Swertiajaponin inhibeix la pigmentació de la pell mitjançant mecanismes duals per suprimir la tirosinasa Part 2

Cistancheés una herba comuna que es coneix com "l'herba miracle que allarga la vida". El seu component principal és el cistanòsid, que té diversos efectes com ara la promoció de la funció antioxidant, antiinflamatòria i immune. El mecanisme entre el cistanche i el blanqueig de la pell rau en l'efecte antioxidant dels glucòsids de cistanche.

La melanina a la pell humana es produeix per l'oxidació de la tirosina catalitzada per la tirosinasa, i la reacció d'oxidació requereix la participació de l'oxigen, de manera que els radicals lliures d'oxigen del cos es converteixen en un factor important que afecta la producció de melanina.Cistancheconté cistanòsid, que és un antioxidant i pot reduir la generació de radicals lliures al cos, inhibint així la producció de melanina.

Feu clic a Cistanche Tubulosa per millorar el blanqueig de la pell

Demana més:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

A més,cistanchetambé té la funció de promoure la producció de col·lagen, que pot augmentar l'elasticitat i la brillantor de la pell i ajudar a reparar les cèl·lules danyades de la pell.

CistancheEls glucòsids de feniletanol tenen un efecte reductor significatiu de l'activitat de la tirosinasa, i l'efecte sobre la tirosinasa es mostra com una inhibició competitiva i reversible, que pot proporcionar una base científica per desenvolupar i utilitzar els ingredients blanquejants de Cistanche.

Per tant,cistancheté un paper clau enblanqueig de la pell. Pot inhibir la producció de melanina per reduir la decoloració i la opacitat; i promou la producció de col·lagen per millorar l'elasticitat i la brillantor de la pell. A causa del reconeixement generalitzat d'aquests efectes del cistanche, molts productes per blanquejar la pell han començat a infondre ingredients a base d'herbes com Cistanche per satisfer la demanda dels consumidors, augmentant així el valor comercial de Cistanche en productes per blanquejar la pell.

En resum, el paper del cistanche en el blanquejament de la pell és crucial. El seu efecte antioxidant i l'efecte productor de col·lagen poden reduir la decoloració i l'apagada, millorar l'elasticitat i la brillantor de la pell i així aconseguir unefecte blanquejador. A més, l'àmplia aplicació de Cistanche en productes per blanquejar la pell demostra que no es pot subestimar el seu paper en el valor comercial.

Swertiajaponin inhibeix l'activació de MAPK induïda per UVB

S'ha demostrat que l'estrès oxidatiu estimula la melanogènesi mitjançant la regulació del factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF), un factor de transcripció per induir l'expressió gènica de la tirosinasa [4, 14]. Hem estudiat si l'efecte antioxidant de la swertiajaponina pot regular l'activitat del MITF. Les dades de Western blotting van mostrar que l'exposició UVB va augmentar el MITF fosforilat, una forma activa de MITF, mentre que el tractament amb swertiajaponin a 10 μM el va reduir (figura 6A). De manera consistent, un augment del nivell de proteïna tirosinasa mediat per UVB es va reduir mitjançant el tractament amb swertiajaponin (figura 6A). Com que s'ha demostrat que l'estrès oxidatiu activa el MITF a través de la proteïna quinasa activada per mitògens (MAPK) [15, 16], es va investigar si swertiajaponin pot controlar la senyalització MAPK. L'exposició UVB va augmentar dràsticament la fosforilació d'ERK, JNK i p38 (figura 6B), que s'associa amb la producció de ROS i ONOO induïda per UVB a les cèl·lules B16F10 (figura 5C - 5D). El tractament amb Swertiajaponin només a 10 μM va disminuir els nivells de proteïnes de MAPKs (figura 6B). Aquest resultat és coherent amb l'activitat antioxidant de la swertiajaponina perquè la disminució de l'estrès oxidatiu cel·lular induït per UVB només era clara a 10 μM de swertiajaponin (figura 5C -5D).

