anti-IFN-captura i es van incubar durant la nit a 4 ◦C. Les plaques es van bloquejar amb el medi de cultiu complet després de rentar-se tres vegades. Els esplenòcits es van recol·lectar després que els ratolins fossin eutanasiats els dies 35 i 120 es van planejar suspensions fresques d'un sol grup de cada grup a 5 × 106 per pou i es van afegir pèptids. A continuació, es van incubar les plaques a 37 ◦ C en un 5% de CO2 durant 22 hores i es van detectar mitjançant un lector de plaques ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, EUA). Una unitat formadora de taques (SFU) representa un IFN- secretor de cèl·lules T.

2.8. Avaluació de la protecció en ratolins desafiament post-SARS-CoV-2

Els experiments es van dur a terme tal com es va descriure anteriorment [15, 21]. Breument, els pulmons es van collir després que els ratolins fossin sacrificats. La meitat dels teixits es van utilitzar per a l'extracció d'àcids nucleics, RT-PCR de fluorescència en temps real i TCID50. L'altra meitat es va enviar a la Facultat de Medicina Veterinària de la Universitat Agrícola de la Xina per a una avaluació patològica.

2.9. Anàlisi estadística

Les proves t no aparellades, les proves ANOVA bidireccionals i la prova de comparacions múltiples de Dunnett es van realitzar mitjançant GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). Els valors p < 0.05 es van considerar estadísticament significatius (* p < 0.05; ** p < 0,01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Resultats

3.1. Caracterització de les vacunes d'ADN

Els nivells de proteïnes E i M es van detectar mitjançant Western blotting. Hem mesurat l'expressió de les proteïnes S/N/E/M codificades de SARS-CoV-2 en cèl·lules T HEK-293 transfectades amb plasmidis pS/pN/pE/pM mitjançant l'anàlisi de western blot, utilitzant anti -Anticossos S/anti-N i un anticòs anti-6 x His, en els lisats cel·lulars. Les bandes es van aproximar al pes molecular previst de les proteïnes S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) i M (22–25 kDa) (figura 1B).

3.2. Producció robusta i sostinguda d'IgG anti-S i/o anti-N induïda per DNA pS i/o pN

Vacunes El sèrum es va recollir de ratolins BALB/c als 35, 56, 96 i 120 dies (figura 2). Els nivells d'IgG anti S/anti-N es van detectar mitjançant ELISA. La magnitud de la resposta IgG específica de S o N induïda per pS o pN es va incrementar en el sèrum després del primer i segon impuls. Els títols d'IgG anti-S i anti-N van ser més alts en el grup pS + pN que en els altres grups; tanmateix, la diferència no va ser estadísticament significativa (figura 3A, B). No es van detectar respostes robustes d'anticossos específiques de proteïna E/M, cosa que és coherent amb els resultats d'un estudi anterior (dades no mostrades) [15].

Figura 3. Respostes de cèl·lules B al SARS-CoV-2 en ratolins BALB/c. (A) Títols de punt final d'unió IgG sèrica per a les proteïnes SARS-CoV -2 S (A) i N (B). (C) Els títols de neutralització es van determinar a partir d'un sistema de virus pseudotipat SARS-CoV-2. (D) Els títols de neutralització anti-SARS-CoV-2 es van determinar mitjançant un virus SARS-CoV-2. (E) Assaig de neutralització basat en un sistema de virus pseudotipat SARS-CoV-2 Omicron. Es mostren les proporcions d'inhibició dels sèrums dels grups simulats (blau), pS (vermell), pS + pN (verd), pS + pE + pM (rosa) i pN (taronja). Les barres d'error representen el SEM i els valors p es van calcular mitjançant un ANOVA bidireccional i l'anàlisi post hoc de Sidak, on * p < 0.05

3.3. Alts nivells d'anticossos neutralitzants induïts per la coimmunització amb vacunes pS i pN

Els títols neutralitzants de mostres de sèrum diluïdes en sèrie es van determinar mitjançant el virus SARS-CoV-2 pseudotipat. Els nivells més alts d'anticossos neutralitzants (nAbs) es van observar al grup pS + pN, amb els títols mitjans geomètrics recíprocs d'EC50 assolint 2988 (el dia 35) i 3578 (el dia 56) (figura 3C). Es van observar resultats similars mitjançant l'assaig de microneutralització de virus vius (MN), en què els nivells de nAbs al grup pS + pN eren més alts que els del grup S els dies 56 i 96 (p <0.05; figura; 3D). A més, els nivells de nAbs al grup pS + pN el dia 56 (segon impuls) van ser significativament més alts que els del dia 35 (p <0, 05; Figura 3D).

