Estudi sobre la funció neuroendocrina-immune de Cistanche Deserticola i els seus productes de vapor d'arròs en el model de rata induït per glucocorticoides-Ⅰ

1. Introducció

Cistanche deserticola, que s'anomena "ginseng del desert", és una medicina tradicional xinesa que s'ha utilitzat durant segles com a herba yang-tònica pervigoritzant el ronyó i enfortint el yang[1]. Vuit espècies i una variacióCistanche Herba s'han enregistrat a la Xina i nomésCistanche deserticolaYC Ma iCistanche tubulosa(Schenk) Wight estan registrats a la farmacopea xinesa [2]. Els estudis farmacològics ho van demostrarCistanches Herbava mostrar neuroprotector [3], immunomodulador [4], cardioprotector [5], antifatiga [6], antiinflamatori [7], hepatoprotector [8], antioxidant [9], antibacterià [10], laxant [11] i antitumoral. efectes [12]. L'ampliL'espectre d'activitats biològiques reportades d'aquest gènere s'ha atribuït a la seva complexa i variada composició fitoquímica.Cistanche deserticolaconté glicòsids de feniletanol, iridoides, polisacàrids [13], etc. El contingut de glicòsids de feniletanol és el més alt dels materials medicinals originals [14].

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A dinamitzar l'PHGS RENÓL 75% ECH 30% ACT 12%

El processament de la matèria mèdica xinesa (CMM) és una tècnica farmacèutica tradicional per complir els diferents requisits per tractar, dispensar i fer preparats segons la teoria de la medicina tradicional xinesa. Aquests productes processats s'anomenen peces de decocció, que s'utilitzen a les clíniques. El processament té com a objectiu millorar l'eficàcia per reduir la toxicitat dels fàrmacs bruts. La farmacopea xinesa de 2015 va registrar que les rodanxes gruixudes de Cistanche (CD) i el Cistanche al vapor d'arròs (WCD) es podrien utilitzar com a peces de decocció a la clínica. El nostre grup d'investigació va demostrar que l'efecte laxant es va alleujar i que els efectes antienvelliment i estimulants del yang del ronyó es van millorar després que Cistanche es cuit al vapor amb vi d'arròs [15].

La funció de l'eix hipotàlem-hipòfisi-glàndula suprarenal-timus (HPAT) està alterada en la síndrome de deficiència de ronyó-yang [16]. Els pacients amb deficiència de yang del ronyó també tenen una disfunció immune extensa. La disfunció de l'eix HPA està estretament relacionada amb la immunodeficiència. La teoria de la xarxa neuroendocrina-immune (NEI) mostra que els sistemes immunitari i neuroendocrí comparteixen molts lligands i receptors [17], i l'hipotàlem es considera el pivot per enllaçar el neuroendocrí amb els sistemes immunitaris.

En aquest estudi, vam replicar la deficiència de ronyó-yang en rates model amb injecció de corticoides exògens i vam explorar el mecanisme de la deficiència de ronyó-yang en resposta a diferents productes processats de Cistanche deserticola des de la perspectiva de la funció endocrina-immune.

2. Materials i Mètodes

2.1. Materials i reactius

Cistanche deserticola es va recollir d'Alashan Neimenggu el 2019.5 i es va identificar com les tiges carnoses seques de Cistanche deserticola YC Ma pel professor Yanjun Zhai (Escola de Farmàcia, Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Liaoning, Xina). Els exemplars de val es van conservar al Centre Tecnològic d'Enginyeria de Processament de Liaoning.

Els compostos estàndard d'ajugol es van comprar a Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Xina); cistanòsid F,equinacòsid, cistanòsid A i isoacteòsides van comprar a Must Company (Sichuan Xina); L'acteòsid es va comprar a Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Xina). L'acetonitril i el metanol de grau MS es van comprar a Merck KGaA (Darmstadt, Alemanya). L'àcid fòrmic de grau HPLC es va comprar a Merck KGaA (Darmstadt, Alemanya). El vi d'arròs es va comprar a Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Xina).

