Autorradiografia de fluorur de sodi [18F]-Imatge de nefrocalcinosi en ronyons de donant i al·loempelts de ronyó explantats

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nefrocalcinosiestà present fins a un 43 per cent delsronyóbiòpsies d'al·loempelt un any després del trasplantament i s'associa amb una funció inferior de l'empelt i una mala supervivència de l'empelt. Hem estudiat la imatge de fluorur de sodi [18F] ([18F]-NaF) de microcalcificacions en ronyons de donant (n= 7) i hem explantatronyóal·lografts (n= 13). Es van utilitzar seccions en sèrie incrustades en parafina de tres µm per a l'avaluació histològica de la calcificació (vermell d'alizarina; tinció de Von Kossa) i autorradiografia ex vivo [18F]-NaF. Les imatges es van fusionar per avaluar si les àrees de microcalcificació es corresponien amb les àrees d'absorció de [18F]-NaF. A partir de les anàlisis histològiques, es van presentar microcalcificacions tubulointersticials i glomerulars en 19/20 i 7/20 mostres, respectivament. Mitjançant autorradiografia, es va trobar la captació de [18F]-NaF en 19/20 mostres, amb una activitat de traçador significativament més gran aronyóal·loempelt en comparació amb mostres de ronyó de donant mort (p {{0}}.019). La tinció de vermell d'alizarina de les microcalcificacions actives va demostrar una bona correlació (rho de Spearman de 0,81, p <0,001) i="" la="" tinció="" de="" von="" kossa="" de="" les="" calcificacions="" consolidades="" va="" demostrar="" una="" correlació="" significativa="" però="" feble="" (0,62,="" p="0,003)" amb="" activitat="" [18f]-naf.="" aquesta="" correlació="" entre="" l'absorció="" ex="" vivo="" de="" [18f]-naf="" i="" les="" microcalcificacions="" provades="" en="" histologia,="" és="" el="" primer="" pas="" cap="" a="" un="" mètode="" d'imatge="" per="" identificar="" microcalcificacions="" en="">nefrocalcinosi. Això pot conduir a una millor comprensió de l'etiologia de les microcalcificacions i el seu impacte en la funció del trasplantament renal.

Feu clic per extreure cistanche beneficis per a la malaltia renal

Nefrocalcinosi, definit com la deposició parenquimàtica i tubular d'oxalat de calci (CaOx) o fosfat de calci (CaPhos), és un factor important en la disminució de la funció de l'empelt després deronyótrasplantament 1-3. La deposició de CaOx i CaPhos s'atribueix a nivells elevats d'oxalat sèric, calci sèric i fosfat sèric en pacients amb malaltia crònica.ronyómalaltia i/o hiperparatiroïdisme4,5. La incidència denefrocalcinosi, basat en biòpsies d'al·loempelt de ronyó, és del 6% als 6 mesos, del 25 al 43% al cap d'un any i fins al 79% als 10-anys desprésronyótrasplantament 5-7. Els estudis centrats en biòpsies d'al·loempelt de ronyó dins d'un any després del trasplantament van demostrar una associació entre la presència primerenca de deposicions de calci i la funció inferior de l'graf i la mala supervivència de l'graf4,8,9. Tanmateix, encara no està clar si aquestes microcalcificacions tenen un paper actiu en la disfunció de l'al·lograft o són només indicadors del metabolisme mineral desregulat.

Quedar,ronyóLes biòpsies d'al·loempelt són l'únic mètode de diagnòstic per avaluar les microcalcificacions posteriors al trasplantament. Un enfocament diagnòstic no invasiu i fiable permetria mesuraments repetits, facilitant el seguiment de les calcificacions al llarg del temps i estudis d'intervenció amb la millora potencial dels resultats de la funció de l'empelt i la supervivència de l'empelt després del trasplantament de ronyó10.

La imatge per tomografia per emissió de positrons/tomografia computada (PET/TC) amb fluorur de sodi [18F] ([18F]-NaF) s'utilitza en la pràctica clínica i estudis experimentals com a modalitat d'imatge esquelètica i vascular11–15. Tot i que la visualització fiable de les microcalcificacions vasculars es veu obstaculitzada amb la TC, els resultats de la imatge microPET ex vivo [18F]-NaF es correlacionaven bé amb les microcalcificacions provades en histologia en mostres vasculars humanes i animals16,17. A més, els resultats de diversos estudis clínics prospectius van demostrar que l'activitat vascular precoç [18F]-NaF es relaciona bé amb les microcalcificacions, detectades per imatges TC, i, més interessant, amb l'augment de la mida d'aquestes calcificacions18–20.

