Aïllament i quantificació del ginsenòsid Rh23, un nou compost anti-melanogènic de les fulles de Panax Ginseng

Resum:

Un nou ginsenòsid, anomenat ginsenòsid Rh23 (1) i 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahidroxydammar-23-è (2) es van aïllar de les fulles de Panax ginseng hidropònic. Els compostos es van aïllar mitjançant cromatografia en columna i es van determinar les seves estructures basant-se en mètodes espectroscòpics, inclosa l'espectrometria de masses de quadrupol/temps de vol d'alta resolució (HR-QTOF/MS), espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) i espectroscòpia d'infrarojos (IR). . Per determinar l'activitat anti-melanogènica, es va provar el canvi en el contingut de melanina a les cèl·lules Melan-a tractades amb compostos identificats.

A més, vam investigar els efectes inhibidors de la melanina del ginsenòsid Rh23 sobre la pigmentació en un model in vivo de peix zebra. El compost 1 va inhibir la melanogènesi potent a les cèl·lules melan-a amb un 37,0 per cent d'inhibició de la melanogènesi a 80 µM i també va presentar una inhibició de la pigmentació corporal en el model de peix zebra. Tot i que el compost 2 va mostrar una activitat inhibidora lleugerament menor que el compost 1, també va mostrar una disminució significativa de la melanogènesi a les cèl·lules Melan-a i al model de peix zebra. Aquests resultats van indicar que els compostos aïllats de P. ginseng hidropònic es poden utilitzar com a nous compostos per blanquejar la pell mitjançant els sistemes in vitro i in vivo. A més, aquest estudi va demostrar la utilitat del compost 1 basat en MS per a l'anàlisi quantitativa. El ginsenòsid Rh23 (1) es va trobar a un nivell de 0,31 mg/g en fulles de P. ginseng hidropònic.

Per a la melanina, vam trobar que Cistanche pot regular significativament a la baixa l'activitat de la tirosinasa, que és el principal enzim limitador de la taxa en la biosíntesi de la melanina de la pell i és un complex de coure i proteïnes. Pot hidroxilar la tirosina, la matèria primera principal per a la producció de melanina al cos, per produir L-dopa i després oxidar la dopa a dopaquinona. La dopaquinona pateix una sèrie de processos metabòlics, es reorganitza i es polimeritza, i finalment es combina amb Proteïnes combinades per produir una sèrie de pigments de melanina que provoquen l'enfosquiment. La melanina és el factor més important per determinar el color de la pell del cos humà. Una síntesi excessiva pot provocar la formació de malalties pigmentades de la pell com ara pigues, cloasma, taques de l'edat i melanoma. Per tant, mitjançant la investigació sobre la inhibició de l'activitat de la tirosinasa, es poden eliminar els ingredients efectius per inhibir la pigmentació de la pell, de manera que es pot veure que els glucòsids totals de Cistanche deserticola tenen l'efecte d'inhibir la pigmentació de la pell i blanquejar la bellesa.

Feu clic al producte de dosificació de cistanche

Paraules clau:

ginsenòsid Rh23; Panax ginseng; RMN; UPLC-QTOF/MS; peix zebra; anàlisi quantitativa.

1. Introducció

Panax ginseng CA Meyer és una herba medicinal tradicional molt famosa als països asiàtics. Panax prové d'una "panacea", que significa una cura per a les malalties. P. ginseng és una planta herbàcia perenne que pertany a la família de les Araliaceae [1]. Les arrels de P. ginseng de quatre a sis anys s'utilitzen principalment amb finalitats terapèutiques. Les flors floreixen al juny i les fulles tenen forma de paladar. P. ginseng s'ha conreat principalment a l'Àsia oriental, incloent Corea, Xina i Japó [2]. Fins ara, s'han informat molts estudis sobre els components químics de les arrels, les fulles i les baies del ginseng; S'han aïllat més de 100 tipus de ginsenòsids. Es van informar de diverses bioactivitats de P. ginseng, com ara la millora de l'activitat immunomoduladora, l'enfortiment nutricional, millores de la funció hepàtica, antidiabetis, activitats anticancerígenes, antiapoptòtiques i antioxidants [3–10].

Actualment, l'interès pels productes agrícoles d'alta qualitat relacionats amb el benestar augmenta gradualment, donant lloc al cultiu hidropònic de ginseng. El cultiu hidropònic té els avantatges d'un procés de cultiu senzill i un període de creixement més curt que el cultiu del sòl. El ginseng hidropònic només necessita de 2 a 4 mesos en un sistema que controli la temperatura, estigui lliure de pesticides, humit, lleuger, tingui ingredients orgànics, etc. [11]. Les fulles de ginseng de cultiu del sòl no s'utilitzen amb finalitats medicinals i vegetals funcionals, mentre que les fulles de ginseng hidropònic es poden utilitzar.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. En conclusió, les condicions hidropòniques van provocar un alt contingut de ginsenòsids i el contingut total de ginsenòsids a les fulles era significativament més gran que a les arrels, cosa que suggereix que les fulles de ginseng podrien ser una bona font de verdures funcionals i herbes medicinals.

