Stx2 indueix l'expressió gènica diferencial i pertorba els gens del ritme circadià al túbul proximal Ⅱ

3. Discussió

3.1. La patologia tubular proximal en pacients STEC i models animals

Oligúria n'és un signenecrosi tubular aguda(ATN). A causa de l'ATN, les cèl·lules epitelials esborrades obstrueixen el lumen dels túbuls per reduir el flux de líquid que apareix com oligúria. En pacients amb STEC, l'oligúria i l'anúria solen ser troballes que suggereixen ATN. La reducció de la funció del túbul proximal durant les etapes anteriors de la malaltia infecciosa STEC s'ha demostrat com a augments de 2MG i NAG urinaris [3,33]. B2MG és una proteïna petita de 12 kDa que es filtra lliurement a través dels glomèruls i s'absorbeix completament pels túbuls proximals en un estat saludable. Tanmateix, una vegada que els túbuls proximals estan danyats, la quantitat de 2MG a l'orina augmenta, servint així com a biomarcador per a la funció tubular proximal. NAG és un gran enzim lisosomal de 130 kDa i la principal glucosidasa al túbul proximal. A causa de la seva gran mida, el glomèrul no pot filtrar NAG, mentre que els túbuls proximals danyats segreguen NAG a l'orina. Així, un augment del NAG urinari és un altre biomarcador del dany tubular proximal. La histopatologia glomerular com els capil·lars obstruïts per fibrina és una troballa freqüent en pacients amb STEC; tanmateix, les dades urinàries anteriors suggereixen un dany tubular proximal en la malaltia anterior. A més, l'orina dels pacients amb STEC conté motlles que consisteixen en epiteli tubular que és el resultat de l'exfoliació de cèl·lules tubulars proximals danyades [1]. En els models animals, sovint es troba l'exfoliació de les cèl·lules tubulars proximals tant en la infecció per STEC com en els models d'injecció Stx [25–27,34]. En l'estudi actual, hem trobat la desaparició de les cèl·lules tubulars proximals als ronyons murins injectats amb Stx2-que suggereix una alteració tubular proximal induïda per Stx2-(figura 1). A més, vam detectar el receptor Stx2 Gb3 tant al ratolí com atúbuls proximals del ronyó humàamb expressió lateral luminal que és indicativa d'una interacció directa de Stx2 amb els túbuls proximals (figures 2 i 3). El PDK4 fosforila la piruvat deshidrogenasa per inhibir la seva activitat, donant lloc a una disminució de la utilització de la glucosa i un augment del metabolisme dels greixos en resposta al dejuni prolongat i la fam. Protegeix les cèl·lules epitelials desprengudes contra la mort cel·lular induïda pel despreniment (anoikis) [35]. PDK4 inicialment va tenir un pic a les 4 h, després un altre pic a les 8 h (figura 5A). Es va reduir a les 12 h, però a partir d'aquí va tenir un augment gradual fins a les 72 h amb un canvi log2-fold i va acabar amb 3 (12-canvi) (figura 5A). El despreniment de les cèl·lules epitelials es va produir a les cèl·lules tubulars proximals del ratolí injectades amb Stx2-(sloughing) amb una morfologia relativament intacta (figura 1), això pot reflectir la regulació de PDK4.

EXTRACTE DE CISTANCHE TUBULOSA EN POLS PER A RENÓN

Com que NHERF1 (SLC9A3R1) contribueix a l'adhesió normal de les cèl·lules a la matriu extracel·lular [36], a l'organització del citoesquelet d'actina i al manteniment de la morfologia cel·lular, la reducció de l'expressió d'aquest gen pot tenir conseqüències com la desaparició de les cèl·lules (figura 5K).