Aquí, presentem els resultats d'un estudi d'autorradiografia de prova de concepte per a l'ús ex vivo de la imatge [18F]-NaF denefrocalcinosien el donantronyonsi al·loempelts de ronyó trasplantats com a enfocament diagnòstic per a la visualització de microcalcificacions.

Taula 1.RonyóCaracterístiques del receptor de trasplantament. No hi ha casos d'hipercalcèmia en aquesta cohort; *classificació de Banf Classification of Allograft Pathology—201828; FSGS=Glomeruloesclerosi segmentària focal; IFTA=Fbrosi intersticial i atròfia tubular; Els resultats d'autoradiografia i histologia corresponents es presenten a la S1 suplementària.

Taula 2. Difuntsronyócaracterístiques del donant. *Malaltia cardiovascular definida com un esdeveniment cerebrovascular, infart de miocardi, malaltia vascular que requereix intervenció invasiva; **tal com ha indicat l'equip de contractació; Els resultats d'autoradiografia i histologia corresponents es presenten a la S2 suplementària; no hi ha donants amb diabetis mellitus.

Resultats

Cohort de mostra.

TretzeronyóLes mostres es van obtenir després de la transplantectomia, a una mitjana de 33 [IQR 9–66] mesos després del trasplantament, de receptors de trasplantament amb una edat mitjana de 51 [IQR 30–64] anys. Es va realitzar una trasplantectomia per al rebuig d'al·loempelt (Banf IIA i IIB) en set pacients, arteriopatia crònica d'al·loempelt en dos pacients, infecció per al·loempelt en dos pacients, un pacient sense funció primària i fbrosi intersticial i atròfia tubular de grau III en un pacient. Vuit de cada 13 pacients (61,5 per cent) tenien hiperparatiroïdisme, set (53,8 per cent) tenien hiperfosfatèmia, cinc (38,5 per cent) tenien diabetis mellitus i cap d'aquests pacients tenia signes denefrocalcinosien ecografia clínica o antecedents de càlculs renals (taula 1). Es van obtenir set mostres de ronyó de donants morts, de donants amb una edat mitjana de 65 anys [IQR 64–71] anys. Quatre de cada set (57,1 per cent) donants tenien antecedents de malaltia cardiovascular, cap tenia diabetis mellitus i sis de cada set (85,7 per cent) tenien aterosclerosi de la vasculatura renal a la inspecció visual, que són factors potencials per disminuir aquests donants.ronyons(Taula 2).

Figura 1. Imatge d'autorradiografia de la captació de [18F]-fluorur de sodi ([18F]-NaF) (A), amb la imatge superposada de l'absorció de [18F]-NaF amb tinció vermella d'alizarina de microcalcificacions (B) i tinció de von Kossa de calcificacions (C).

Autoradiografia i histologia.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 per cent en 5 (25 per cent) de 20 mostres (Fig. 1 i Fig. 2A) (S1 suplementari i S2 suplementari, que mostren l'autorradiografia i les imatges superposades per a totes les mostres). El nombre d'àrees [18F]-NaF va ser significativament més granronyómostres d'al·loempelt en comparació amb el donant mortronyómostres, amb una mediana de 7.0 [IQR 4.0–15.5] i 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], respectivament (p=0.019) (S3 suplementari).

Les microcalcificacions tubulointersticials, visualitzades amb tinció vermella d'alizarina, estaven presents en 19 de cada 20 mostres, amb una mitjana de 5,5 [IQR 2–1{0,3] per mostra, i es van observar microcalcificacions glomerulars en set 20 mostres, amb una mediana d'1 [IQR 1–3] per mostra (figura 2B). Es va observar un nombre significativament més gran de microcalcificacions en mostres d'al·loempelt de ronyó en comparació amb mostres de ronyó de donant mort, amb una mediana de 9.0 [IQR 5.0–20,5] i 4.0 [IQR 1.0–4.0], respectivament (p=0.046) (S3 suplementari). Amb la tinció de Von Kossa, es van observar calcificacions tubulointersticials en 18 de les 20 mostres, amb una mediana de 2,5 [IQR 1–5] per mostra, i es van observar calcificacions glomerulars en set de 20 mostres, amb una mediana d'1 [IQR 0–3] ] per mostra (Fig. 2C). El nombre de calcificacions no va ser significativament diferent entre ellsronyómostres d'al·loempelt i mostres de ronyó de donant mort, amb una mediana de 4.0 [IQR 2.0–6.0] i 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0], respectivament (p{=0.311) (S3 suplementari). La reproductibilitat interobservador es va identificar entre la detecció visual i semiautomàtica de calcificacions, amb un ICC de 0,94 (IC del 95% 0,85–0,98) per a la tinció vermella d'Alizarina i de 0,77 (IC del 95 per cent 0,42–0,91) per a la tinció de Von Kossa.