S'han investigat diversos compostos blanquejants coneguts, com l'arbutina i l'àcid cògic, per la seva eficàcia en la reducció de la melanogènesi [13]. Malauradament, és necessari trobar agents per blanquejar la pell més segurs i eficaços, a causa del potencial carcinogènic de l'àcid cògic i tant per la seguretat com per als efectes secundaris de l'arbutina [14]. Per tant, s'ha investigat contínuament una gran atenció en el desenvolupament de nous productes naturals a la indústria cosmètica [15,16]. Diversos estudis han informat de la inhibició de la síntesi de melanina a partir de P. ginseng cultivat al sòl [17–20].

No obstant això, aquests estudis es van informar amb compostos coneguts, com l'àcid cinàmic i els compostos fenòlics, i no s'ha informat d'activitat de blanqueig de les fulles de P. ginseng hidropònic (HPGL). El nostre treball en curs va conduir a l'aïllament de ginsenòsids menors de HPGL. Normalment, els ginsenòsids en quantitats menors o traces no es poden detectar amb HPLC. En cas contrari, el temps analític és molt llarg, cosa que no és convenient per qualificar els ginsenòsids en espècies de ginseng [21,22]. Per quantificar ràpidament nous compostos, s'hauria d'establir un mètode ràpid i sensible, que pugui detectar a fons les traces de nous compostos. En el present estudi, es va establir una cromatografia líquida d'ultraalt rendiment sensible juntament amb el mètode d'espectrometria de masses quadrupol/temps de vol (UPLC-QTOF-MS) per quantificar el nou compost.

A partir de la descripció anterior, en aquest treball, es va revelar l'aïllament i la identificació d'un nou compost, incloses les propietats físiques i la quantificació, mitjançant mètodes espectroscòpics, i es van investigar les seves activitats anti-melanogèniques mitjançant sistemes in vitro i in vivo.

2. Resultats i discussió

Les fulles de Panax ginseng hidropònic (HPGL) es van extreure amb MeOH aquós i es van repartir en fraccions d'acetat d'etil (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) i H2O, respectivament. Les cromatografies repetides de columna SiO2 i ODS de la fracció n-BuOH van proporcionar un nou ginsenòsid (1) i es va aïllar un ginsenòsid rar (2) de la fracció EtOAc de HPGL.

El compost 1, pols blanca (metanol), va mostrar un color porpra a la TLC, ruixant un 10 per cent d'H2SO4 i escalfant. Es va determinar que la fórmula molecular era C37H64O10 a partir del pic d'ions quasimoleculars m/z 713,44723 [M més COOH]− en el QTOF/MS negatiu. L'espectre IR va suggerir la presència d'un grup hidroxil (3377 cm−1 ) i un doble enllaç (1647 cm−1 ). L'espectre 1H-RMN (Taula 1 i materials suplementaris) va mostrar dos senyals de protons de metina olefines (δH 6,02, 5,64), tres senyals de protons de metina oxigenats (δH 4,38, 4,03, 3,49), un senyal de protons metoxi (δH 3,18) i vuit. senyals de protons metil singlet (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), que indiquen que el compost 1 té un fragment triterpè tetracíclic que inclou un doble enllaç amb conformació trans i tres grups hidroxil.

