Efectes antiinflamatoris sinèrgics de l'extracte de Laminaria Japonica Fucoidan i Cistanche Tubulosa

Com a resposta immune contra antígens estrangers, els macròfags alliberen citocines proinflamatòries com el factor de necrosi tumoral (TNF-), la interleucina-1 (IL{- 1), IL-6 i altres. Aquestes citocines indueixen una afluència quimiotàctica de granulòcits, monòcits, limfòcits i mastòcits al teixit danyat que afavoreix l'eliminació d'antígens i la recuperació del teixit. Tanmateix, l'excés d'infiltració i activació de les cèl·lules agreuja les lesions dels teixits, provocant edemes (exsudació vascular) i dolors que són fenòmens d'inflamació ben coneguts.

El TNF- és un factor important per induir l'expressió gènica de l'òxid nítric sintasa (iNOS) en diverses línies cel·lulars. L'activació d'iNOS condueix a la producció d'òxid nítric (NO) que no només modula diverses funcions fisiològiques com ara bactericida i vasodilatació, sinó que també provoca inflamació. Després de lesions tissulars, la degradació per fosfolipases dels fosfolípids de la membrana cel·lular genera àcid araquidònic. L'àcid araquidònic es descomposa encara més per la ciclooxigenasa (COX) en prostaglandines (PG). Una quantitat excessiva de PGE2 formada per COX-II indueix diverses citocines per a la inflamació. Atès que tant el NO com el PGE2 actuen com a factors principals per a la inflamació i la inducció del dolor, les vies TNF--NO i COX-II-PGE2 són els principals fluxos del procés inflamatori, que són inhibits pels corticoides i els no esteroides.fàrmacs antiinflamatoris(AINE), respectivament.

Tot i que hi ha diversos esteroides i AINE perla teràpia de malalties inflamatòries, aquests fàrmacs poden donar lloc a efectes adversos sobre el sistema immunitari, el tracte gastrointestinal, els ronyons, el fetge, el sistema nerviós central, la pressió arterial i el sistema cardiovascular. Per tant, cal minimitzar els efectes adversos de la terapèutica química substituint-los o utilitzant-los en combinació amb productes naturals.

Fucoidan, un complex polisacàrid de sulfat d'algues marines com Laminaria japonica i Cladosiphon okamuranus àmpliament distribuït a molts països, s'ha utilitzat com a terapèutica en la medicina oriental durant un llarg període. En estudis anteriors, s'ha demostrat que el fucoidan té efectes antioxidants, anticoagulatius, anticancerígens iactivitats antiinflamatòries. En conseqüència, els efectes beneficiosos del fucoidan sobre les malalties inflamatòries, la isquèmia, la disfunció immune i els tumors estan cridant l'atenció dels investigadors. Per altra banda,Cistanche tubulosa(TC) també s'ha utilitzat àmpliament com a medicament tradicional a la Xina. Es va informar que els extractes de TC redueixen la producció de TNF-á i IL- 4, que són factors principals per a la producció de NO a les vies inflamatòries [19].

Aquestes troballes anteriors ens van portar a investigar l'eficàcia combinada del fucoidan i l'extracte de TC en les 2 vies principals d'inflamació. Per dilucidar el mecanisme d'acció, vam analitzar NO i PGE2 en els exsudats de la inflamació de la bossa d'aire induïda per carragenina.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER PREVENIRACTIVITATS INFLAMATORIESPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materials i mètodes

Materials

Fucoidan semi-purificat i extracte d'aigua de CT es van obtenir de Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Corea). El fucoidan i l'extracte de CT es van mantenir a 4 graus, es van barrejar (1:3) dissolts en aigua purificada abans de l'ús i es van administrar per via oral en un volum de 5 ml/kg.