L'efecte de Stx2 sobre els túbuls proximals sembla un factor tan important per a la malaltia infecciosa STEC; tanmateix, abans no estaven disponibles alteracions en l'expressió gènica centrades en cèl·lules tubulars proximals in vivo. Keepers et al. [37] van mostrar gens expressats de manera diferencial (DEG) als ronyons de ratolins injectats amb Stx2+LPS de manera que la majoria dels gens anteriors i en gran part alterats eren de la influència de LPS i els gens que es van alterar molt tard provenen de l'efecte Stx2. . Les seves dades van mostrar una visió valuosa de les expressions gèniques diferencials del ronyó, però no van separar els tipus de cèl·lules que eren responsables d'aquest canvi. En l'estudi actual, hem intentat buscar DEGs associats a les cèl·lules tubulars proximals comparant dades de microarrays del ratolí.ronyó i tubular proximal primari humàcèl·lules que es van tractar amb Stx2.

3.2. Factors tubulars proximals implicats en la patologia induïda Stx2-en relació amb les activitats Stx2 conegudes a les cèl·lules que expressen Gb3

3.2.1. Activitat (I), transducció de senyal induïda per Stxs unió a Gb3

Les subunitats B de Stxs indueixen la fosforilació de la tirosina cinasa src no receptora [4]. El Sí fosforilat activa les molècules de senyalització aigües avall per la seva activitat quinasa i condueix a la remodelació del citoesquelet [5]. Se sap que la fosforilació de proteïnes associades a Sí (YAP) a Y357 per Yes indueix la translocació nuclear de YAP on actua com a coactivador transcripcional per induir gens diana com CTGF [38]. Les proteïnes matricel·lulars CYR61 (CCN1) i CTGF (CCN2) es secreten a la matriu extracel·lular (ECM) i contribueixen a mantenir l'adhesió cel·lular-ECM unint integrines del receptor i proteoglicans de sulfat d'heparan (HSPG) units a la superfície cel·lular [39,40]. La molècula clau de la transcripció de CCN1 i 2 és YAP, i es manté inactiva (fosforilada al residu de serina 127) en un estat normal sota la via de senyalització de Hippo. Un cop es detecta una baixa adhesió cèl·lula-cèl·lula, el YAP (S127) ja no es fosforila, la qual cosa li permet entrar al nucli i la transcripció de CCN1 i 2 augmenta [41–43]. CCN1 i 2 actuen com a molècules de cicatrització de ferides per reparar el teixit perdut per les cèl·lules [38,44]. Al nostre conjunt de dades, CCN1 i 2 tenien pics petits en un moment anterior (6 h). Això pot estar reflectint l'activació Sí induïda per la unió Stx2. Hores posteriors, l'escorçament pot haver desencadenat una activació addicional de YAP desactivant la via de senyalització d'Hippopotamo per induir una expressió més gran de CCN1 i 2 a les 12 h o més tard (figura 5C).

3.2.2. Activitat (II), Inducció d'ER-Estrès/UPR

Les Stx arriben a l'ER, on els fragments A1 escindits i les subunitats B imiten proteïnes desplegades [9,10,45,46]. La proteïna regulada per glucosa 78 kDa (Grp78, proteïna d'immunoglobulina d'unió (Bip)) està ancorant tres proteïnes clau UPR Enzim que requereix inositol-1 (Ire{-1), proteïna quinasa R-quinasa del reticle endoplasmàtic (PERK) ) i activant el factor de transcripció 6 (ATF6) a la membrana ER durant l'estat normal. Tanmateix, a causa de la major afinitat de Grp78 amb les proteïnes desplegades, allibera aquestes proteïnes ancorades. L'ATF6 s'activa després de l'alliberament i augmenta les NA mR de CHOP (DDIT3) i X-box binding protein 1 (XBP-1), mentre que Ire-1 empalma l'ARNm de XBP-1 per produir XBP{{ 22}} proteïna, que contribueix a la transcripció CHOP (DDIT3). L'activació de PERK condueix a l'activació d'ATF4 que també augmenta l'ARNm de CHOP (DDIT3). Per tant, un augment de l'ARNm de CHOP (DDIT3) és un segell distintiu de la UPR [47,48]. S'informa que els Stx indueixen UPR i CHOP (DDIT3) està regulat al nostre conjunt de dades (figura 5D-G).