Corticosterona (CAS: 50-22-6, puresa > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pastilles de chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rata ACTH, CRH, T, IL{{ Els kits de detecció ELISA 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 i IL{-10 es van comprar a Nanjing Jiancheng Co., Ltd. El kit ELISA de cortisol de rata va ser proporcionat per BOSK Co., Anticòs CD4 de rata, anticòs CD8a (núms. 561833 i 559976), lisat de RBC (Solarbio, R1010), solució tampó PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), cebadors CaM i -actina aigües amunt i aigües avall van ser proporcionats pel kit de transcripció inversa de Guangzhou Invitrogen Co. (núm. RR037A) i el kit de síntesi d'ADNc (núm. 10000068167) van ser proporcionats per Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Cloroform, isopropanol, etanol al 75% i uretà La solució eren totes analíticament pures i produïdes per Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. L'aigua ultrapura va ser produïda pel sistema Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, EUA).

2.2. Instruments experimentals

Un marcador enzimàtic (Thermo, model 3530911931), rentadora automàtica de plaques (model HBS- 4009), mesurador de força d'empunyeu i tracció de pantalla digital (model VICTOR- 50N), centrífuga de congelació d'alta velocitat (model Sigma 3k15). ), espectrofotòmetre ultramicro (model B-50Q), amplificador de gens (model L96G), PCR quantitativa de fluorescència en temps real (model StepOne), citòmetre de flux (model AC66051710132), micròtom de parafina (model Laika), microscopi (Olympus , model BS-53) i un instrument d'aigua pura (model F7JA36507).

2.3. Preparació de mostres per a UPLC-Q-TOF-MS i experiments farmacològics

WCD es va processar a partir del mateix lot deCistanche deserticolaal nostre laboratori. Per a la preparació de WCD, es van infusionar peces de CD secs (5 mm de gruix) (100 g) amb vi d'arròs (30 ml), es van cuinar al vapor a alta pressió (1,25 kPa) durant 4 h i després es van assecar a 55 graus.

Les pols gruixudes de CD i WCD es van remullar en 1 0 vegades etanol al 95% durant 0,5 h, es van extreure a reflux 3 vegades cada vegada durant 1 h i es van filtrar, i els filtrats es van combinar 3 vegades. L'etanol es va recuperar a pressió reduïda i es va obtenir l'extracte per a l'administració. L'extracte (1 mL) es va afegir al 50% de metanol, portant el volum total a 20 mL, i es va emmagatzemar a 4 graus per a l'anàlisi del contingut.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Condicions UPLC-QqQ-MS per a l'anàlisi d'extractes de CD i WCD

2.4.1. Condicions analítiques LCThMS

Es va utilitzar el sistema UPLC-MSThMS amb el programari MassLynx 4.1 Analyst per dur a terme l'adquisició i el processament de dades. La columna analítica era un Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a una temperatura de 4{0 graus C. La fase mòbil era 0, 1% de solució aquosa d'àcid fòrmic (A) i acetonitril que contenia 0,1% d'àcid fòrmic (B). El gradient d'elució va ser de 0,00-1,00 min amb un 3% de B, 1,01–2,00 min amb un 3%–11,5% de B, 2,01–3.{{29 }} min amb un 12% de B, 3,01–4.00 min amb un 15% de B, 4,01–5.00 min amb un 20% de B, 5,01–6.00 min amb 22 % B, 6,01–8.00 min amb un 25% de B, i 8,01–9.00 min amb un 10% de B. El cabal era de 0,3 mLTh min, i el volum d'injecció era d'1,0 μL.

Es va utilitzar l'espectròmetre de masses triple quàdruple Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, EUA) equipat amb una font d'ionització per electrospray (ESI) en el mode d'ions negatius. El gas de desolvació era nitrogen amb un cabal de 500 LThh a una temperatura de 250 graus. Tots els compostos detectats es van mesurar en el mode de monitorització de reaccions múltiples (MRM); La taula 1 mostra els paràmetres d'energia, i la taula 2 mostra les corbes de calibratge dels components analitzats.

2.4.2. Preparació de substàncies de referència

Tubulòsid A (3,02 mg), equinacòsid (3,00 mg), 2′-acetilacteòsid (2,34 mg), acteòsid (2,45 mg), isoacteòsid (0,61 mg), cistanòsid F ( 2,14 mg), salidroside (3,39 mg), àcid genipòdic (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) i catalpol (2,39 mg) es van dissoldre en metanol per preparar una solució de reserva. La solució de reserva es va diluir amb metanol per obtenir les concentracions adequades per a les solucions estàndard de treball. Totes les solucions preparades es van emmagatzemar a 4 graus abans del seu ús.