Cultiu cel·lular i quantificació de NO

La línia cel·lular de macròfags murins RAW 264.7 es va comprar a la American Type Culture Collection (Manassas, EUA) i es va cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (Sigma, St. Louis, EUA) que contenia un 10% de sèrum fetal boví i antibiòtics [100 U/mL. penicil·lina (Sigma) i estreptomicina 100 µg/mL (Sigma)]. Les cèl·lules es van incubar en una atmosfera humidificada al 5% de CO2 a 37 graus.

Per avaluar els efectes del fucoidan i l'extracte de CT sobre la secreció de NO, es van incubar cèl·lules RAW 264,7 (1 × 106 cèl·lules/mL) amb fucoidan o extracte de CT (1-320 µg/mL) durant 5 min. , seguit d'interferó (IFN-, 10 U/mL) i lipopolisacàrid (LPS, 10 µg/mL) durant 24 hores. En els nostres estudis preliminars, es va confirmar que el tractament amb IFN-plus LPS per a l'activació de cèl·lules RAW 264.7 no va afectar la viabilitat de les cèl·lules fins a 24 hores i que l'extracte de fucoidan i CT no eren citotòxics fins a 1 mg/mL. La concentració de nitrit (NO2 – ), el producte oxidat del NO, es va mesurar com a indicador del NO. El medi de cultiu es va barrejar amb un volum igual de reactiu de Griess (1% de sulfanilamida, 0,1% de naftil etilendiamina en un 2,5% d'àcid fosfòric) [21] i es va incubar a temperatura ambient durant 10 min. La concentració de nitrits es va analitzar a 540 nm, on es va utilitzar NaNO2 per generar una corba estàndard.

Animals i tractament

Els ratolins ICR mascles (7 setmanes d'edat) es van comprar a Daehan Biolink (Eumseong, Corea) i es van allotjar en una habitació amb condicions ambientals constants (22±2ºC; 40-70% d'humitat relativa; 12-hora de llum). -cicle fosc; 150-300 lux brillantor). L'alimentació de pellets i l'aigua purificada estaven disponibles ad libitum. Tots els experiments amb animals van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals (IACUC) de la Universitat Nacional de Chungbuk (CBNU), Corea, i es van dur a terme d'acord amb els Procediments d'Operació Estàndard (SOP) del Centre de Recerca d'Animals de Laboratori, CBNU.

Els ratolins (n{0}}/grup) van ser tractats oralment amb fucoidan (18 o 54 mg/kg), extracte CT (54 o 162 mg/kg) o la seva barreja (18+54, {{6 }} o 90+270 mg/kg) un cop al dia durant 7 dies. Les dosis baixes de fucoidan (18 mg/kg) i extracte de CT (54 mg/kg) provenien de dosis humanes estimades de 100 mg/cos (70 kg) i 300 mg/cos després de la translació de la superfície del pes corporal (Km{14). }} per a humans/Km=3 per a ratolí), respectivament. Les dosis altes de fucoidan i extracte de CT es van fixar en 3 vegades, sols o en barreja, i la mescla de dosi més alta es va fixar en 5 vegades per avaluar els efectes sinèrgics màxims.

El primer dia del tractament amb fucoidan i extracte de CT, els ratolins es van injectar per via subcutània amb 10 ml d'aire estèril a la part posterior per formar una bossa [22, 23]. Després de 2 i 5 dies, es va tornar a injectar la bossa amb 5 ml d'aire. Una hora després del tractament final, es va injectar a la bossa 1 ml de carragenina (1% en solució salina; Sigma) o el seu vehicle (solució salina).

Anàlisi dels exsudats

La bossa d'aire es va rentar amb 1 ml de solució salina freda 6 hores després de la injecció de carragenina i es va registrar el volum net de líquid de rentat. El nombre total de cèl·lules inflamatòries, neutròfils, monòcits i limfòcits es va determinar mitjançant un comptador de copes. Les concentracions de NO i PGE2 es van determinar mitjançant el reactiu de Griess (Sigma) i l'immunoassaig enzimàtic (EIA) mitjançant un kit Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), respectivament.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A L'ACCIÓ BLOCADORA DE LA QUIMIOTAXI DE CEL·LULES INFLAMATORIES PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Exploració histopatològica

Es va retirar el teixit que recobria la bossa i es va fixar en una solució de formalina neutra. Les diapositives de teixit incrustades en parafina es van tacar amb hematoxilina-eosina i es van examinar amb un microscopi lleuger per detectar les lesions inflamatòries.