A més, es confirma que el compost 1 és un tipus de protopanaxatriol (PPT) a partir del canvi químic d'un senyal de protó metil a δH 1,94 (H-28). El desplaçament químic de H-28 en el tipus protopanaxadiol (PPD) s'observa generalment a ca δH 1,30 [23]. A més, es va observar un senyal de protons hemiacetal (δH 5,15) i diverses metines oxigenades i un senyal de protons de metilè a δH 4,45–3,95 com a senyals d'un fragment de sucre. A partir de la constant d'acoblament del senyal de protó anòmer (J=7.6 Hz), tant el protó hemiacetal com H-2 del fragment de sucre estaven en una disposició axial. La combinació de les dades esmentades anteriorment va concloure que el compost 1 era un aminoglucòsid de protopanaxatriol. L'espectre 13C-RMN va mostrar 37 senyals de carboni a causa de les fraccions triterpè, metoxi i hexosa. Dos carbonis de metina olefines (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), un carboni quaternari oxigenat (δC 74,9 (C{-25)), tres carbonis de metina oxigenats (δC 78,5 (C-3), 7{{9{0}},3 (C{-12), 67,7 (C{-6)), un carboni metoxi (δC 50,2 ( 25-OCH3)) i vuit carbonis metil (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C{-27), 26,1 (C{-26), 23,0 (C{{{ 57}}), 17,6 (C{-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C{-30), 16,4 (C{-29)) es van observar senyals per als fragment d'aglicon. Les dades de RMN del compost 1 eren similars a les del compost 2, excepte pel desplaçament químic d'un carboni quaternari oxigenat, és a dir, C-25. A més, el sucre es va identificar com una -glucopiranosa dels senyals de carboni hemiacetal (δC 98,3, (C-10)), quatre metines oxigenades (δC 78,9 (C{-30), 78,2 (C{{{82}) }} ), 75,2 (C{-20 ), 71,6 (C{-40 )) i un metilè oxigenat (δC 63,0 (C{-60 )). En els espectres de correlació d'enllaços múltiples heteronuclears de gradient (gHMBC), es va observar una correlació de llarg abast entre el senyal de protons anomèric (δH 5,15 (H{-10)) i el senyal de carboni quaternari oxigenat de l'aglicon (δC 83,0 (C). -20)), que indica que la -glucopiranosa estava enllaçada amb l'hidroxil de C-20 (figura 1).

A més, la correlació entre el senyal de protó metoxi (δH 3,18 (25-OCH3)) i el senyal de carboni quaternari oxigenat (δc 74,9 (C-25)) va indicar que el metoxi estava vinculat a C{{ 7}} (Figura 1). A partir de les dades anteriors, es va determinar que l'estructura química d'1 era 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahidroxi-25- methoxydammar-23-è i s'anomena ginsenòsid Rh23. Es va identificar que el compost 2 era 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroxydammar-23-è a partir de les comparacions de RMN i Dades de MS amb les informades a la literatura [23,24] (Figura 1). Els compostos 1 i 2 es van aïllar, per primera vegada, de HPGL.

Es va determinar que la puresa del ginsenòsid Rh23 era superior al 99 per cent mitjançant la normalització de les àrees màximes detectades per l'anàlisi UPLC. Com que s'ha demostrat que UPLC-OTOF/MS és una eina adequada per a la identificació del ginsenòsid Rh23, la separació dels components de l'extracte HPGL es va realitzar mitjançant UPLC-OTOF/MS en mode d'ions negatius. La figura 2 mostra un cromatograma d'ions totals (TIC) típic de ginsenòsid Rh23 i extracte amb detecció de massa.

Es va obtenir una corba de calibratge lineal per al ginsenòsid Rh23 a diferents nivells de concentració. Les característiques de les gràfics de calibratge es resumeixen a la taula 2. Tal com es veu a la taula, el ginsenòsid Rh23 mostra excel·lents coeficients de correlació. Els recomptes de detectors (àrea de pic relativa) depenien linealment de la concentració de la mostra en el rang de 0.02–0,8 µg/mL per al ginsenòsid Rh23. El LOD del ginsenòsid Rh23 va ser de 0.002 ppm. Es va determinar que el LOQ del ginsenòsid Rh23 era de 0,005 ppm per UPLC-QTOF/MS en mode d'ions negatius. La quantitat de ginsenòsid Rh23 al HPGL obtingut mitjançant mètodes de validació (taula 2) va ser de 0,319 mg/g.

Per determinar l'activitat anti-melanogènica, es va estudiar el canvi en el contingut de melanina en cèl·lules melan-a tractades amb compostos purificats i identificats. Les cèl·lules Melan-a es van tractar durant 72 h amb els compostos 1 i 2 a concentracions que oscil·laven entre 0 i 80 µM i es va avaluar la viabilitat cel·lular mitjançant un kit d'assaig de viabilitat cel·lular CCK-8. La viabilitat cel·lular dels compostos 1 i 2 a una concentració de 80 µM per a la cèl·lula melan-a va ser superior al 98,1% i al 97,8%, respectivament (dades no mostrades). Aquests resultats van indicar que els compostos 1 i 2 tenen una naturalesa no citotòxica. L'efecte de les activitats anti-melanogèniques dels compostos es mostra a la figura 3. La inhibició de la síntesi de melanina del compost 1 a 20, 40 i 80 µM va ser del 8,4%, 15,6% i 37,0% en comparació amb el control. El compost 2 va mostrar una activitat inhibidora lleugerament menor que el compost 1 al 7,6%, 12,8% i 17,8% a 20, 40 i 80 µM, respectivament. Tots dos compostos van inhibir la síntesi de melanina de manera dependent de la dosi.