Les imatges superposades dels resultats d'autoradiografia i histologia van mostrar la co-localització de l'absorció de [18F]-NaF amb tinció vermella d'alizarina per a la microcalcificació (Fig. 1B). En comparació, les imatges superposades de la captació de [18F]-NaF i la tinció de Von Kossa de les calcificacions van mostrar captació en zones sense calcificacions provades per histologia (Fig. 1C). L'absorció de [18F]-NaF fals negatiu, ja que el percentatge d'àrees de (micro)calcificació provades per histologia fora de la superposició, va ser la mitjana del 0 per cent [IQR 0-25 per cent ] per a les àrees vermelles d'alizarina i mediana 100 per cent [65–100 per cent ] per a les àrees de Von Kossa. La tinció vermella d'alizarina de les microcalcificacions va demostrar una bona correlació amb la captació de [18F]-NaF (rho de Spearman de 0,81 (IC del 95 per cent 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 per cent d'absorció de [18F]-NaF (Fig. 4).

Figura 2. Imatge de superposició de la captació de fluorur de sodi [18F] ([18F]-NaF) i microcalcificacions (Alizarina vermella) (A), amb tinció vermella d'Alizarina per a microcalcificacions (B) i tinció de von Kossa per calcificacions (C).

Característiques del receptor en el moment de la transplantectomia.

No es van observar diferències entreronyómostres d'al·lograf de pacients amb (n{{0}}) o sense hiperfosfatèmia (n=6), pel nombre d'àrees [18F]-NaF (mediana 5.0 [IQR) 2.0–11,8] versus 7.0 [7.{0–23.0], p=0,170) , vermell d'alizarina (mediana 7,5 [IQR 5.0–14.0] versus 12.0 [3.0–34.0], p{{30}},390), i Von Kossa (mediana 5.0 [IQR 3,5–6,3] versus 3.0 [2.{ {59}}–5.0], pàg{=0.247). La comparació de mostres d'al·lograf renal de pacients amb (n=8) o sense (n=5) hiperparatiroïdisme no va mostrar diferències, pel nombre d'àrees [18F]-NaF (mediana 7.0). [IQR 4.0–7,5] versus 7,5 [4.0–23.{0], p{=0,459), vermell alizarina (mediana 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] versus 1{{1{03}}.0 [3,5–32,8], p{{76 }},769) i Von Kossa (mediana 4.0 [IQR 1,5–5.0] versus 4,5 [2.{0–6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). No es van identificar diferències significatives entre mostres d'al·lograf renal de pacients amb (n=5) o sense (n=8) diabetis mellitus, per al nombre d'àrees [18F]-NaF (mediana 5,5 [IQR 2,5–). 19,3] versus 7,0 [6,5–15,5], p=0,524), vermell alizarina (mediana 10,0 [IQR 5,5–24,8] enfront de 9,0 [4,0–8,5], p=0,833) i Von Kossa (mediana 3,0 [IQR 2,0–5,8] versus 4,0 [3,5–8,5], p=0,284). Durant el temps entre el trasplantament i la transplantectomia (mesos) no es van observar correlacions significatives amb el nombre d'àrees [18F]-NaF (p=0.586), vermell d'alizarina (p{=0.667) i Von. Kossa (pàg=0.459). Per a l'edat en el moment del trasplantament no es van observar correlacions significatives amb el nombre d'àrees [18F]-NaF (p{148}}.902), vermell d'alizarina (p=0.798) i Von Kossa (p. =0.334). De la mateixa manera, no es van observar correlacions significatives entre la durada del dial isis (mesos) desprésronyóFalla d'al·lograf i nombre d'àrees [18F]-NaF (p=0.481), vermell d'alizarina (p=0.565) i Von Kossa (p{=0}.174).

Figura 3. Correlació del nombre d'àrees de fluorur de sodi [18F] ([18F]-NaF) amb microcalcificacions tenyides de vermell d'Alizarina (A) i calcificacions tenyides de von Kossa (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>Superfície del traçador del 5 per cent de [18F]-fluorur de sodi ([18F]-NaF), per al nombre de microcalcificacions tacades de vermell d'Alizarina (A) i von Kossa, calcificacions tacades (B) (mitjana, rang interquartil).