Anàlisi estadística

Els resultats es presenten com a mitjana ± SE. Les comparacions de grups experimentals es van fer mitjançant una anàlisi unidireccional de la variància seguida d'una correcció de prova de Tukey. Valor AP<0.05 was considered statistically significant.

Resultats

In vitro, el cultiu de cèl·lules RAW 264.7, el tractament amb IFN i LPS van augmentar molt la producció de NO (figura 1). El pretractament amb fucoidan (1–320 µg/mL) no va afectar l'alliberament de NO de la línia cel·lular dels macròfags (figura 1A). En comparació, l'extracte CT (32-320 µg/mL) va suprimir significativament la producció de NO, cosa que indica una activitat antiinflamatòria (figura 1B).

La injecció de carragenina a la bossa d'aire del ratolí va augmentar notablement el volum d'exsudat dins de la bossa (figura 2). Aquest augment de l'exsudació es va atenuar amb el tractament amb fucoidan (18 mg/kg) i extracte CT (54 i 162 mg/kg). En particular, el tractament combinat de fucoidan i extracte de CT va disminuir encara més el volum dels exsudats, en comparació amb els efectes individuals, tot i que les combinacions de dosis més altes (54+162 mg/kg i 90+270 mg/kg) no van mostrar una eficàcia addicional. a la combinació de dosis més baixa (18+54 mg/kg) (figura 2A). El grau N a la bossa també va augmentar dràsticament després de la injecció de carragenina (figura 2B). En comparació amb l'efecte lleu del fucoidan, l'extracte de TC va reduir notablement la concentració de grau N. El tractament combinat de fucoidan i extracte de CT va reduir encara més el nivell de NO de manera dependent de la dosi. De la mateixa manera, l'augment del contingut de PGE2 es va suprimir sinèrgicament per la teràpia combinada de fucoidan i extracte de CT (figura 2C).

Paral·lelament als mediadors inflamatoris de la bossa, el nombre de cèl·lules inflamatòries va augmentar dràsticament amb la injecció de carragenina: 37, 8, 4, 8 i 24, 1 vegades dels nivells de control de neutròfils, monòcits i limfòcits, respectivament (taula 1). Tanmateix, el fucoidan i l'extracte de CT van reduir significativament la infiltració de cèl·lules inflamatòries, en què el fucoidan era una mica superior a l'extracte de CT. Inesperadament, no es va aconseguir cap efecte sinèrgic en la infiltració de cèl·lules inflamatòries mitjançant la coadministració de fucoidan i extracte de CT.

Tal com es dedueix de la infiltració de cèl·lules inflamatòries als exsudats, el teixit subcutani que envoltava les bosses d'aire presentava lesions inflamatòries greus (figura 3). Es van observar moltes cèl·lules del teixit subcutani engrossit exposades a carragenina (figura 3B), en comparació amb les característiques gairebé normals dels animals control (figura 3A). Aquestes lesions inflamatòries es van atenuar notablement pel tractament amb fucoidan (figures 3C i 3D) o extracte de TC (figures 3E i 3F).

En particular, es van obtenir efectes antiinflamatoris més alts mitjançant la teràpia combinada amb fucoidan i extracte de CT (figures 3G-3I).

Discussió

Utilitzant un model d'inflamació de la bossa d'aire induïda per arrageenan en grau, la injecció d'aire a l'esquena dels rosegadors indueix la proliferació de cèl·lules que s'estratifiquen a la superfície de la cavitat per formar una estructura similar a la sinovi. En aquest model, la injecció de la infiltració de cèl·lules inflamatòries induïda per carragenina va augmentar l'exsudat, cosa que és indicativa de fuga vascular. La bossa d'aire serveix com a dipòsit de cèl·lules inflamatòries i mediadors que es poden mesurar fàcilment en el líquid que s'acumula localment.