L'activitat neutralitzadora de cada règim de vacuna contra la variant d'Omicron del SARS-CoV-2 es va determinar encara més mitjançant la plataforma pseudotipada i mostres de sèrum. El perfil de neutralització contra el virus Omicron els dies 35 i 56 va ser similar al del virus ancestral (figura 3E), cosa que suggereix que el tractament PS + pN tenia potència de neutralització creuada.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

3.4. Respostes de cèl·lules T induïdes per la vacunació amb ADN

Tal com es va descriure anteriorment, les respostes de les cèl·lules T contra els antígens SARS-CoV-2 S/N/E/M es van estimar mitjançant IFN-ELISpot, tal com es va descriure anteriorment [15]. Com era d'esperar, tant els règims PS + pN com pS + pE + pM van induir nivells significativament més alts de cèl·lules IFN + T específiques per a la proteïna S el dia 120 que el dia 35 (p <0. 05; Figura 4A). A més, el nombre de cèl·lules IFN + T específiques per a la proteïna N el dia 120 (segon impuls) va ser significativament superior al del dia 35 al grup pS + pN (p <0, 05; Figura 4B). Finalment, el nombre de cèl·lules IFN + T específiques per a la proteïna M el dia 120 (segon impuls) va ser significativament superior al del dia 35 en ambdós grups (p <0, 05; Figura 4D).

Figura 4. Respostes de cèl·lules T a proteïnes estructurals individuals del SARS-CoV-2 en ratolins BALB/c. (A) Les respostes de les cèl·lules T es van mesurar mitjançant IFN-ELISpot en esplenòcits estimulats durant 2 0 h amb pools de pèptids superposats que abasten el SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, i (D) proteïnes M. Les barres representen la mitjana ± SD. Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant un ANOVA bidireccional i la prova post hoc de Sidak, on * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 i **** p <0,0001.

3.5. Protecció sinèrgica induïda per coimmunització amb pS/pN o pS/pE/pM

A continuació, vam avaluar l'eficàcia protectora de les vacunes d'ADN mitjançant ratolins hACE2 immunitzats després del repte amb el virus ancestral SARS-CoV-2. Després del repte, els ratolins del grup simulat van mostrar una pèrdua de pes gradual. En canvi, els ratolins immunitzats amb pS o pS + van mostrar una lleugera pèrdua de pes immediatament després de la infecció, seguida de la recuperació (figura 5A). No es va detectar cap virus viu als ratolins vacunats amb pS, pS + pN o pS + pE + pM. A més, la vacunació pS + pN va reduir significativament el nombre de còpies d'ARN viral en comparació amb les obtingudes només amb la vacunació pS (p=0.0228; figura 5B). A més, la histopatologia pulmonar va demostrar que els ratolins tant del grup simulat com del pN mostraven pegats focals d'inflamació, invaginació pleural, col·lapse alveolar, nivells elevats d'infiltració de cèl·lules inflamatòries i àrees hemorràgiques. En comparació, els ratolins tractats amb pS + pN o pS + pE + pM van mostrar canvis histopatològics més lleus i puntuacions INHAND més baixes després del repte que l'altre grup (figura 5C).

Figura 5. Eficàcia protectora de la immunització després del repte amb el virus SARS-CoV-2 viu. (A) Els ratolins es van pesar diàriament (mitjana ± error estàndard de la mitjana (SEM), n=4) durant tres dies després del repte. (B) Títol infecciós de SARS-CoV-2 en homogeneïtats pulmonars el tercer dia després de la prova, tal com es determina mitjançant l'assaig TCID5{{10}} i el número de còpia d'ARN. Les diferències estadísticament significatives entre grups es van determinar mitjançant un ANOVA unidireccional seguit de la correcció de comparació múltiple de Dunnett (* p <0.05, ** p <0,01, *** p <0,001 i **** p <0,0001). (C) Anàlisi histopatològic pulmonar mitjançant tinció H&E.