2.5. Preparació i Agrupació de Models Animals

Es van comprar rates mascles SD (180-220 g) a Liaoning Changsheng Biotechnological Co., número de permís d'animals: SCXK (Liao) 2015-0001. Totes les rates es van mantenir amb accés lliure al menjar i l'aigua a 25 graus i una humitat relativa del 30 al 50%. Els animals es van allotjar durant 7 dies abans dels experiments.

Cent rates es van dividir aleatòriament en 10 grups: grup control en blanc (BC), grup control model (MC), grup control positiu (PC), grup control vi d'arròs (WC), CD amb dosis altes (CD). -HD), grup CD de dosis mitjana (CD-MD), grup de CD de dosis baixa (CD-LD), grup de dosis altes de WCD (WCD-HD), grup de dosis mitjana de WCD (WCD-MD) i Grup de dosis baixes de WCD (WCD-LD). Les dosis de CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD i CD-LDThWCD-LD van ser de 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) i 1,37 gTh (kg ∙ d), respectivament. La dosi per al grup PC va ser d'1,646 gTh (kg ∙ d) i per al grup WC, 1 mLTh100 g durant 40 dies. El sisè dia després de l'administració, es va injectar a les rates per via subcutània la suspensió d'aigua de corticosterona (corticosterona + 0,1% dimetilsulfòxid + 0,1% Tween{-80 + 0,9% de clorur de sodi) excepte per al grup BC [18]. La concentració de corticosterona era de 5 gThL i la dosi era de 0,1 mLTh100 g. Les rates del grup BC van rebre solució salina normal + 0,1% dimetilsulfòxid + 0,1% Tween- 80 + 0,9% de clorur de sodi per injecció a la mateixa dosi.

2.6. Determinació de les funcions de l'eix HPA

2.6.1. Prova de pes, temperatura i potència de retenció

Es va realitzar una prova de pes cada 3 dies i es va prendre la temperatura cada 6 dies. durant l'experiment. El dia 39, la força màxima de l'extremitat posterior es va mesurar amb un mesurador d'adherència. Les rates es van col·locar en plataformes llises, fent que la seva extremitat posterior agafi el pal. Les rates agafaran instintivament qualsevol objecte per evitar que es mogui cap enrere quan s'estira la cua fins que la força de tracció superi l'adherència. Quan la rata va perdre l'adherència, el preamplificador podria registrar automàticament la força màxima d'adherència.

2.6.2. Determinació del nivell de T, CRH, ACTH, CORT i cortisol en sèrum

Una hora després de l'última administració, les rates van ser anestesiades mitjançant injecció intraperitoneal d'una solució d'uretà (20 gTh100 ml). A continuació, es van recollir mostres de sang, es van centrifugar a 3500 r durant 15 min per obtenir el sèrum i es van emmagatzemar a -20 graus. Les concentracions de T, CRH, ACTH, CORT i cortisol es van mesurar amb kits ELISA de rata segons les instruccions del fabricant.

2.6.3. Observacions al microscopi

L'estructura morfològica del teixit de la glàndula suprarenal es va observar mitjançant la tinció d'HE. El teixit suprarenal es va fixar en paraformaldehid al 10%, es va deshidratar en etanol, es va fer transparent amb una solució de xilè, incrustat per mètodes convencionals, es va tallar a rodanxes de 4 μm de gruix, es va desparafinar amb solució de xilè, es va hidratar amb el gradient d'etanol i després es va tenyir amb hematoxilina i eosina. solució de tinció. Després de fer-se transparent amb xilè, la placa es va segellar amb goma neutra i es va observar al microscopi.