GDF15 pertany a la família del factor de creixement transformant beta (TGF). Recentment, s'ha demostrat que GDF15 media la pèrdua de pes induïda per la metformina per fàrmacs diabètics [49]. En els ratolins administrats per via oral amb metformina, l'ARNm de GDF15 intestinal i renal va augmentar, donant lloc a una elevació del GDF15 sèric. El GDF15 circulant funciona mitjançant un receptor restringit al tronc cerebral per suprimir la ingesta d'aliments i reduir el pes corporal [50]. En els ratolins administrats amb metformina, l'augment de GDF15 renal està almenys en part sota la regulació de CHOP (DDIT3). Al nostre conjunt de dades de ronyons de ratolins injectats amb Stx2-, CHOP (DDIT3) va augmentar inicialment a les 4 h amb un pic molt petit i després va començar a tenir una tendència creixent cap a les 48 h on va mantenir el nivell d'un registre{{16} }} canvi de plec al voltant de 1,3 (figura 5E). Segons l'anàlisi del clúster STRING, GDF15 rep entrada activa dels factors de transcripció CHOP (DDIT3) i ATF3 (Figura 5E) [51, 52]. El pes murí injectat amb Stx va començar a disminuir o desviar-se del control salí després de 24 h (figura S3B). Un augment de l'ARNm de GDF15 al ronyó a les 12 h pot haver influït en el tronc cerebral per reduir la ingesta d'aliments, que al seu torn va aparèixer com una pèrdua de pes (figures 5E i S3B). Com que el nivell d'expressió de GDF15 continuava sent alt després de 24 h, els ratolins van continuar perdent pes (figures 5E i S3B).

Amb l'estrès ER, PERK s'allibera de Grp78 (Bip) i s'oligomeritza per fosforilar i inhibir eIF2 que condueix a la repressió global de la traducció, excepte algunes proteïnes sensibles a UPR com ATF4, CHOP i Grp78. GADD34 (subunitat reguladora de la proteïna fosfatasa 1 15A (PPP1R15A)) és una de les proteïnes augmentades sota la inhibició associada a eIF2 fosforilada (eIF2 (P)) i regulada al nostre conjunt de dades (figura 5D, G). GADD34 és una proteïna fosfatasa-1 que desfosforila eIF2 (P) per regular negativament la inhibició de la síntesi de proteïnes induïda per UPR [53]. L'expressió GADD34 (PPP1R15A) es converteix en un canvi log2-fold més gran que 1 després de 12 h de Stx2 al nostre conjunt de dades i continua augmentant fins a les 24 h quan s'aplana (el canvi de registre2-fold és igual a 2,1) i manté aquesta expressió. nivell fins al final (figura 5D, G). Això suggereix que la UPR induïda per Stx2-va tenir retroalimentació negativa després de 12 h. L'augment de la transcripció i la traducció de CHOP (DDIT3, GADD153) és un segell distintiu de l'estrès ER i el patró d'expressió diferencial s'assembla a GADD34, excepte que es produeix un log2 més gran que 1 després de 24 h i es produeix gradualment altiplans després (log2 és igual a 1, 3) (Figura 5D, G). A més, CEBPB, el soci dimeritzador predominant de CHOP, està regulat al nostre conjunt de dades (figura 5D, G). Aquests resultats suggereixen que, tot i que l'estrès ER induït per Stx2-s'inicia des de molt aviat en el transcurs del temps, augmenta l'efecte fins a 24 h i manté aquest nivell d'estrès ER fins al final, mentre que un braç de retroalimentació negativa també s'equilibra simultàniament.

3.2.3. Activitat (III), Activitat de Proteïna Inactivadora de Ribosomes (RIP).

En escindir una adenina de l'ARNr, les Stxs inhibeixen la síntesi de proteïnes de novo. L'ARNr depurinat influeix en l'alteració de la morfologia ribosòmica, que activa la transducció del senyal [11] coneguda com a resposta a l'estrès ribotòxic (RSR), que condueix a l'activació gènica característica (vegeu el paràgraf següent).