4. Discussió

En aquest estudi, la coimmunització amb dues vacunes d'ADN que expressaven les proteïnes S i N va induir nivells elevats de nAb i va ser molt eficaç per reduir la càrrega viral del SARS-CoV-2 en ratolins. Les vacunes d'ADN que expressaven la proteïna S van induir un augment dels nivells d'immunitat cel·lular específics de la proteïna S després de tres immunitzacions quan els ratolins van ser coimmunitzats amb proteïnes N/E i M i van alleujar els canvis histopatològics posteriors al repte. Segons el que sabem, aquest és el primer informe que revela la millora sinèrgica de la immunitat i la protecció en ratolins que utilitzen una vacuna d'ADN que codifica la proteïna S quan estan coimmunitzats amb vacunes d'ADN que codifiquen altres proteïnes estructurals del SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

En diversos estudis s'han observat epítops de cèl·lules B immunodominants a les regions d'antigen N. Les vacunes basades en N normalment no poden induir nAb, probablement perquè la proteïna N no es mostra a la superfície viral. En particular, la coimmunització amb les proteïnes S i N va induir nivells més alts de nAb contra el virus ancestral i Omicron SARS-CoV-2 que els altres grups. L'augment de les respostes de nAb s'associen amb una millor eliminació viral i una eficàcia protectora. Els nostres resultats van demostrar que el tractament pS + pN era més eficaç que el tractament amb pS sol per reduir la càrrega viral del SARS-CoV-2 després del repte. Un estudi anterior va informar que els hàmsters immunitzats amb una vacuna que coexpressa les proteïnes M i N estaven protegits contra la pèrdua de pes greu i la patologia pulmonar i tenien una reducció significativa dels títols virals a l'orofaringe i als pulmons després del repte SARS-CoV-2, que és coherent amb els nostres resultats [23]. Malauradament, la reducció dels títols de virus no es pot atribuir específicament a la proteïna M o N, i els nivells de nAb no es van avaluar en aquest estudi. Un estudi sobre la vacuna d'ARNm SARS-CoV-2 va informar que la coimmunització S + N va induir una resposta augmentada de cèl·lules T CD8+ específica de S i neutralitzant l'activitat dels anticossos, proporcionant una millor protecció als pulmons contra el Delta variant en comparació amb S sol, que és coherent amb els resultats d'aquest estudi [24]. Un altre estudi va informar que la proteïna N del coronavirus de gastroenteritis transmissible va promoure la síntesi d'anticossos neutralitzants quan es van estimular cèl·lules TGEV-IMMUNE porcines amb una combinació de proteïnes S i N in vitro, i aquest efecte es podria explicar per la resposta dels limfòcits T auxiliars a la proteïna N [25].

S'han identificat anteriorment epítops de cèl·lules T CD4+/CD8+ immunodominants a les regions de l'antigen N. Diversos estudis han informat que les vacunes basades en la proteïna SARS-CoV-2 N indueixen eficaçment respostes immunes cel·lulars. El grup S + N va mostrar un augment dels nivells d'immunitat cel·lular específic de la proteïna S després de tres immunitzacions. Un estudi sobre la vacuna d'ARNm SARS-CoV-2 va informar que S + N combinatòria va induir una resposta augmentada de cèl·lules T CD8+ específica de S en comparació amb S sola, cosa que és coherent amb els nostres resultats [24]. Un altre estudi va informar que les respostes de cèl·lules T als antígens S i N després de la vacunació principal de l'antigen dual hAd5 S + N només eren equivalents a les de pacients anteriorment infectats per SARS-CoV-2- i models de predicció in silico de cèl·lules T. la unió de l'epítop HLA va suggerir que les respostes de cèl·lules T a la vacuna hAd5 S + N mantindran la seva eficàcia contra la variant B.1.351. A més, el plasma de pacients prèviament infectats per SARS-CoV-2-va mostrar una afinitat d'unió més alta amb les cèl·lules que expressaven la construcció S-Fusion + N-ETSD de l'antigen dual que només amb la S-Fusion hAd5, cosa que suggereix a més que la immunogenicitat de la La vacuna d'antigen doble S + N és millor que la de la vacuna d'antigen únic S [26].