En particular, el compost 1 va mostrar l'activitat inhibidora de la melanina més alta, un 37,0 per cent a una concentració de 80 µM. Segons s'informa, l'extracte de radix ginseng a 0-1000 µg/ml no va mostrar cap inhibició significativa de la melanina [19] i l'àcid cinàmic, un agent blanquejador que es troba principalment a P. ginseng, va mostrar una inhibició del 29 per cent de la síntesi de melanina a 675 µM. [20]. En comparació amb l'extracte de radix ginseng i àcid cinàmic, el compost 1 va mostrar una potent activitat inhibidora de la síntesi de melanina i fins i tot va mostrar una activitat inhibidora de la síntesi de melanina 1,2- vegades més gran a una concentració vuit vegades més baixa en comparació amb l'àcid cumàric [ 17,20].

El peix zebra és un organisme model de vertebrats molt avantatjós a causa dels seus sistemes d'òrgans i seqüències de gens similars als éssers humans [25]. A més, l'ús d'embrions de peix zebra està rebent una atenció creixent, ja que es consideren un mètode de substitució per a experiments amb animals [26]. El peix zebra té pigments de melanina a la superfície, cosa que permet una observació senzilla del procés de pigmentació sense procediments experimentals complicats [27].

Així, vam investigar els efectes inhibidors de la melanina del compost 1 sobre la pigmentació del peix zebra. Hem utilitzat PTU (N-feniltiourea; un inhibidor de la tirosinasa que conté sofre) com a control positiu (figura 4B), que s'utilitza àmpliament en la investigació del peix zebra [28, 29]. Com es mostra a la figura 4C, D, 40 i 80 µM, el tractament amb el compost 1 va produir una inhibició notable de la pigmentació del cos del peix zebra, que va disminuir notablement el contingut total de melanina en comparació amb el vehicle de control (figura 4A).

En aquest estudi, hem aïllat el nou ginsenòsid Rh23 (1) de fulles de P. ginseng hidropònics. Així, s'han reportat més de 100 ginsenòsids d'espècies de ginseng. Tanmateix, els 25-ginsenòsids hidroxilats rarament apareixen a la natura, incloses les plantes de ginseng. A més, no s'havia informat d'activitat de blanqueig. L'activitat inhibidora del ginsenòsid Rh23 va mostrar un 37 per cent a la concentració de 80 uN sense citotoxicitat cel·lular a les cèl·lules melan-a, mentre que el ginsenòsid Rh23 no va observar cap inhibició de l'activitat tirosinasa de bolets in vitro (dades no mostrades). Recentment, s'ha demostrat que els extractes o ginsenòsids purificats d'arrels i fulles de ginseng posseeixen àmpliament propietats antioxidants (30,31), mentre que l'aigua o l'extracte orgànic de ginseng ha mostrat activitats de depuració cap al DPPH, l'anió superòxid i el radical hidroxil (32). Per tant, el nostre nou ginsenòsid Rh23 aïllat de les fulles de P. ginseng hidropònic pot tenir una tirosinasa regulada a la baixa per la seva propietat antioxidant. Tanmateix, encara no s'ha investigat el seu paper en la melanogènesi. Per tant, en un estudi posterior, és necessari determinar els mecanismes precisos de l'acció del ginsenòsid Rh23 sobre la regulació de la síntesi de melanina.

3. Experimental

3.1. General

Les resines Kieselgel 60 i LiChroprep RP-18 es van utilitzar per a la cromatografia en columna (Merck, Darmstadt, Alemanya). Kieselgel 60 F254 (Merck) i RP-18 F254S (Merck) es van utilitzar com a fases sòlides per a l'experiment TLC. La detecció de taques a la placa TLC es va realitzar mitjançant l'observació sota una làmpada UV (Spectroline, model ENF-240 C/F, Spectronics Corp., Nova York, NY, EUA) o ruixant un 10% d'H2SO4 aquós al desenvolupat. placa seguida d'escalfament. Les rotacions òptiques es van mesurar amb un polarímetre digital JASCO P-1010 (Tòquio, Japó). Els punts de fusió es van obtenir mitjançant un aparell de punt de fusió Fisher-Johns (empresa científica Fisher, Pittsburgh, PA, EUA) amb un microscopi. Els espectres ultraviolats es van mesurar amb un espectrofotòmetre UV-1601 model Shimadzu (Shimadzu Corp., Kyoto, Japó). Els espectres IR es van obtenir a partir d'un espectròmetre FT-IR Perkin Elmer Spectrum One (Buckinghamshire, Regne Unit). Els espectres de RMN es van registrar en un espectròmetre Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, EUA). L'anàlisi UPLC-QTOF/MS es va realitzar mitjançant una sèrie Waters Xevo G2-S (Waters Corp., Milford, MA, EUA) que funcionava en mode d'ions negatius.