3.2.4. Activitat (IV), Activitat de resposta a l'estrès ribotòxica (RSR).

ZAK (un MAPKKK) és la quinasa coneguda a RSR i activa les vies de la quinasa terminal JUN N (JNK) i p38 MAPK [12, 15]. Stx1 indueix l'expressió d'ARNm JUN i FOS a les cèl·lules epitelials intestinals humanes i aquest esdeveniment va requerir Stx1 positiva per a l'activitat RIP que es creu que està sota control RSR [15]. Se sap que una altra molècula RSR aigües avall, p38 MAPK, indueix gens de resposta primerenca com JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 i ATF3 [54], tots els quals es van expressar de manera diferent al nostre conjunt de dades. També se sap que les vies JNK i p38 MAPK s'activen esdeveniments aigües avall d'Ire-1 sota UPR (figures 4B, D i 5B, E, F) [47]. Per això, els Stxs poden activar aquestes dues vies mitjançant RSR i/o UPR. També es mostra que la via 1/2 de la cinasa regulada per senyal extracel·lular (ERK) es troba aigües avall de RSR [55] i se sap que el gen DUSP1 (MKP1) és induït per la via ERK1/2 [56]. Stx1 i anisomicina (un altre inhibidor de la síntesi de proteïnes) són capaços d'induir l'expressió DUSP1 a les cèl·lules Caco-2 [57]. Al nostre conjunt de dades, es va induir l'expressió DUSP1 i això pot indicar l'activació d'ERK1/2 (figura 4B, D).

3.2.5. Activitat (V), Transcripció gènica particular que condueix a citocines

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 després de 24 i 48 h, respectivament (figura 5F). Això suggereix que s'indueixen gens hat sota les dues vies NF-κB, IκB (clàssic) i RelB (alternativa). Com que l'expressió diferencial de CHOP (DDIT3) supera el log2 més gran que 1 després de 24 h, el ronyó del ratolí se sotmet a UPR, de manera que el PERK activat fosforila el factor d'iniciació de la traducció eucariota 2 subunitat alfa (eIF2) per inhibir la traducció de NFKBIA [60]. Per aquest motiu, un augment de l'ARNm de NFKBIA pot no inhibir gran part de la via NF-κB, per la qual cosa es permet la transcripció de factors inflamatoris (figura 5L).

Sobbe et al. [61] va demostrar que tant les vies clàssiques (RelA-p50) com les alternatives (RelB-p52) NF-κB estaven actives en ratolins injectats amb Stx detectant la regulació de les citocines objectiu de RelA CCL20, CXCL1 i CXCL10 que també s'expressaven de manera diferent al nostre conjunt de dades (figura 5L).

3.2.6. Activitat (VI), apoptosi induïda per Stxs

La caspasa 3 escindida s'ha trobat en la mort cel·lular associada a Stxs [13,15,62]. S'ha demostrat que l'activació de la caspasa-3 o la inducció de l'apoptosi per Stxs es produeix en el context de RSR i UPR. En la RSR induïda per Stxs, hi participen tant les vies p38 MAPK com la JNK [15], així com l'activació d'ERK [55]. D'altra banda, se sap que UPR indueix les vies NF-κB, JNK i p38 MAPK. S'ha demostrat que CHOP (DDIT3) sota UPR està implicat en l'apoptosi [63] i també s'ha demostrat en l'apoptosi associada a Stxs [13]. També s'ha informat de la participació de JNK en l'apoptosi induïda per UPR [64]. Al nostre conjunt de dades, diversos DEG com CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN i JUNB estan implicats en RSR i UPR (figura 5B, F).