Discussió

En aquest estudi de prova de concepte, l'absorció ex vivo de [18F]-NaF en humansronyóLes mostres de parènquima van demostrar una bona correlació amb les microcalcificacions provades per la histologia. L'absorció de [18F]-NaF es va correlacionar més fortament amb la tinció vermella d'Alizarina per a microcalcificacions actives en comparació amb la tinció de Von Kossa de calcificacions consolidades, cosa que suggereix un paper per a la imatge [18F]-NaF en la identificació de zones en fase inicial de nefrocalcinosi.

Les mostres presentades representen una combinació de casos de ronyons de donant i al·loempelts de ronyó explantats. Aquests dos tipus de mostres es diferencien pel que fa a la unió del traçador, amb més captació de [18F]-NaF observada en mostres d'al·loempelt de ronyó explantat. Això està en línia amb les publicacions anteriors, que informen d'un augment de les microcalcificacions després del trasplantament de ronyó5–7. L'associació denefrocalcinosiamb funció de l'empelt inferior en el moment de la biòpsia i un any després del trasplantament es reporta en dos estudis de biòpsia d'al·loempelt de ronyó, amb 258 i 149ronyóreceptors de trasplantament respectivament8,9. A més, en una cohort longitudinal amb 97 receptors de trasplantament de ronyó, es mostra una supervivència de l'empelt 1-any i 12-any significativament pitjor en pacients amb dipòsits d'oxalat de calci (és a dir, una supervivència de l'graf del 98,6 per cent enfront del 72,5 per cent). i 79,3 per cent enfront del 49,7 per cent, respectivament). En l'anàlisi de regressió logística multivariant, la presència de dipòsits d'oxalat de calci es va associar de manera independent amb la pèrdua d'graf, en un model que inclou, entre d'altres, creatinina en el moment de la biòpsia i tipus de donant4. El paper específic de les microcalcificacions en aquesta cascada deronyóLa disminució de la funció d'al·lograft no està clara. En l'entorn clínic previ al trasplantament, les deposicions de CaOx s'atribueixen a nivells elevats d'oxalat sèric, una molècula que no s'elimina de manera eficient durant la diàlisi4. Mentre que les deposicions de CaPhos s'observen amb més freqüència en pacients amb hiperparatiroïdisme i nivells elevats de calci sèric, a causa d'un metabolisme mineral desordenat abans i després del trasplantament5. No hem trobat diferències en els resultats d'histologia i autorradiografia per a la hiperfosfatèmia, hiperparatiroïdisme, diabetis mellitus, el temps entre el trasplantament i la trasplantectomia i la durada de la diàlisi després de la insuficiència de l'al·loempelt renal.

Per al desenvolupament de noves estratègies de tractament per a microcalcificacions activesnefrocalcinosi, la seva rellevància clínica pel que fa al fracàs (crònic) del trasplantament s'hauria d'entendre de manera més exhaustiva. Amb la identificació d'una població objectiu d'alt riscronyóreceptors de trasplantament, es poden dissenyar estudis clínics per explorar estratègies de tractament21. Un possible focus es podria trobar en la regulació positiva dels inhibidors endògens de la calcificació, amb un èmfasi específic en l'osteopontina3.

Donada l'alta incidència denefrocalcinosii la seva associació amb la funció d'al·loempelt renal, es garanteix una millor comprensió de l'etiologia de les microcalcificacions. Un enfocament diagnòstic no invasiu i fiable per identificar i quantificar les microcalcificacions en la nefrocalcinosi primerenca podria permetre estudis sobre l'impacte de la nefrocalcinosi en la funció del trasplantament renal. Les imatges de [18F]-NaF són d'interès, ja que la captació de [18F]-NaF en mostres vasculars humanes i animals s'incrementa a les zones de calcificació biològicament actives abans que aquestes àrees es puguin visualitzar mitjançant la tomografia microcomputada16,17,22. En estudis clínics recents de PET/TC, es va demostrar que la captació de [18F]-NaF està relacionada amb la progressió de la calcificació vascular, proporcionant evidència clínica de l'ús de [18F]-NaF per detectar àrees amb calcificació biològicament activa18–20. Les observacions d'aquest estudi estan en línia amb aquestes troballes anteriors en el camp de la imatge vascular. Es va demostrar una bona correlació entre la captació de [18F]-NaF i les microcalcificacions provades histologia, mentre que la correlació amb les calcificacions consolidades era clarament més feble.