Tot i que la swertiajaponina és el compost principal de tota l'herba de Swertia japonica que s'ha utilitzat com a medicina japonesa, el nostre estudi no va mostrar evidències concloents sobre la seguretat de la swertiajaponina per a la seva aplicació a la pell humana. Tanmateix, la swertiajaponina no va mostrar citotoxicitat a les línies cel·lulars de Hs27 (fibroblast humà), HaCat (queratinòcit humà) i B16F10 (melanoma de ratolí) en el nostre entorn experimental. A més, no hi va haver signes visibles de citotoxicitat, inclosa la formació de restes cel·lulars o el despreniment cel·lular basat en l'observació microscòpica quan es va tractar swertiajaponin en el model de pell humana amb concentracions que no mostraven citotoxicitat a les línies cel·lulars. Tenint en compte que els problemes de seguretat són les principals preocupacions dels compostos per blanquejar la pell que estan disponibles actualment, es necessiten més estudis in vivo per examinar la seva seguretat en fisiologia.

En conjunt, swertiajaponin va inhibir l'acumulació de melanina fins a un límit satisfactori tant en els models cel·lulars com de pell humana mitjançant mecanismes duals per suprimir la tirosinasa mitjançant la unió directa i la inhibició competitiva de la tirosinasa i la supressió de la senyalització MAPK / MITF mediada per l'estrès oxidatiu (Figura 7). Tenint en compte els efectes adversos i la manca d'eficàcia a llarg termini dels agents blanquejants de la pell coneguts, com l'àcid kògic i l'arbutina [17], la swertiajaponina es pot aplicar amb més seguretat per suprimir la pigmentació de la pell i seria un nou additiu per als cosmètics blanquejants.

MATERIALS I MÈTODES

Assaig d'activitat de la tirosinasa amb tirosinasa de bolets

Swertiajaponina i àcid cògic (50 μM) es van carregar en una microplaca de 96-pou (Nunc, Dinamarca) en tampó de tirosinasa (200 μL) que contenia tirosinasa de bolets (1000 U), solució de L-tirosina 1 mM i fosfat de 50 mM tampó (pH 6,5) [5]. La placa es va incubar a 37 graus durant 15 min i es va avaluar la dopaquinona mitjançant espectrofotometria (450 nm). A partir de la mesura, es va calcular l'IC50 mitjançant corbes log-lineals i les seves equacions.

Simulació d'acoblament de swertiajaponina i tirosinasa

AutoDock Vina es va utilitzar per a la simulació d'acoblament de proteïnes i lligands in silico. L'estructura tridimensional de la tirosinasa es va utilitzar en l'estructura cristal·lina d'Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). El lloc d'unió predefinit de la tirosina es va aplicar com a butxaca d'acoblament. Després de realitzar simulacions d'acoblament entre tirosinasa i swertiajaponina o àcid cògic, es va utilitzar el programari LigandScout 3.0 per predir els residus d'unió entre diferents compostos i tirosinasa.

Anàlisi cinètica de la inhibició de la tirosinasa per swertiajaponina

La L-DOPA es va preparar a concentracions de 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 i 0.0625 mM i swertiajaponina es va preparar a 20, 40 i 80 μM. La solució de la barreja de reacció es va preparar en una placa de 96-pou, en la qual 20 μL de substrat de tirosinasa (L-DOPA), 10 μL d'una solució aquosa de tirosinasa de bolets (200 U) i 50 mM de tampó de fosfat de potassi (pH). 6.5) es van afegir. La velocitat de producció de dopacrom de la barreja de reacció es va mesurar a una longitud d'ona de 450 nm mitjançant un lector de microplaques. A continuació, es va calcular la taxa d'inhibició de la tirosinasa de swertiajaponin mitjançant l'anàlisi de la trama Lineweaver-Burk. La constant de Michaelis (Km) i la velocitat màxima (Vmax) també es van calcular mitjançant diagrames de Lineweaver-Burk amb diferents concentracions de substrat L-DOPA [3].