3.3. Desregulació circadiana per Stx2

Es produeix un augment de l'endotelina sèrica-1 (ET-1, EDN1) en pacients amb STEC-HUS [65]. A més, experimentalment, Stx2 indueix l'expressió EDN1 activant cascades de transducció de senyals que impliquen MAPKs [66], mentre que se sap que UPR indueix la transcripció d'EDN1 [67]. Al nostre conjunt de dades, l'expressió EDN1 induïda pel tractament Stx2 tant al ronyó del ratolí com a les cèl·lules tubulars proximals humanes (figura 5G). Com que l'expressió del gen EDN1 era un denominador comú del ronyó del ratolí i les cèl·lules epitelials tubulars proximals humanes, mostra que l'expressió EDN1 es produeix, almenys en part, a les cèl·lules epitelials tubulars proximals in vivo a més de les cèl·lules endotelials. A més, ET-1 secretada indueix l'expressió EGR1 mitjançant l'activació de MAPK [68]. Les nostres dades confirmen la regulació de l'EGR1 en el temps quan EDN1 està regulat (figura 5H). EGR1 indueix l'expressió del factor clau del ritme circadià PER1 [69], ajustant així l'amplitud d'altres factors circadians (figura 5H).

En la regulació circadiana, l'heterodímer de CLOCK-BAML1 (ARNTL) regula PER1 i CRY1. A canvi, l'heterodímer PER1-CRY1 s'uneix a CLOCK-BAML1 (ARNTL) per suprimir la transcripció més pròpia i, per tant, fa un bucle negatiu del ritme circadià. Així, els pics d'expressió de gens reguladors positius (CLOCK i BAML1 (ARNTL)) i gens reguladors negatius (PER1 i CRY1) es produeixen en una hora alternativa que quan CLOCK i BAML1 (ARNTL) tenen un augment d'expressió, PER1 i CRY1 disminueixen, i el patró canvia en les hores següents. Quan vam afegir els valors de canvi de registre2-de CLOCK i BAML1 (ARNTL) al gràfic (Figura 5J), durant els punts de temps anteriors, PER1 i BAML1 (ARNTL) mostraven un patró rítmic oposat amb pics aguts/estrets, tanmateix, després de 24 h els pics van començar a avorrir-se i augmentar contínuament sense ritme. Això implica que Stx2 va influir en el ritme circadià renal inclòs dins dels túbuls proximals. Tot i que es necessita un altre experiment de confirmació, les nostres dades combinades amb la literatura publicada que descriu l'efecte PER1 sobre la regulació circadiana renal sobre estímuls [70, 71], suggereixen una possible implicació de Stx2 en la alteració del ritme circadià i efectes sobre les funcions tubulars proximals mitjançant la reducció dels gens del rellotge renal. factors regulats com SGLT1 (SLC5A1) (figura 5K). De fet, vam observar glucosúria en ratolins injectats amb Stx2-que es reprodueixen en un altre estudi amb ratolins injectats amb Stx1-[21] que indica una disfunció de SGLT1 (SLC5A1) als túbuls proximals (taula 3). Segons el que sabem, aquest és el primer informe que indica la implicació de Stx2 en la alteració del ritme circadià renal.

4. Conclusions

Hem determinat gens importants relacionats amb les expressions associades al túbul proximal que van ser alterades per Stx2. Se suposa que l'expressió diferencial d'aquests gens és el resultat d'activitats Stx2 com la inducció UPR, la RSR associada a la depurinació de l'ARNr i la transducció de senyal induïda per la unió del receptor Gb3 de membrana plasmàtica. El gen més expressat, GDF15, pot influir en la pèrdua de pes causada per Stx2 mitjançant receptors restringits al tronc cerebral reduint la ingesta d'aliments. La matriu extracel·lular i l'adhesió cel·lular poden estar influenciades per PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 i CTGF que causen histopatologia específica de Stx2-i descamació. A més, la alteració del ritme circadià renal per part de Stx2 pot provocar defectes funcionals tubulars proximals com la reabsorció de glucosa.