Com s'ha dit, es va identificar la co-localització entre la captació de [18F]-NaF i les microcalcificacions positives de vermell d'alizarina, mentre que les àrees de captació de [18F]-NaF no es van co-localitzar amb la tinció de Von Kossa de calcificacions consolidades. Aquestes àrees calcificades, amb calcificacions consolidades i cap absorció corresponent de [18F]-NaF es podrien considerar àrees de calcificació inactiva, on no hi ha un procés de mineralització en curs, tal com va descriure anteriorment Irkle et al. en un estudi ex vivo de la calcificació caròtida16. Encara que només validat per a calcificacions vasculars i no perronyócalcificacions del parènquima, està recolzat per les propietats d'unió de [18F]-NaF a la superfície exterior de les calcificacions i la penetració limitada en les calcificacions sòlides. Per tant, la captació de [18F]-NaF serà més elevada en les microcalcificacions, amb una gran superfície, en comparació amb les microcalcificacions, amb un volum elevat però una superfície relativament petita13,16.

Aquest estudi de prova de concepte també té algunes limitacions. En primer lloc, inherent al disseny de l'estudi, els resultats representen un únic punt temporal, sense un seguiment clínic de la progressió de la calcificació. En segon lloc, aquest estudi de prova de concepte consisteix en un nombre relativament baix de mostres de ronyó, ja que la trasplantectomia després d'un fracàs tardà del trasplantament només es realitza per indicació clínica i la disponibilitat de donant rebutjat.ronyonsl'ús per a la investigació és limitat23. Per tant, s'hauria de considerar una anàlisi exhaustiva de l'etiologia de les deposicions de calci més enllà de l'àmbit d'aquest projecte. En tercer lloc, la traducció clínica dels resultats es veu obstaculitzada per la manca de coneixement sobre la distribució in vivo de [18F]-NaF als ronyons i l'efecte de l'eliminació del traçador renal, és a dir, una baixa activitat diana a fons podria limitar la visualització de les calcificacions. Per fer front a aquest problema, s'hauria d'avaluar el moment òptim de la imatge PET [18F]-NaF, és a dir, en quin [18F]-NaF s'excreta realment i l'activitat restant prové de la unió a zones calcificades. Possiblement, això es pot aconseguir amb imatges retardades de més de tres hores, tal com es realitza per a la valoració de calcificacions coronàries24. La reducció de la taxa de filtració glomerular que es troba en receptors de trasplantament podria provocar una fase d'excreció prolongada, que requeriria un període més llarg entre la injecció del traçador i la imatge PET, però les directrius actuals no indiquen una possible nefrotoxicitat del traçador [18F]-NaF11,25. Un pas potencial entre l'estudi de la prova de concepte que es presenta aquí i la imatge in vivo pot ser la imatge PET ex-vivo [18F]-NaF de ronyons perfusos normotèrmics o estudis en animals microPET [18F]-NaF in vivo26,27. En quart lloc, l'aplicació clínica d'aquesta tècnica es podria veure obstaculitzada pels costos de realitzar un procediment PET/TC [18F]-NaF i l'exposició a la radiació inherent. No obstant això, els nous sistemes de càmeres PET digitals amb una sensibilitat més alta poden reduir tots dos, a causa del menor temps d'escaneig i una menor dosi d'activitat injectada.

La força d'aquest estudi de prova de concepte rau en la comparació detallada d'un a un de les microcalcificacions identificades per autorradiografia i histologia [18F]-NaF. L'absorció de Te [18F]-NaF en diferents mostres es va poder comparar sense necessitat d'ajustaments addicionals, ja que totes les mostres es van incubar a la mateixa solució [18F]-NaF. A més, aquest estudi proporciona les primeres dades que mostren una coincidència visual i estadística entre la captació de [18F]-NaF i les microcalcificacions provades per histologia en mostres de ronyó.

Cistanche-funció renal

Per concloure, proporcionem les primeres dades per a l'ús de [18F]-NaF en un estudi d'autorradiografia per identificar microcalcificacions en actius.nefrocalcinosidesprésronyótrasplantament. Aquest estudi de prova de concepte ex-vivo [18F]-NaF és el primer pas cap a l'aplicació potencial de la PET/TC clínica [18F]-NaF en receptors de trasplantament renal.

Mètodes

Humansronyómostres.