3.2. Materials vegetals

El ginseng hidropònic Panax es va cultivar a l'hivernacle del Departament d'Investigació de Cultius d'Herbes situat a Eumseong, província de Chungbuk, segons el protocol de la "guia de cultiu estàndard GAP de ginseng" [11,33] desenvolupada per l'Administració de Desenvolupament Rural, República de Corea. Es van comprar arrels de plàntules de ginseng d'un any d'antiguitat amb un pes de 0, 8 a 1 g al Departament d'Investigació de Cultius d'Herbes, Institut Nacional de Ciències Hortícoles i Herbes (NIHHS), l'Administració de Desenvolupament Rural (RDA) i es van emmagatzemar en un cambra a baixa temperatura (1-2 ◦C) abans de l'ús. Les arrels de les plàntules de ginseng es van trasplantar a banys de nutrients i es van cultivar en el sistema hidropònic. Després de tres mesos de cultiu, es van treure els ginsengs hidropònics per a la collita. Les plantes de ginseng hidropònics collides es van netejar de pols amb aigua i es van classificar en fulles i arrels, que després es van assecar durant 72 h en un assecador de congelació (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Corea). Es va dipositar un exemplar de val (NIHHS14-03) a l'herbari del Departament d'Investigació de Cultius d'Herbes, NIHHS, RDA, Eumseong, República de Corea.

3.3. Extracció i aïllament

Les fulles seques i en pols de P. ginseng hidropònic (HPGL, 6 kg) es van extreure amb un 80 per cent de MeOH (30 L × 3) a temperatura ambient durant 24 h. Els extractes es van filtrar a través de paper de filtre i es van evaporar a pressió reduïda a 45 ◦ C per produir 1,4 kg d'extracte. L'extracte es va abocar en H2O (3L) i es va extreure amb EtOAc (3 L × 3) i n-BuOH (2,6 L × 3), successivament. Cada capa es va concentrar a pressió reduïda per obtenir fraccions EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) i H2O (855 g).

La fracció n-BuOH (HPGLB, 130 g) es va aplicar a la columna de gel de sílice (φ 13 × 17 cm) i es va eluir amb CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42}). } L → 6:4:1, 110 L) per produir 20 fraccions (HPGLB1 a HPGLB20). Les fraccions HPGLB3 i HPGLB4 es van combinar (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0,12) i es van fraccionar més sobre la columna de gel de sílice (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) per produir 14 fraccions (HPGLB3-1 a HPGLB3-14). Les fraccions HPGLB3-4 i HPGLB3-5 es van combinar (1,27 g, Ve/Vt {{4{0}},09–0,16) i es van fraccionar més sobre la columna ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) per produir nou fraccions (HPGLB3-4-1 a HPGLB3-4-9). La fracció HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0,14–0,26) es va fraccionar encara més sobre la columna ODS (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1: 1, 1 L) per produir nou fraccions (HPGLB3-4-3-1 a HPGLB{3-4-3-9) inclòs el compost 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0,42–0,55, TLC Rf=0,40 (RP{-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Les fraccions HPGLB5 a HPGLB7 es van combinar (24,0 g, Ve/Vt=0.12–0,22) i es van fraccionar més sobre la columna de gel de sílice (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) per produir 16 fraccions (HPGLB5-1 a HPGLB5-16). La fracció HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0,28–0,31) es va fraccionar encara més sobre la columna ODS (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3: 2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) per produir deu fraccions (HPGLB5-6-1 a HPGLB{5-6-10) inclòs el compost 2 (HPGLB{5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 0,21–0,23, TLC Rf=0,50 (RP{-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf {= 0,45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Dades espectroscòpiques

Compost 1. Pols blanca, pf: 138–140 ◦C; [ ] 25 D més 17,4◦ (c=0,39, MeOH); IR (finestra CaF2): 3377, 2932, 1382 cm−1; QTOF/MS negatiu m/z 713,44723 [M més COOH]− (calculat per a C37H64O10, 668,4499); Dades de RMN 1H i 13C, vegeu la taula 1.

Compost 2. Pols blanca, pf: 133–136 ◦C; [ ] 25 D més 20,2◦ (c=0,50, MeOH); IR (finestra CaF2): 3359, 2929, 1384 cm−1; QTOF/MS negatiu m/z 699,48311 [M més COOH]− (calc. per a C36H62O10, 654,4323); dades de RMN 1H- i 13C, vegeu la taula 1.