5. Materials i Mètodes

5.1. Animals Ratolins

(C57BL/6, mascle, 19-22 g, lliure de patògens específics) es van comprar a Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japó). Es donava aigua i menjar ad libitum. Els ratolins es van mantenir amb un cicle estàndard de 12 h: 12 h de llum-foscor en què la llum s'encenia a les 7 del matí i s'apaga a les 7 de la tarda La temperatura de l'habitació dels animals es va mantenir al voltant dels 24 ◦ C. Tots els procediments van ser aprovats pel Comitè de Cura dels Animals de la Universitat.

5.2. Teixit renal humà

En aquest estudi es va utilitzar teixit cadàver sense cap identificador personal, i es considera exempt per les directrius d'investigació humana de la Universitat.

5.3. Cultiu cel·lular

El cultiu primari de cèl·lules epitelials tubulars proximals renals humanes (RPTEC) es va comprar a Clonetics (Walkersville, MD, EUA) i es va mantenir a 37 ◦ C, atmosfera de CO2 del 5%. Les cèl·lules es van cultivar en un medi de creixement de cèl·lules epitelials renals complementat amb factor de creixement epidèrmic humà, hidrocortisona, epinefrina, insulina, triiodotironina, transferrina, GA-1000 i FBS.

5.4. La purificació de l'eliminació de LPS Stx2 sense LPS de Stx2 es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [72]. Breument, es va utilitzar la columna conjugada amb anticossos anti-Stx2 11E1{0 per obtenir la fracció Stx2 i, posteriorment, la fracció es va passar per Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) per eliminar LPS. La fracció Stx2 es va filtrar amb un filtre 0.2 µm i es va provar el nivell de LPS amb l'assaig de lisat d'amebòcits Limulus (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, EUA). Es va determinar que la fracció Stx2 tenia menys de 0, 03 unitats d'endotoxina (UE)/ml. El tipus de variant Stx2 era Stx2a.

5.5. Administració de Stx2 a ratolins Una dosi de 2LD50 (5 ng Stx2/20 g de pes corporal), que mata els ratolins en quatre dies (figura S3A), es va injectar als ratolins per via intraperitoneal en un volum de 0,1 ml en solució salina sense LPS. (Otsuka pharmaceutical, Japó). La injecció de toxines es va fer entre les 7 i les 9 del matí, en què els ratolins de curs més llarg van rebre Stx2 a les 7 del matí i van seguir un mostreig de 24, 48 i 72 hores a les 7 del matí.

5.6. Recollida d'orina i mesura de la glucosa en orina Després de 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 i 84 h d'injecció de Stx2, es va prendre orina i es van deixar caure 10 µL sobre el portaobjectes químic sec de Fuji GLU- La P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japó) i la glucosa en orina es van mesurar amb Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) a la instal·lació gestionada per. L'orina de la injecció pre-Stx2 es va utilitzar com a mostra de 0 h. La recollida d'orina es va realitzar amb dos ratolins

5.7. Processament de teixits Després de 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 i 72 h d'injecció de Stx2, tres ratolins per punt de temps van ser eutanasiats per CO2 i es van recollir ronyons. La meitat d'un ronyó es va fixar amb un 4% de solució salina tamponada amb paraformaldehid/fosfat durant 7 dies a 4 ◦ C i es va processar per a la secció de parafina. Una altra meitat del ronyó es va utilitzar per extreure ARN per a l'anàlisi de microarrays. Es van utilitzar tres ratolins sense cap tractament com a control normal (naïf o 0 h). Es van injectar tres ratolins amb PBS (vehicle) i es van sacrificar a les 72 h i van servir de control del vehicle per demostrar que hi ha canvis insignificants en les expressions gèniques en comparació amb el control normal.

5.8. Taca periòdica d'àcid Schiff (PAS) Les seccions de parafina es van hidratar i es van tacar amb una solució d'àcid periòdic 0,5%, seguida d'un esbandida amb aigua destil·lada. Les seccions es van transferir al reactiu de Schiff. Després de rentar les seccions amb una solució de bisulfit de sodi 0,6%, es van tacar amb hematoxilina.