El virus viu no es va detectar als pulmons i la pèrdua de pes després del repte es va mitigar en els grups pS, pS + pN i pS + pE + pM, mentre que el tractament pN no va reduir eficaçment el títol del virus. Aquestes troballes emfatitzen la indispensabilitat i l'eficàcia de la proteïna S com a objectiu de la vacuna. En particular, la coimmunització amb pS i pN va tenir millors efectes que pS o pN sobre l'eliminació viral. El grup pS + pE + pM va indicar menys canvis histopatològics als pulmons, cosa que és coherent amb els resultats del nostre estudi anterior [15]. El grup S + N tenia còpies baixes d'ARN viral al pulmó, una pèrdua de pes reduïda i un temps de recuperació ràpid després del repte del SARS-CoV-2 en comparació amb el grup immunitzat només amb S/N, que era coherent amb el resultats d'aquest estudi. No obstant això, cap dels grups va detectar els títols d'anticossos neutralitzants, cosa que podria explicar-se per diferències en la varietat de la vacuna i els animals experimentals [26]. Un estudi sobre la vacuna de vectors d'adenovirus SARS-CoV-2 va informar que la vacuna S només proporcionava una protecció cerebral aguda quan es va coimmunitzar amb una vacuna N [27]. Un altre estudi va desenvolupar vacunes Tri: ChAd, Bi: ChAd i Mono: ChAd que expressaven les proteïnes S1/N/RdRp, N/RdRp i S1, respectivament, i les va provar en un model animal B.1.351. Es va observar una gran patologia grossa als pulmons Mono: ChAdlungs, mentre que els pulmons Bi: ChAd i Tri: ChAd semblaven gairebé lliures d'aquesta patologia [28].

A més, els animals no vacunats tenien càrregues virals pulmonars elevades, mentre que el tractament Tri: ChAd va reduir significativament les càrregues virals en 3,5 registres. En comparació, les vacunes Bi: ChAd i Mono: ChAd només van reduir moderadament la càrrega viral. Aquests resultats suggereixen que l'efecte protector de la vacuna de doble antigen S/N contra variants pot ser millor que el de la vacuna d'un sol antigen S, la qual cosa és coherent amb els nostres resultats [28]. Alguns estudis han informat que els ratolins immunitzats amb proteïna N desenvolupen una inflamació pulmonar severa després de la infecció per SARS-CoV [29–31]. Estudis anteriors també han informat que la immunització amb una vacuna vector adenovirus que expressa la proteïna N del virus de l'hepatitis del ratolí protegeix els ratolins contra la infecció letal, cosa que demostra que la proteïna N podria generar un efecte protector [32]. A més, el grup immunitzat amb la vacuna d'ADN CRT/N va tenir un títol viral significativament reduït després del repte, amb un virus vaccinia que expressava la proteïna SARS-CoV N [33].

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Un estudi sobre la proteïna S va demostrar que la vacuna combinada d'ADN/proteïna va induir la immunitat tant humoral com cel·lular millor que la vacuna d'ADN/proteïna sola [8]. Les vacunes dirigides només a la proteïna S han demostrat una eficàcia reduïda per protegir contra COVID-19 lleu a moderada causada per variants emergents. Els papers de les proteïnes estructurals conservades SARS-CoV-2, incloses les proteïnes N/E/M, mereixen atenció en el disseny i les aplicacions de vacunes, ja que les respostes de cèl·lules T induïdes per la vacuna contra els epítops conservats generalment no es veuen afectades per les mutacions. . Un estudi va informar que els pacients recuperats amb SARS (n=23) encara posseïen cèl·lules T de memòria de llarga durada reactives a la proteïna N SARS-CoV 17 anys després del brot de 2003, que mostrava una forta reactivitat creuada amb el SARS CoV{ {15}} Proteïna N, validant encara més l'ús de la proteïna N com a objectiu de vacuna de protecció creuada [34]. Aquest estudi va demostrar que la coimmunització pS/pN es va associar amb respostes més altes de nAb, una millor eliminació viral i una millora de les respostes immunes cel·lulars i pot proporcionar una millor protecció després del repte SARS-CoV-2 en comparació amb pS sol. A més, s'ha demostrat que les variants del SARS-CoV-2 infecten moltes espècies animals i s'ha observat la transmissió d'home a animal en alguns animals salvatges i mascotes [7]. Per tant, la vacuna veterinària SARS-CoV-2 necessita més atenció. A més, la nanotecnologia pot ser una eina poderosa per optimitzar les vacunes i mereix més atenció [2].