Cultiu cel·lular i assaig de viabilitat

Les cèl·lules de melanoma B16F10 es van comprar al Korea Cell Line Bank. Les cèl·lules es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) amb un 5% de sèrum fetal boví (FBS) i un 1% de penicil·lina, estreptomicina, L-glutamina i piruvat de sodi. Les cèl·lules es van mantenir a 37 graus en una atmosfera humidificada del 95 per cent d'aire/5 per cent de CO2. Per a l'assaig de viabilitat cel·lular, les cèl·lules es van sembrar en plaques de 96-pous. Les cèl·lules de melanoma B16F10 es van tractar amb swertiajaponina a diverses concentracions durant 48 h. Es va afegir Ez-Cytox (10 μL) a cada pou i es va incubar durant 2 h. Els cristalls de formazan formats es van mesurar per espectrofotometria a 450 nm. La viabilitat cel·lular es va calcular utilitzant cèl·lules sense tractament amb swertiajaponina com a grup control.

Contingut de melanina a les cèl·lules B16F10

El nivell de melanina es va mesurar mitjançant el mètode descrit anteriorment amb lleugeres modificacions [18]. Les cèl·lules B16F10 es van permetre créixer fins al 70-80 per cent de confluència a les plaques de 6-pous. Les cèl·lules es van tractar prèviament amb swertiajaponina o àcid kojic durant 2 h. Després, MSH o UVB es van tractar amb el medi que contenia àcid swertiajaponina o àcid kojic i es va incubar durant 48 h més. Després de rentar-se amb PBS, les cèl·lules es van separar amb tripsina i es van dissoldre en una solució de NaOH 1 N de 90 μL que contenia DMSO (5 per cent). Després de la incubació a 60 graus durant 1 h, es va determinar el contingut de melanina mesurant l'absorbància a 405 nm. Es va utilitzar una cambra UV disponible comercialment (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Corea) per a l'exposició UVB de cèl·lules B16F10.

Western blotting

Les mostres de proteïnes aïllades de cèl·lules B16F10 (30 ug) es van separar mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida mitjançant gels d'acrilamida del 10-12 per cent i es van transferir a membranes de fluorur de polivinilidè, que es van col·locar immediatament en un tampó de bloqueig ( 5 per cent de llet sense greix) en Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM i Tween 20 al 0,1 per cent. La membrana es va rentar en tampó TBS-Tween durant 30 min i després es va incubar amb anticossos primaris específics (1: 1{). {24}} dilució) indicada a les llegendes de les figures a 4 graus durant la nit. Després de rentar-se amb tampó TBS-Tween, la membrana es va incubar amb un anticòs anti-ratolí conjugat amb peroxidasa de rave picant (Santa Cruz, 1: 10,000), un anticòs anti-conill (Santa Cruz, 1: 10, 000), o un anticòs anti-cabra (Santa Cruz, 1: 10.000) a 25 graus durant 1 h. Les immunoblots es van visualitzar mitjançant la solució de Western Bright Peroxide (Advansta, CA, EUA) i el sistema d'imatge ChemiDoc Touch (Bio-Rad, EUA) segons les instruccions del fabricant. Els anticossos utilitzats en aquest estudi són els següents: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tirosinasa (Cell Signaling-104976), pMITF (Abcam{{40} }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (senyalització cel·lular-921L), p38 (senyalització cel·lular-9212S), pERK (senyalització cel·lular-4370L) ), ERK (senyalització cel·lular-9201L), pJNK (senyalització cel·lular-9251L), JNK (senyalització cel·lular{-9252S) i -actina (Santa Cruz-47778) .

Mesura dels nivells de ROS i ONOO-

L'activitat antioxidant de la swertiajaponina es va examinar mitjançant diacetat fluorescent de 2,7-diclorodihidrofluoresceïna (DCFDA) per a ROS i dihidrorodamina (DHR) 123 per ONOO-. Breument, per determinar el nivell de ROS, es va afegir DCFDA (25 μM) als homogeneïtats cel·lulars per a un volum final de 250 ul. Per mesurar el nivell d'ONOO, es van afegir 10 ul d'homogeneïtats cel·lulars a una solució de rodamina (tampó de fosfat sòdic 50 mM, clorur de sodi 90 mM, àcid dietilentriaminopentaacètic [DTPA] 5 mM i DHR123). Per als dos assaigs, la fluorescència es va mesurar cada 5 minuts durant 30 minuts en un lector de plaques de fluorescència, amb longituds d'ona d'excitació i emissió fixades a 485 i 530 nm, respectivament.