5.9. Tractament Stx2 a les cèl·lules RPTEC humanes RPTEC es van tractar amb 10 ng/mL de Stx2 durant 6, 13 i 19 h a 37 ◦ C, 5% CO2. Es va utilitzar RPTEC sense tractament Stx2 com a control. Es van realitzar dues rèpliques biològiques per punt de temps. Després de rentar-se amb PBS, es van utilitzar cèl·lules per a l'extracció d'ARN.

5.10. Tinció d'immunofluorescència flotant lliure Per al processament de la secció flotant lliurement, es va fixar un ratolí normal com es descriu a Obata et al. [69]. A continuació, es van disseccionar els ronyons murins i es van submergir en PFA/PBS al 4% durant 3 h a 4 ◦ C amb una suau agitació. Els teixits es van rentar amb PBS i es van crioprotegir amb un 30% de sacarosa/PBS a 4 ◦ C durant la nit o fins que s'enfonsen al fons. Les seccions congelades gruixudes (50 µm) es van tallar amb un micròtom lliscant amb paràmetres congelats. Les seccions es van bloquejar amb anticòs IgM anti-rata de cabra 1:50 a PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, EUA) durant 1 h i es van incubar amb anticossos anti-Gb3/CD77 1:100 al bloqueig. solució o control d'isotip (IgM de rata) en una concentració igualada com a anticossos primari durant la nit a 4 ◦C. Després del rentat, les seccions es van incubar amb un anticòs secundari (anti-rata IgM Alexa Fluor 488, dilució 1:2000 en PBS) durant 2 h a 4 ◦ C. Les seccions es van tacar per a altres sondes AQP1 (dilució 1:1000, Sigma-Aldrich Japó, Tòquio, Japó) i CD31 (550274, dilució 1:50, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) amb anticossos secundaris anti-conill IgG Alexa Fluor 546 (dilució 1:2000 en PBS) i Alexa Fluor 647 anti-ratolí IgG (dilució 1:2000 en PBS), respectivament. Després del rentat amb PBS, es va fer una tinció de 40 , 6-Diamidino{-2-fenilindol (DAPI, D21490, Thermo Fisher) durant 15 min a 4 ◦ C. Les seccions es van submergir en fluids en un pou de la 96-placa del pou (en forma d'U) amb un petit rubor de pintura cada vegada que es canviava la solució. El pas de rentat es va fer en pous més grans, com ara plaques 12- o 6-pous. Es va utilitzar un mitjà de muntatge aquós per a la coberta. Per a la preparació de teixits humans, el ronyó postmortem es va fixar en formalina al 20% durant 2 setmanes i es va processar per a la preparació flotant com es va fer per al teixit del ratolí, amb una excepció, l'anticòs anti-humà CD31 (CBL468, dilució 1:20, Merck KGaA, Darmstadt). , Alemanya) es va utilitzar.

5.11. Anàlisi de microarrays

La meitat del ronyó es submergeix en 2 ml de RNALater (Ambion, Austin, TX, EUA) a 4 ◦ C i l'ARN total es va extreure amb el kit Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, EUA). Es van utilitzar matrius del genoma del ratolí 430A 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Els fitxers CEL es van obtenir i normalitzar amb una mitjana robusta de múltiples xips (RMA), el càlcul del nombre de còpies d'ARN i els canvis de plecs en 0 h es van realitzar a R (v.3.6.0) amb el seu paquet affy [73] i RankProd 2.0 [74]. Les dades es mostren als valors de canvi de registre2-fold. El conjunt de dades es diposita a Gene Expression Omnibus (GEO) (número d'adhesió GSE172465). De les cèl·lules RPTEC, l'ARN total es va extreure amb RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Tòquio, Japó). Es va utilitzar microarray d'oligonucleòtids del genoma humà sencer (microarray d'ADN d'oligonucleòtids de 44K, Agilent Technologies, Tòquio, Japó) per a experiments de microarrays. Les mostres totals d'ARN es van utilitzar per a la preparació de sondes d'ADNc marcades amb Cy5- i Cy3-. Les mostres marcades amb fluoròfors es van hibridar a cada porta de vidre i es van rentar, després es van escanejar amb un escàner de microarrays d'ADN (model G2505A; Agilent Technologies). El programari d'extracció de característiques i anàlisi d'imatges (Agilent Technologies) es va utilitzar per localitzar i delimitar cada punt de la matriu i per integrar les intensitats, que després es van filtrar i normalitzar mitjançant el mètode de suavització de diagrama de dispersió ponderat localment. La reproductibilitat de l'anàlisi de microarrays es va avaluar mitjançant dues repeticions de canvi de colorant en cada experiment. Es van comparar les diferències en l'expressió d'ARNm entre el control i el RPTEC tractat amb Stx2-collit a les 6, 10 o 19 h. Les dades en format TXT del programari GeneSpring es van utilitzar per determinar els noms dels gens a partir de l'identificador de la sonda i convertir els canvis de plecs en canvis de registre2-. El conjunt de dades es diposita a GEO (número d'adhesió GSE172466).