2.6.4. Tinció immunohistoquímica de l'expressió de proteïnes Bax, Bcl-2, caspasa{-3, Fas i FasL a la glàndula suprarenal

Les seccions suprarenals de rata fixades amb formalina i incrustades en parafina es van desparafinar i es van rehidratar després de tallar-les amb un gruix de 4 μm. Per al bloqueig de l'activitat de la peroxidasa endògena, les seccions es van preincubar en un bloc de peròxid d'hidrogen durant 1 0 min. Les seccions es van submergir en citrat 0,01 M (pH 6,0) i es van escalfar fins a ebullició. El procés es va repetir després de 5-10 minuts. Després de refredar-se, les seccions es van rentar amb PBS (pH 7,2-7,6) 1-2 vegades, es van deixar a temperatura ambient durant aproximadament 5 minuts i es van rentar amb PBS (pH 7,2-7,6) 2-3 vegades. La solució de bloqueig de BSA al 5% es va afegir a temperatura ambient i l'excés de líquid de la secció es va treure 20 minuts més tard. Es van afegir anticossos primaris diluïts específics per FasTh FasL, Bcl-2ThBax-3 (1:100 diluït amb PBS) i es van incubar a 37 graus durant 1 hora o 4 graus durant la nit. Les seccions es van rentar 2-3 vegades amb PBS (pH 7,2-7,6). A continuació, es va afegir IgG anti-ratolí de cabra biotinilada i les seccions es van assecar a 20-37 graus durant 20 min i es van rentar amb PBS (pH 7,2-7,6) 4 vegades durant 5 min. Després d'un rentat a fons en PBS, les seccions es van incubar amb una barreja de reactius A i B durant 30 min, es van incubar amb PBS durant 45 min i, finalment, es van desenvolupar amb substrat DAB (DAKO) durant 30 min abans de ser lleugerament contrastades amb hematoxilina, deshidratades, i muntat.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A MILLORAR LES SENSACIONS SEXUALS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Determinació de les funcions immunitàries

2.7.1. Càlcul de l'índex d'òrgans immunitaris

Una hora després de l'última administració, les rates van ser anestesiades mitjançant injecció intraperitoneal de solució d'uretà (20 gTh100 mL), i després es van retirar la melsa i la glàndula tim i es van pesar immediatament en una caputxa estèril. Els coeficients de pes de la melsa o del tim (%) � pes de la melsa o del tim (mg) Pes corporal (g).

2.7.2. Detecció de subconjunts de limfòcits T en sang perifèrica

Els esplenòcits i hemòcits es van incubar amb els anticossos monoclonals anti-CD4 (PE) i anti-CD8 (FITC) durant 30 min a la foscor. Es van afegir 2 ml de lisat d'eritròcits i la solució es va barrejar mitjançant vòrtex. La solució es va deixar a la foscor durant 10 minuts i es va centrifugar durant 5 minuts. El sobrenedant es va descartar i, a continuació, la solució es va rentar 3 vegades amb PBS fred amb gel i es va tornar a suspendre en una solució permeabilitzant de PBS. Es van analitzar almenys 10,000 cèl·lules mitjançant citometria de flux dins d'1 h de cada tinció de Mab.

2.7.3. Determinació del nivell d'IL-10, IL-6, IL{-2, TNF- i IFN-c al sèrum

Una hora després de l'última administració, les rates van ser anestesiades mitjançant injecció intraperitoneal de solució d'uretà (20 gTh100 ml) i es va prendre sang de l'aorta abdominal. La sang es va centrifugar a 3500 r durant 15 min per obtenir el sèrum i es va emmagatzemar a -20 graus. Les concentracions d'IL-10, IL-6, IL-2, TNF- i IFN-c es van detectar amb kits ELISA de rata segons les instruccions del fabricant.

2.8. Expressió de CaM en teixits d'hipotàlem i hipòfisi

L'ARN total es va extreure dels teixits de l'hipotàlem i la hipòfisi mitjançant TRIzol. La transcripció inversa es va dur a terme en 10 μL d'ARN total segons les instruccions del fabricant. Es van analitzar quantitats iguals d'ADNc mitjançant qPCR en presència de colorant d'unió a dsDNA (Promega, EUA) i el sistema de PCR en temps real CFX 96 (Bio-Rad, EUA) per observar els diferents gens en les condicions d'activació inicial a 95 graus durant 10 min, 40 cicles de desnaturalització a 95 graus durant 15 s i extensió de recuit a 60 graus durant 1 min.

Els cebadors per a CaM i -actina es mostren a la taula 1, i l'actina es va utilitzar com a control intern. Cada mostra es va normalitzar utilitzant la diferència de llindars crítics (Ct) entre el gen objectiu i l'actina. Es va utilitzar l'equació següent per descriure el resultat: ΔΔCt � (gen objectiu Ct − gen Ct -actina) grup experimental − (gen objectiu Ct − gen Ct -actina) grup control. A continuació, es van comparar els nivells d'ARNm de cada mostra, utilitzant el gen objectiu d'expressió 2- ΔΔCt. Es va fer la mitjana dels resultats de cada grup (taula 3).