El teixit renal es va obtenir després d'una trasplantectomia (n=13) i de ronyons rebutjats de donants morts (n=7) en cas de disminució del ronyó del donant pels centres de trasplantaments afiliats. Les dades clíniques dels receptors i donants de trasplantament de ronyó es van recuperar de la història clínica dels pacients, inclosa la presència d'hiperparatiroïdisme, hiperfosfatèmia i diabetis mellitus abans de la trasplantectomia i l'avaluació de la patologia clínica de les mostres d'al·lograft de ronyó informades mitjançant la classificació Banf de patologia d'al·lograft renal28. Les activitats de recerca es van dur a terme d'acord amb la declaració dels principis ètics d'Hèlsinki per a la investigació mèdica amb subjectes humans i el comitè de revisió institucional va aprovar aquest estudi (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Es va obtenir el consentiment informat de tots els receptors de trasplantament i es va donar l'aprovació prèvia a la donació per a l'ús de ronyons rebutjats de donants morts amb finalitats d'investigació. Les activitats clíniques i de recerca eren coherents amb els Principis de la Declaració d'Istanbul tal com es descriu a la "Declaració d'Istanbul sobre el tràfic d'òrgans i el turisme de trasplantaments".

El procediment operatiu estàndard (SOP) per a la presa de mostres de teixit va ser el següent: Les mostres es van obtenir a la sala quirúrgica, immediatament després de l'extracció del ronyó (per a la trasplantectomia) o a l'arribada del donant descartat.ronyóal nostre centre de trasplantaments. Les mostres utilitzades per a aquest experiment es van prendre en el pla transversal del pol superior, incloent teixit renal cortical i medul·lar, amb una mida entre 25 mm × 15 mm i 20 mm × 40 mm. Aquestes mostres es van fixar amb formalina i es van incrustar en parafina. Utilitzant un instrument de tall de precisió de micròtom, es van fer seccions incrustades en parafina de tres µm. Aquestes seccions es van muntar sobre vidre de microscopi d'adhesió (TOMO, Matsunami Glass, EUA). Seccions en sèrie, és a dir, seccions adjacents que revelen capes seqüencials de laronyómostres de teixit, es van utilitzar per autorradiografia i anàlisi histològic. Abans de la incubació del traçador i la tinció histològica, les seccions es van desparafnitzar, es van rehidratar en aigua desmineralitzada i es van emmagatzemar temporalment en solució salina tamponada amb fosfat (PBS).

[18F]-NaF incubació i autorradiografia.

L'experiment ex vivo es va basar en el protocol utilitzat en els estudis anteriors de Hop et al. i Reijrink et al.22,29. El primer estudi és un estudi d'autorradiografia sobre la captació de [18F]-NaF a les plaques caròtides de pacients amb ictus sotmesos a cirurgia, amb una indicació de calcificació basada en TC com a comparació. El segon estudi és un estudi d'autoradiografia sobre la captació de [18F]-FDG en mostres de teixit adipós, amb immunohistoquímica de seccions en sèrie com a comparació. Una de cada tres seccions en sèrie es va banyar en una solució de [18F]-NaF, a una concentració de 618 mil·libecquerel (MBq) en 300 ml de PBS, a temperatura ambient, durant 30 min. El rentat es va realitzar esbandint tres vegades amb PBS fred i dues vegades amb aigua freda. Les mostres es van assecar a l'aire lliure i es va col·locar una pantalla de fòsfor en blanc sobre les mostres. L'exposició es va realitzar durant la nit, durant un període de 24 h i 30 min. La determinació de la distribució i la intensitat de l'activitat dels teixits es va realitzar en una pantalla de fòsfor mitjançant l'Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, EUA).

Coloració vermella d'alizarina i von Kossa.

Es va realitzar una tinció vermella d'alizarina per visualitzar l'acumulació de calci en la calcificació en fase inicial. Les mostres es van incubar en una solució de vermell d'alizarina al 2% p/v (dissolt en aigua desmineralitzada), pH 4,2 durant 5 minuts30. El rentat es va realitzar amb un esbandida 20 vegades en acetona/xilè 1:1 i 20 vegades amb un esbandit 100 per cent de xilè. Es va realitzar una tinció de Von Kossa per visualitzar la presència de molècules de fosfat inorgànic en calcificacions consolidades. Breument, les mostres es van incubar en una solució de nitrat de plata (AgNO3) a l'1 per cent durant 1 h, mentre estaven exposades a la llum solar30. Alternat amb esbandida tres vegades en aigua desmineralitzada, es va realitzar la incubació amb tiosulfat de sodi durant 5 minuts, seguida de la incubació en vermell ràpid nuclear durant 3 minuts.