Aquest estudi té diverses limitacions. En primer lloc, només vam observar l'estratègia de vacuna d'ADN en ratolins BALB/c, i els estudis futurs haurien d'avaluar els efectes immunogènics d'aquests règims de vacuna en altres models animals. En segon lloc, es necessiten investigacions addicionals per entendre completament els mecanismes moleculars subjacents a les respostes augmentades de cèl·lules T CD8 específiques de nAb i S induïdes per la coimmunització mitjançant les proteïnes S i N i aprofitar aquest coneixement per optimitzar COVID-19 disseny de vacuna. Finalment, la funció dels anticossos específics de la proteïna N mereix un estudi addicional.

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

En conclusió, aquest estudi va avaluar el potencial immunoprotector de la coimmunització amb les proteïnes SARS-CoV-2 S, N, E i M. Diverses vacunes dirigides només a la proteïna S tenen un efecte protector reduït sobre les soques variants emergents. Els nostres resultats establiran les bases per desenvolupar una vacuna de reacció creuada contra la COVID-19 per controlar les variants actuals i emergents del SARS-CoV-2 i prevenir possibles pandèmies de coronavirus.

Referències

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Aplicació de la teràpia cel·lular CAR-T més enllà de l'oncologia: malalties autoimmunes i infeccions víriques. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanotecnologia contra el nou coronavirus (síndrome respiratori agut greu coronavirus 2): diagnòstic, tractament, teràpia i perspectives de futur. Nanomedicine 2021, 16, 497–516. [Ref creuat]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID-19 immunitat del ramat: on som? Nat. Reverent Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smalll, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Consideracions immunològiques per a les estratègies de vacuna contra la COVID-19. Nat. Reverent Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Anàlisi estructural del genoma del SARS-CoV-2 i prediccions de l'interatoma humà. Àcids nucleics Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mecanismes d'entrada del SARS-CoV-2 a les cèl·lules. Nat. mossèn Mol. Biol cel·lular. 2022, 23, 3–20. [Ref creuat]

7. Conforti, A.; Sánchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. Un candidat a una vacuna d'ADN lineal que codifica el domini d'unió al receptor SARS-CoV-2 provoca una potent resposta immune i anticossos neutralitzants en gats domèstics. Mol. Allà. Mètodes Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. Immunogenicitat de la vacuna combinada ADN/proteïna contra COVID-19. Bou. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [Ref creuat]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et al. Vacunes circulars d'ARN contra SARS-CoV-2 i variants emergents. Cel·la 2022, 185, 1728–1744.e16. [Ref creuat]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. Disseny de vacuna d'ARNm SARS-CoV-2 habilitat per la preparació de prototips de patògens. Natura 2020, 586, 567–571. [Ref creuat]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. Immunogenicitat del candidat a la vacuna contra la glicoproteïna SARS-CoV-2 NVX-CoV2373 en babuïns i protecció en ratolins. Nat. Commun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abbiento, V.; Benincasa, L.; et al. La immunitat híbrida millora les cèl·lules B i els anticossos contra les variants del SARS-CoV-2. Natura 2021, 600, 530–535. [Ref creuat]