3.5. Anàlisi quantitativa del nou compost 1 mitjançant UPLC-QTOF/MS

Es va preparar una solució estàndard del compost 1 dissolent 1,00 mg cadascuna en 1 mL de metanol per obtenir una concentració d'1,{00 mg/mL i es va mantenir a 4 ◦C. La solució d'estoc estàndard (1) es va diluir amb metanol per obtenir solucions de calibratge amb intervals de 0.{{10}}2-0,8 µg/mL, respectivament. Es va pesar amb precisió un gram d'extracte HPGL i es va dissoldre en volums fixos (10 ml) de metanol, es va filtrar a través d'un paper de filtre de 0,2{0 mm i es va refrigerar a 4 ◦C. . La UPLC es va realitzar mitjançant una UPLC Waters ACQUITY H-Class (Waters Corp., Milford, MA, EUA) amb una columna ACQUITY BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Les fases mòbils consistien en aigua (A) amb un 0,1% d'àcid fòrmic (v/v) i acetonitril (B) amb un 0,1% d'àcid fòrmic (v/v). El gradient d'elució va ser el següent: 0-4 min, B 10-30 per cent; 4–15 min, B 30–60 per cent; 15–16 min, B 60–100 per cent; 16–19 min, B 100–10 per cent . El cabal era de 0,45 ml/min i el volum d'injecció era de 2 μL per a cada cursa.

A continuació, es va realitzar l'anàlisi HR-MS mitjançant un Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, EUA) que funcionava en mode d'ions negatius. Els espectròmetres de masses van realitzar exploracions alternades d'alta i baixa energia conegudes com a mode d'adquisició MSE. Es van obtenir mesures precises de massa mitjançant un sistema de lliurament de calibratge automatitzat que conté leucina encefalina, m/z 554,262 (mode ESI neg.) com a referència interna. Els paràmetres de funcionament òptims es van establir tal com es mostra a la taula 3.

3.6. Cultiu cel·lular

Els melanòcits Melan-a són una línia cel·lular normal de melanòcits murins altament pigmentada i immortalitzada derivada de ratolins C57BL/6. Les cèl·lules melan-a utilitzades en aquest estudi es van obtenir de la doctora Dorothy Bennett (Hospital St. George, Londres, Regne Unit). Les cèl·lules es van cultivar a 37 ◦ C en una atmosfera de 95 per cent d'aire, 10 per cent de CO2 en medi RPMI 1640 complementat fins a una concentració final amb sèrum fetal boví inactivat per calor al 10 per cent, 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina i 200 nM de PMA. La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant el kit de recompte de cèl·lules CCK-8-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japó).

3.7. Assaig de melanina

Les cèl·lules Melan-a es van tractar amb compostos durant 72 h, i després les cèl·lules es van dissoldre en NaOH 1 N a 60 ◦ C durant 30 min. A continuació, es van mesurar els lisats a 450 nm mitjançant un espectrofotòmetre. Les dades es van normalitzar al contingut de proteïnes dels lisats cel·lulars. Els lisats cel·lulars es van processar posteriorment per a la determinació de la concentració de proteïnes mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EUA).

3.8. Origen i manteniment dels peixos parentals

Els peixos zebra adults es van obtenir d'un distribuïdor comercial i es van mantenir de 10 a 15 peixos en un dipòsit acrílic de 5 L amb les condicions següents: 28, 5 ◦ C, amb un cicle de llum/foscor de 14/10 h. Els peixos zebra es van alimentar tres vegades al dia, sis dies a la setmana, amb aliments en escates TetraMin complementats amb gambes de salmorra vives (Artemia salina). Els embrions es van obtenir a partir de la posta natural que es va induir al matí en encendre la llum. La recollida d'embrions es va completar en 30 minuts. Tots els protocols i procediments experimentals es van aprovar i es van dur a terme d'acord amb les directrius i reglaments aprovats del Comitè d'Ètica Animal de la Universitat Nacional de Chungnam (CNU-00866).

3.9. Tractament de compostos i avaluació basada en fenotips

Els embrions sincronitzats es van recollir i ordenar amb pipeta (7-9 embrions per pou en 24-plaques de pou que contenien 1 ml de medi embrionari). Els compostos de prova es van dissoldre en 0,1 per cent de DMSO i després es van afegir al medi embrionari de nou a 72 h després de la fecundació (hpf) (63 h d'exposició). Els efectes sobre la pigmentació del peix zebra es van observar sota l'estereomicroscopi. L'agitació ocasional, així com una substitució del medi, es va realitzar diàriament per garantir la distribució uniforme dels compostos. En tots els experiments, es va utilitzar 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU) per generar peix zebra transparent sense interferir en el procés de desenvolupament [33] i es va considerar un control positiu estàndard. Les avaluacions basades en fenotips de la pigmentació corporal es van decorionar mitjançant pinces, anestesiades en una solució de metanosulfonat de tricaïna (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), muntada en un 3% de metilcel·lulosa en un plat de 35 mm (SPL Lifesciences, Pocheon, Corea), i fotografiat sota l'estereomicroscopi MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanya).