Tractament i anàlisi d'imatges.

Les seccions de teixit tenyits es van digitalitzar amb Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japó) i les imatges es van inspeccionar mitjançant la versió 12.1 del programari Aperio ImageScope.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Alemanya). Es van realitzar autorradiografia i anàlisis quantitatives d'imatges informatitzades amb el programari ImageJ, versió 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Es va aplicar la resta de fons per a totes les imatges d'histologia, inserint un contorn a la vora de la mostra d'histologia. La detecció semiautomàtica de calcificacions en la tinció de vermell d'Alizarina i Von Kossa es va realitzar amb ImageJ-BioVoxxel Toolbox31. Es van aplicar llindars per a totes les mostres i es van dilatar les àrees de calcificació detectades amb 6 iteracions, per optimitzar la visualització. Per a les imatges d'autorradiografia, es va realitzar la rotació i el redimensionament a partir de les mostres histològiques originals. Es van aplicar llindars per a totes les mostres, donant lloc a àrees d'absorció de traçadors, seguint l'enfocament descrit per Irkle et al.: les imatges es van llindar mitjançant el mètode Otsu, seguit de desenfocament i llindar gaussià amb el mètode Li16. Les imatges superposades es van adquirir fent coincidir els contorns de les imatges histològiques adjacents, amb la consegüent concordança dels resultats d'histologia i autorradiografia (Fig. 1). La quantificació basada en píxels de la calcificació i l'àrea del traçador (com a percentatge de l'àrea de mostra) es va realitzar amb l'eina ImageJ-Analyze Particles.

Símptomes de la malaltia renal de Cistanche

Anàlisis estadístics.

Les estadístiques es van realitzar amb el paquet estadístic per a les ciències socials versió 23 (IBM Corporation, Armonk NY, EUA), els gràfics es van fer amb GraphPad Prism 7.02 per a Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, EUA) i les figures es van produir amb Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, EUA). Els resultats es van presentar com la mitjana i el rang interquartil (IQR) per a dades esbiaixades, i com a freqüència i percentatge quan les dades eren categòriques. Hem comparat grups mitjançant les proves U de Mann-Whitney (valor p de dues cues<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Disponibilitat de dades

Donant mort de ronyó ironyóLes imatges d'autorradiografia del receptor de trasplantament de la captació de fluorur de sodi [18F] ([18F]-NaF), amb les imatges superposades de la captació de [18F]-NaF amb tinció vermella d'alizarina de microcalcificacions i tinció de Von Kossa de calcificacions estan disponibles en línia com a informació suplementària. Totes les dades addicionals estaran disponibles a petició, d'acord amb la normativa de l'IRB del Centre Mèdic Universitari de Groningen.

Referències

1. Gwinner, W. et al. Calcificació precoç d'al·loempelts renals detectats per biòpsies de protocol: causes i implicacions clíniques. Am. J. Trasplantament. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Què ésnefrocalcinosi?. Ronyó Int. 88, 35–43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM i Giachelli, CM L'osteopontina protegeix contra un alt nivell de fosfat induïtnefrocalcinosii calcificació vascular. Ronyó Int. 89, 1027–1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR i Pacheco-Silva, A. The early presence of calcium oxalate deposition inronyóLes biòpsies d'empelt s'associen amb una mala supervivència de l'empelt a llarg termini. Am. J. Trasplantament. 5, 323–329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. Localització, etiologia i impacte dels dipòsits de fosfat càlcic en al·loempelts renals. Am. J. Trasplantament. 9, 2470–2478 (2009).