5.12. Anàlisi bioinformàtica de dades de microarrays i visualització Tant a les dades de ronyó de ratolí com a microarrays RPTEC, els gens que són comuns a tots dos i on el canvi en l'expressió va ser més de 2- vegades disminueix o augmenta (o loga 2- canvi). és més petit que −1 o més gran que 1) en qualsevol moment van ser seleccionats per R. A més, a les dades de microarrays de ronyó de ratolí. Les alteracions gèniques que s'ajusten a les corbes cúbiques es van escollir mitjançant el paquet R maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (últim accés el 4 de gener de 2022)] [75]. La corba cúbica és adequada per acomodar l'augment o la disminució d'aquests gens durant un curs de temps. Un grau polinomi més alt com una corba cúbica permet seleccionar gens amb múltiples alteracions durant el transcurs del temps millor que una corba quadràtica. Els gens que es van comportar per una trajectòria similar es van agrupar i els seus patrons de disminució/augment es van visualitzar mitjançant un mapa de calor utilitzant el paquet R gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (últim accés el 4 de gener). 2022)] [76]. Es va assignar ontologia gènica (GO) i les funcions de GO entre gens comuns es van enriquir mitjançant Metascape [http://metascape.org (últim accés el 4 de gener de 2022)] [77]. La connexió/relació de gens comuns es va analitzar mitjançant STRING [https://string-db.org/ (últim accés el 4 de gener de 2022)] [78]. Es va cercar manualment l'associació entre gens comuns, així com amb la funció de mineria de text de STRING.

Referències

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. La síndrome hemolítico-urémica.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. La síndrome hemolítica urèmica: un estudi de les alteracions patològiques renals.Am. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. El deteriorament per la verotoxina de la funció tubular contribueix al dany renal observat en la síndrome hemolítica urèmica.J. Infectar.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Activació de la cinasa de la família Src induïda per la unió de la toxina Shiga a la globotriaosyl ceramida (Gb3/CD77) en microdominis de baixa densitat i insolubles en detergent.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; La unió de la toxina Fujimoto, J. Shiga a la globotriaosil ceramida indueix senyals intracel·lulars que medien la remodelació del citoesquelet en cèl·lules derivades del carcinoma renal humà.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Escissió induïda per Furin i activació de la toxina Shiga.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Reducció d'enllaços disulfur de proteïnes en un ambient oxidant. El pont disulfur de la subunitat A de la toxina del còlera es redueix al reticle endoplasmàtic.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Cook, JP; Senyor, JM; Roberts, LM La proteïna disulfur isomerasa redueix la ricina a les seves cadenes A i B al reticle endoplasmàtic.Bioquímica. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Haslam, la toxina DB Shiga es transporta des del reticle endoplasmàtic després de la interacció amb la chaperona luminosa HEDJ/ERdj3.Infectar. Immun.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. La subunitat B de la toxina Shiga s'uneix a la chaperona BiP i a la proteïna nucleolar B23.Biol. Cèl·lula2006, 98, 125–134. [CrossRef]