4. Conclusions

En aquest estudi, el ginsenòsid Rh23 (1) es va aïllar de fulles hidrofòniques de Panax ginseng juntament amb 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroxidamar{10}}è (2). En general, hem tingut èxit en el nostre intent d'obtenir l'efecte hipopigmentari dels compostos de P. ginseng hidropònic. El ginsenòsid Rh23 i el 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25-pentahidroxidammar23-è tenen activitats inhibidores de la biosíntesi de melanina sense efectes citotòxics a la cèl·lula melan-a. A més, el ginsenòsid Rh23 va millorar la despigmentació del peix zebra com a model animal alternatiu. La disminució del contingut de melanina i la pigmentació del cos pot tenir el potencial d'activitat de blanqueig i l'efecte no citotòxic és el punt més favorable perquè la seguretat és una consideració principal per als agents blanquejants en productes cosmètics.

Per tant, basant-nos en els nostres resultats actuals, és important que es puguin utilitzar nous compostos hidrofònics de P. ginseng com a agent potencial d'il·luminació de la pell eficaç. Estudis posteriors dilucidaran els mecanismes precisos de l'acció del ginsenòsid Rh23 sobre la regulació de la síntesi de melanina i la relació entre les característiques estructurals del ginsenòsid Rh23 i la melanogènesi, per determinar si és un agent blanquejador potencial per a la indústria cosmètica. Els avantatges de l'espectrometria de masses Q-TOF híbrida inclouen no només la capacitat de detecció de qualitat i la sensibilitat, sinó també la mesura precisa, facilitant les dilucidacions estructurals. Es pot utilitzar per a la determinació qualitativa i quantitativa de compostos menors o nous, que ajuda a millorar el control de qualitat de les espècies de ginseng.

Materials complementaris:

Els espectres 1H-NMR i 13C-NMR d'1 estan disponibles als materials suplementaris.

Agraïments:

Aquest treball es va dur a terme amb el suport del "Programa de recerca cooperativa per al desenvolupament de la ciència i la tecnologia agrícola" (PJ01136203), Administració de Desenvolupament Rural, República de Corea. Donem les gràcies a Cheol-Hee Kim (Universitat Nacional de Chungnam) per compartir la instal·lació del peix zebra.

Contribucions de l'autor:

DYL i N.-IB van concebre i dissenyar els experiments; H.-GK i Y.-GL van aïllar els compostos; DYL va dilucidar les estructures; I.-BJ va contribuir a la preparació de materials vegetals; JHK va realitzar l'assaig biològic i va ajudar amb la preparació del manuscrit; JWL i B.-RC van realitzar les RMN, i UPLC-QTOF/MS de les mostres; G.-SK va col·laborar en la revisió del manuscrit; i DYL van escriure el document i van gestionar el projecte de recerca. Tots els autors van llegir i van aprovar el manuscrit final.

Conflictes d'interès:

Els autors declaren que no hi ha conflictes d'interessos. Els patrocinadors fundadors no van tenir cap paper en el disseny de l'estudi; recollida, anàlisi o interpretació de les dades; redacció del manuscrit; o la decisió de publicar els resultats.

Referències

1. Ben, EW; Michael, W. Plantes medicinals del món. En Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, EUA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Activitats biològiques i química de saponines de Panax ginseng CA Meyer. Fitoquímica 2005, 4, 159–175. [Ref creuat]

3. Kwon, SJ; Chung, DK L'efecte que millora el sistema immunitari del ginseng de muntanya, el ginseng de muntanya i el ginseng Panax. J. Orient. Neuropsiquiatria 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Farmacologia del ginseng Panax: un enllaç d'òxid nítric? Bioquímica. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [Ref creuat]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Efecte de l'extracte de metanol de ginseng solar sobre la lesió hepàtica induïda per lipopolisacàrids en rates. Phytomedicine 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Efectes del compost K sobre la hiperglucèmia i la resistència a la insulina en rates amb diabetis mellitus tipus 2. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Efectes del ginsenòsid Rg3 i Rh2 sobre la proliferació de cèl·lules canceroses de pròstata. Arc. Farmàcia. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Les propietats afrodisíaques i adaptogèniques del ginseng. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [Ref creuat]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Activitats antioxidants i antitumorals de promoció de l'extracte de metanol de ginseng processat per calor. Càncer Lett. 2000, 150, 41–48. [Ref creuat]