6. Nankivell, BJ et al. La història natural de la nefropatia d'al·lograft crònica. N. Anglès. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. Factors de risc per a la nefropatia d'al·lograft crònica després del trasplantament renal: un estudi de biòpsia de protocol. Kidney Int.67, 341–348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Dipòsits d'oxalat en biòpsies de ronyons natius i trasplantats, i impacte en la funció de l'empelt. Nefrol. Marqueu. Trasplantament. 24, 1319–1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI La deposició d'oxalat en biòpsies d'al·loempelt renal dins dels 3 mesos posteriors al trasplantament s'associa amb una disfunció de l'al·loempelt. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA i Pol, RA Hem oblidat la imatge abans i després del trasplantament de ronyó?. Eur. Radiol. 28, 3263–3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: Directrius de procediment EANM per a la imatge òssia. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imatge 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR et al. Captació de fluorur de sodi 18F a l'artèria coronària. Melmelada. Coll. Cardiol. 59, 1539–1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. La captació de fluorur de sodi 18F és un marcador de calcificació activa i progressió de la malaltia en pacients amb estenosi aòrtica. Circ. Cardiovasc. Imatge 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. et al. Viabilitat de PET/TC de fluorur de sodi 18F per a la imatge de la placa ateroscleròtica. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM i Schurgers, LJ Identificació d'objectius per al diagnòstic i intervenció de plaques ateroscleròtiques vulnerables més enllà de la imatge per tomografia d'emissió de positrons de 18F-fluorodesoxiglucosa: traçadors prometedors a l'horitzó. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imatge 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Identificació de la microcalcificació vascular activa mitjançant tomografia d'emissió de positrons amb fluorur de sodi 18F. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD et al. 18 L'amplificació del senyal de fluor F identifica les microcalcificacions associades a la inestabilitat de la placa ateroscleròtica a les imatges de tomografia per emissió de positrons/tomografia computada. Circ. Cardiovasc. Imatge 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM et al. Absorció vascular en tomografia per emissió de positrons amb fluorur de sodi 18F: precursor de la calcificació vascular? J. Nucl. Cardiol. (2020).

19. Derlin, T. et al. Correlació de la inflamació avaluada per 18F-FDG PET, deposició mineral activa avaluada per 18F-fluorur PET i calcificació vascular a la placa ateroscleròtica: un estudi PET/TC de doble traçador. J. Nucl. Med. 52, 1020–1027 (2011).

20. Kitagawa, T. et al. Valor predictiu de la tomografia per emissió de positrons amb fluorur de sodi 18F en la detecció de malaltia de l'artèria coronària d'alt risc en combinació amb la tomografia computada. Melmelada. Cor Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. et al. Inhibidors endògens de la calcificació en la prevenció de la calcificació vascular: una declaració de consens de l'acció COST EuroSofCalcNet. Davant. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. La tomografia d'emissió de positrons amb fluorur de sodi 18F va avaluar les microcalcificacions en plaques caròtides humanes culpables i no culpables. J. Nucl. Cardiol. 26, 1064–1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA i Gill, JS Nefrectomia després del fracàs del trasplantament: pràctica i resultats actuals. Am. J. Trasplantament. 7, 1961–1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. Les imatges amb retard de tres hores milloren l'avaluació del PET coronari de fluorur de sodi 18F. J. Nucl. Med. 60, 530–535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Document de posició del Comitè Cardiovascular de l'Associació Europea de Medicina Nuclear (EANM) sobre imatges PET de l'aterosclerosi. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imatge 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. Ronyons de porcs DCD analitzats per ressonància magnètica per avaluar ex vivo la seva viabilitat. Trasplantament 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. et al. Infusió de cèl·lules estromals mesenquimàtiques en porcíronyonsdurant la perfusió de la màquina normotèrmica: els MSC intactes es poden localitzar i localitzar als glomèruls. Int. J. Mol. Ciència. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. Una guia de referència de 2018 per a la classificació Banf de la patologia d'al·loempelt renal. Trasplantament 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. [18F] La captació de FDG al teixit adipós no està relacionada amb la inflamació de la diabetis mellitus tipus 2. Mol. Imatge Biol.23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. et al. La calcificació vascular i la fbrosi aòrtica tenen un paper bifuncional per a l'osteopontina en l'arteriosclerosi diabètica. Arter. TrombVascBiol 31, 1821–1833 (2011).

31. Brocher, J. Avaluació qualitativa i quantitativa de dos nous algorismes de binarització limitants d'histogrames. Int. J. Procés de la imatge. 8, 30–48 (2014).

Agraïments

Aquest projecte de recerca compta amb el suport d'una subvenció de la Fundació De Cock-Hadders (codi de projecte 2018-03).

Aportacions de l'autor

SB va contribuir al disseny, adquisició i anàlisi, i va redactar el manuscrit. IFA, MR i MLCB van contribuir al disseny, adquisició i anàlisi, i van revisar substancialment el manuscrit. SPB, CM i MHdB van contribuir a la concepció i van revisar substancialment el manuscrit. JLH, RHJAS i RAP van contribuir a la concepció, disseny i anàlisi, i van revisar substancialment el manuscrit.

Interessos competitius

Els autors no declaren interessos en competència.