Acumulació de melanina en un model de pell humana

Es va utilitzar una epidermis humana viable, reconstituïda i tridimensional (Neoderm-ME, Tego Science) per examinar l'efecte anti-melanogènic de la swertiajaponina en un model de pell humana. El model de pell humana es va tractar prèviament amb DMSO (vehicle) o swertiajaponin durant 1 h i es va cultivar en els medis de manteniment proporcionats per l'empresa durant 5 d amb tractament DMSO o swertiajaponin. Es va realitzar una anàlisi microscòpica des del dia 1 fins al dia 5 per observar la pigmentació de la pell. Les imatges microscòpiques es van analitzar mitjançant el programari Image J per semiquantificar l'enfosquiment de la pell. Per a la tinció de Fontana-Masson, les mostres de pell es van fixar en un 4% de paraformaldehid durant la nit a temperatura ambient i les mostres van ser analitzades per una empresa comercial (Garam Meditech, Corea del Sud).

Anàlisi estadística

Totes les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Es van comparar diferents grups mitjançant una anàlisi de variància unidireccional seguida de la prova posterior de Dunnett. P < 0,05 es va considerar estadísticament significatiu.

CONFLICTES D'INTERÈS

No hi ha conflictes d'interessos a declarar.

FINANÇAMENT

Aquest treball va comptar amb el suport de Grant K17281 de l'Institut de Medicina Oriental de Corea, Ministeri d'Educació, Ciència i Tecnologia (MEST), República de Corea.

REFERÈNCIES

1. Bradford PT. Càncer de pell en pell de color. Infermeres Dermatol. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Aproximacions químiques i instrumentals per al tractament de la hiperpigmentació. Pigment Cell Res. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. Derivats de (Z)-2-(Benzo[d]tiazol-2-ilamino)-5- (bencilidè substituït) tiazol{-4(5H)-ona com a inhibidors de la tirosinasa nous. Biol Pharm Bull. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P, et al. (Z)-5-(2,4-dihidroxibenzilidè) tiazolidina- 2,4-diona prevé la melanogènesi induïda per UVB i la formació d'arrugues mitjançant la supressió de l'estrès oxidatiu en HRM{{7} } ratolins sense pèl. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR, et al. L'àcid carboxílic (2R/S,4R)-2-(2,{4-dihidroxifenil) tiazolidina- 4-prevé la formació d'arrugues induïda pels UV mitjançant la inhibició de la inflamació mediada per NF-kappaB. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonols from Heterotheca inclou: activitat inhibidora de la tirosinasa i criteris estructurals. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identificació de residus de llocs actius implicats en la unió de cofactor metàl·lic i reconeixement de substrats estereoespecífics en la tirosinasa de mamífers. Implicacions en el cicle catalític. Bioquímica. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoids as mushroom tyrosinase inhibitors: a fluorescence quenching study. J Agric Food Chem. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Derivats de flavonoides com a potents inhibidors de la tirosinasa: una enquesta de troballes recents entre 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Estudis sobre els constituents de Swertia japonica. II. Aïllament i estructura del nou flavonoide, swertiajaponina. Chem Pharm Bull (Tòquio). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Efectes de l'extracte de Swertia japonica i el seu principal compost swertiamarin sobre el buidatge gàstric i la motilitat gastrointestinal en ratolins. Fitoteràpia. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Efecte inhibidor de la 2-metil-nafto[1,2,3-de]quinolina-8-un sobre el transport de melanosomes i la pigmentació de la pell. Ciència Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Paper dels flavonoides en l'estrès oxidatiu. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Les fulles joves de canya (Phragmites communis) suprimeixen la melanogènesi i l'estrès oxidatiu a les cèl·lules de melanoma B16F10. Biomed Pharmacother. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Vies de senyalització en la melanogènesi. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. La dihidromiricetina d'Ampelopsis grossedentata inhibeix la melanogènesi mitjançant la regulació a la baixa de les vies de senyalització MAPK, PKA i PKC. Chem Biol Interact. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Extracte de miceli de Ganoderma formosanum com a inhibidor de la tirosinasa molt potent. Ciència Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 estimula l'expressió gènica de la tirosinasa i la melanogènesi en melanòcits diferenciats. Pigment Cell Res. 2001; 14: 328-36.