13. Naqvi, AAT; Fàtima, K.; Mohammad, T.; Fàtima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Informació sobre el genoma, l'estructura, l'evolució, la patogènesi i les teràpies del SARS-CoV-2: enfocament de la genòmica estructural. Biochim. Biofísica. Acta Mol. Base. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. La nova vacuna d'ADN contra la COVID-19 de l'Índia per a adolescents i adults és la primera. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Han, D.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. Les vacunes d'ADN que expressen l'embolcall i les proteïnes de la membrana proporcionen protecció parcial contra SARS-CoV-2 en ratolins. Davant. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morrow, diputat; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. La vacuna intradèrmica SynCon®Ebola GP DNA és estable a la temperatura i demostra de manera segura els avantatges d'immunogenicitat cel·lular i humoral en voluntaris sans. J. Infectar. Dis. 2019, 220, 400–410. [Ref creuat]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. Immunogenicitat d'una vacuna d'ADN candidata a la COVID-19. Nat. Commun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Cançó, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. La coimmunització amb CHIKV VLP i vacunes d'ADN indueix una resposta humoral prometedora en ratolins. Front Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. La preparació amb dues vacunes d'ADN que expressen la proteïna NS3 del virus de l'hepatitis C dirigides a cèl·lules dendrítiques provoca un potencial protector heteròleg superior en ratolins. Arc. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [Ref creuat]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. Efecte millorat de la immunització d'ADN més l'electroporació in vivo amb una combinació de plasmidis core-PreS1 i S-PreS1 del virus de l'hepatitis B. Clin. Vacuna Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [Ref creuat]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; et al. Una vacuna d'ARNm COVID-19 estructurada en closca central amb un patró de biodistribució favorable i una immunitat prometedora. Transducte de senyal. Objectiu Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Desenvolupament i eficàcia del sistema pseudotipat SARS-CoV-2 determinat mitjançant la prova de neutralització d'eficiència i inhibició d'entrada in vitro. Biosaf. Salut 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA La vacuna replicada amb vectors de bacteris que expressa proteïnes de membrana i nucleocàpsida SARS-CoV-2 protegeix contra malalties greus semblants a la COVID-19-en hàmsters. Vacunes NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. La vacunació combinatòria d'ARNm millora la protecció contra la variant delta del SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Cooperation between transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV) structurel proteins in the in vitro induction of virus-specific anticossos. Res del virus. 1996, 46, 111–124. [Ref creuat]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Sastre, N.; Gelada, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; et al. La immunització única amb virus recombinants de la vacuna ACAM2000 que expressen l'espiga i les proteïnes nucleocàpsides protegeixen els hàmsters contra la malaltia clínica causada per SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Classe, J.; Dangi, T.; Richner, JM A la vacuna nucleocàpsida SARS CoV-2 protegeix contra la disseminació viral distal. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Sí, G.; Luo, X.; et al. El lliurament de la mucosa respiratòria de la vacuna COVID-19 de nova generació proporciona una protecció sòlida contra les soques ancestrals i variants del SARS-CoV-2. Cel·la 2022, 185, 896–915.e19. [Ref creuat]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. Augment de l'expressió de la proteïna nucleocàpsida SARS-CoV en el tabac i la seva immunogenicitat en ratolins. Vacuna 2009, 27, 5001–5007. [Ref creuat]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. La immunització prèvia amb la proteïna nucleocàpsida del coronavirus (SARS-CoV) associada a la síndrome respiratòria aguda severa (SARS) provoca pneumònia greu en ratolins infectats amb SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [Ref creuat]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Escabetx, R.; et al. Eficàcia de la vacuna en ratolins senescents desafiats amb variants epidèmiques i zoonòtiques de SARS-CoV recombinants. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ L'espiga del virus de l'hepatitis del ratolí i les proteïnes nucleocàpsides expressades per vectors d'adenovirus protegeixen els ratolins contra una infecció letal. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hung, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Ell, L.; Chen, PJ; et al. Generació i caracterització de vacunes d'ADN dirigides a la proteïna nucleocàpsida del coronavirus de la síndrome respiratòria aguda severa. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et al. Immunitat específica de cèl·lules T SARS-CoV-2-en casos de COVID-19 i SARS, i controls no infectats. Natura 2020, 584, 457–462. [Ref creuat]