2.9. Anàlisi estadística

Totes les dades es van analitzar mitjançant el programari SPSS (versió 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Les diferències entre grups es van analitzar amb l'anàlisi de variància unidireccional de mesures repetides (ANOVA). Els resultats es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (SD) mitjançant el programari GraphPad Prism (versió 6.0, San Diego, CA, EUA). Les diferències amb un valor P inferior a 0,05 es van considerar estadísticament significatives.

3. Resultats experimentals

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalysis

Per aconseguir la millor separació, la forma del pic i un temps d'anàlisi curt, en el nostre experiment preliminar es van estudiar les condicions cromatogràfiques, inclosa la columna, la fase mòbil i el programa de gradient. Els cromatogrames típics amb mode MRM es presenten a la figura 1.

A la taula 4, podem veure que el contingut de glicòsids feniletanoides en WCD va augmentar en comparació amb els de CD, especialment per a l'equinacòsid i l'acteòsid, mentre que el contingut d'iridoides va disminuir en el WCD.

3.2. Regulació per a la funció de l'eix HPA

3.2.1. Prova de pes, temperatura i potència de retenció

Les rates del grup MC i dels grups experimentals van mostrar símptomes de deficiència renal-yang gradualment després de rebre corticosterona. Els símptomes, com ara pèrdua de pes, hipotèrmia, pèrdua de brillantor del cabell, esperit caigut, retard en la resposta i una disminució significativa del consum i l'activitat d'aigua, van millorar molt en els grups CD i WCD. La figura 2 (a) mostra els canvis de pes. El pes de cadascun dels grups de drogues va augmentar, especialment en els grups CDHD i WCD-HD. L'augment de pes en el grup MC va ser el més baix. La figura 2 (b) mostra els canvis de temperatura, que van ser els més baixos del grup MC, i la temperatura va augmentar als grups WCD-HD, WCD-MD i WCD-LD.

La figura 2 (c) mostra que el poder de retenció va augmentar per al grup BC i cadascun dels grups experimentals, i el grup WCD-MD va ser el més alt, cosa que va demostrar que els signes de debilitat induït per la deficiència de ronyó-yang van millorar després de l'administració.

3.2.2. Nivells de T, CRH, ACTH, CORT i cortisol

La figura 3 mostra que, en comparació amb els del grup BC, el nivell de T, CRH, ACTH i CORT al sèrum de rata va disminuir (P <0.01) i el nivell de cortisol va disminuir (P). < 0.05) al grup de MC. En comparació amb els del grup MC, el nivell de T en els grups WCD-HD i WCD-MD va augmentar (P <0.{01), el nivell de CRH en el WCD-LD, Els grups WCD-MD i WC van millorar (P <0,01), el contingut d'ACTH va augmentar als grups CD-HD, WCD-MD i WCD-HD (P <0,01), el nivell de CORT es va millorar en el Els grups CD-MD, WCD-MD i WCD-HD (P <0, 01) i millorats en els grups CDHD i WCD-LD (P < 0, 05), i el nivell de cortisol va augmentar en cadascun dels grups de fàrmacs.

3.2.3. Resultats de l'observació al microscopi

El teixit de la glàndula suprarenal es pot dividir en la capa cortical i la capa medul·lar. Les capes corticals inclouen capes globulars, feixos i reticulars. Les cèl·lules contenen més lípids i la capa medul·lar està formada principalment per cèl·lules de feocromocitoma i una petita quantitat de teixit fibrós. Com es mostra a la figura 4, vam trobar que tot era normal al grup BC, mentre que al grup MC, l'escorça suprarenal tenia una hiperplàsia evident, atròfia cel·lular i una densitat creixent. La tira bulbosa es va engrossir i la zona fascicular translúcida, la zona reticular estreta i les cèl·lules més petites van mostrar un color desigual i una congestió capil·lar. Al grup de PC, els límits corticals i medul·lars eren visibles. Les cèl·lules de les bandes globulars i del paquet estaven disposades uniformement i l'estructura morfològica s'havia restaurat. Es va observar la mateixa millor restauració en els grups WCD, i els efectes en el grup WCD-MD van ser millors que els dels grups WCD-HD i WCD-LD. La morfologia de la glàndula suprarenal en els grups CD no era tan bona com la dels grups WCD.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%