10. Kim, GS; Lee, SE; No, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Efectes dels productes bioactius naturals sobre el creixement i el contingut de ginsenòsids del ginseng Panax cultivat en un sistema aeropònic. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Comparació del contingut d'ingredients fenòlics i ginsenòsids en fulles, fruites i arrels de ginseng cultivades hidropònicament. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Estudis de fàrmacs de cutícules de fonts naturals. II. Efectes inhibidors de les plantes Prunus sobre la biosíntesi de melanina. Biol. Farmàcia. Bou. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Efecte del nitrit de sodi, clorur de sodi i nitrat de sodi sobre la germinació i el creixement d'espores anaeròbies. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. Un nou estilbè amb activitat inhibidora de la tirosinasa de Chlorophora sobresurt. Chem. Farmàcia. Bou. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Parc, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Jo, identificació; Park, KC Terrin: un nou inhibidor de la melanogènesi i el seu mecanisme. Cèl·lula. Mol. Life 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Fill, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Efectes inhibidors de l'àcid cinàmic sobre la biosíntesi de melanina a la pell. Biol. Farmàcia. Bou. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Anàlisi quantitativa de compostos fenòlics en diferents parts de Panax ginseng CA Meyer i el seu efecte inhibidor sobre la biosíntesi de melanina. coreà J. Med. Cultiu Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Efecte del radix ginseng i radix trichosanthis sobre la melanogènesi. Biol. Farmàcia. Bou. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Jo, KM; Jo, YO Comparació del contingut de compostos fenòlics entre el ginseng blanc i el vermell i el seu efecte inhibidor sobre la biosíntesi de melanina. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Cançó, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Anàlisi de ginsenòsids de baixa polar en ginseng Panax al vapor a alta temperatura mitjançant HPLC-ESI-MS/MS. Chem. Res. Barbeta. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Transformacions químiques induïdes per vapor i avaluació de la qualitat holística del ginseng vermell derivat del ginseng Panax mitjançant empremta digital de quantificació multicomponent basada en HPLC-ESI-MS/MSn. J. Agric. Química dels Aliments. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MEU; Yang, B.; Jin, YR Tres noves saponines triterpèniques de tipus dammarane de les fulles de Panax ginseng CA Meyer. J. Asiàtic Nat. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Comprehensive HILIC x RPLC amb detecció d'espectrometria de masses per a l'anàlisi de saponines a Panax notoginseng. Analista 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Amor, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR Tecnologia per a pantalla d'alt rendiment: el present i el futur amb peix zebra. Curr. Opina. Biotecnologia. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Els embrions de peix zebra com a alternativa als experiments amb animals: un comentari sobre la definició de l'inici de l'etapa de vida protegida en la normativa de benestar animal. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish com a nou model de cribratge basat en fenotips de compostos reguladors melanogènics. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB La feniltiourea altera la funció de la tiroide en el desenvolupament del peix zebra. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; No, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI El potencial dels ginsenòsids menors aïllats de les fulles de Panax ginseng com a inhibidors de la melanogènesi. Int. J. Mol. Ciència. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Home, RY Panax quinquefolium saponines protegeix les lipoproteïnes de baixa densitat de l'oxidació. Ciència de la vida. 1999, 64, 53–62. [Ref creuat]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosides en arrels i fulles de ginseng americà. J. Agric. Química dels Aliments. 1996, 44, 717–720. [Ref creuat]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Parc, MW; Cho, HY Propietats antioxidants de diversos extractes dissolvents de fulles de ginseng salvatge. LWT 2006, 39, 266–274. [Ref creuat]

32. Institut Nacional de Ciències dels Cultius. Directriu estàndard de cultiu de ginseng GAP; National Institute of Crop Science, Rural Development Administration: Suwon, Corea, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Generació de peix zebra transparent: un mètode refinat per millorar la detecció de l'expressió gènica durant el desenvolupament embrionari. Mar. Biotecnologia. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Disponibilitat de mostra:

Les mostres dels compostos 1 i 2 estan disponibles als autors.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 i Nam-In Baek 2,*

1 Departament d'Investigació de Cultius d'Herbes, Institut Nacional de Ciències Hortícoles i Herbes, RDA, Eumseong 27709, Corea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Departament de Biotecnologia de Medicina Oriental, Universitat Kyung Hee, Yongin 17104, Corea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Rebut: 28 de novembre de 2017; Acceptat: 26 de gener de 2018; Publicat: 29 de gener de 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com