Entre els diversos mediadors inflamatoris que poden induir permeabilitat vascular, és ben sabut que el NO i la PGE2 són factors principals implicats en la patogènesi de moltes malalties inflamatòries. També es coneixen com a mediadors de la inducció i la percepció del dolor. iNOS, que s'expressa i s'activa en diversos tipus de cèl·lules mitjançant l'estimulació amb TNF i/o LPS durant la inflamació, produeix concentracions elevades i persistents de NO. El NO és una molècula reguladora important en diverses funcions fisiològiques, com la vasodilatació que condueix a la fuga vascular. La PGE2, que es genera a partir de l'àcid araquidònic mitjançant COX, contribueix al desenvolupament de moltes malalties inflamatòries, i la sobreproducció de PGE2 en resposta a diverses estimulacions inflamatòries s'associa amb la regulació dels nivells de COX-II i la progressió de la inflamació. Per tant, les vies TNF- - NO i COX-II-PGE2 s'han considerat com dos corrents principals de processos inflamatoris, que estan bloquejats pels inhibidors de iNOS (corticosteroides) i COX (AINE), respectivament.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A PROHIBICIÓ DE MALALTIES INFLAMATORIES PHGS75% ECH 30% ACT 12%

En el present estudi, la coadministració de fucoidan i extracte de CT va reduir el volum d'exsudat a la bossa, cosa que suggereix que posseeixen una activitat supressiva contra les fuites vasculars (figura 2A). En comparació amb els efectes individuals de cada extracte de fucoidan i CT, el tractament combinacional va augmentar encara més, la qual cosa implica que l'acció de dos graus composa de manera sinèrgica. Aquests efectes sinèrgics entre el fucoidan i l'extracte de CT van ser recolzats per les seves activitats sobre els nivells de NO i PGE2 als exsudats (figures 3B i 2C).

Curiosament, però, es va confirmar que el fucoidan no inhibeix directament l'activació dels macròfags en l'assaig in vitro (figura 1A). De la mateixa manera, el potencial inhibidor del fucoidan en l'assaig in vivo d'acumulació de NO i PGE2 va ser relativament inferior al de l'extracte CT (figures 2B i 2C). Aquest mecanisme d'acció del fucoidan és diferent d'una inactivació directa de les cèl·lules per extracte de CT (figura 1B). En comparació, el fucoidan va exercir una alta eficàcia en la inhibició de la infiltració de cèl·lules inflamatòries a les bosses (taula 1). El fucoidan va ser superior a l'extracte de CT en bloquejar la migració de neutròfils, monòcits i limfòcits als llocs de lesions tissulars induïdes per carragenina. Curiosament, no hi va haver cap efecte anti-migratori sinèrgic, indicatiu de diferents mecanismes d'acció entre el fucoidan i l'extracte CT: és a dir, el fucoidan bloqueja la infiltració de cèl·lules inflamatòries, mentre que l'extracte CT inhibeix l'activació de les cèl·lules.

Les cèl·lules polimorfonuclears, especialment els neutròfils, són els principals components cel·lulars reclutats als llocs inflamatoris aguts induïts per la carragenina. A més, les cèl·lules inflamatòries següents, com els macròfags i els limfòcits, també tenen un paper central en el procés inflamatori mitjançant la secreció de citocines. Quan es va tractar prèviament amb fucoidan o extracte de CT, el nombre de glòbuls blancs que van migrar a les bosses d'aire injectades amb carragenina es va suprimir notablement. Aquest resultat va ser coherent amb un efecte que s'obtindrien amb corticoides com la dexametasona, però no pels AINE, inclosa la indometacina. Per tant, se suposa que l'extracte de fucoidan i CT tenen en part una propietat dels esteroides.

A més de l'acció de bloqueig de la quimiotaxi de les cèl·lules inflamatòries, l'extracte de TC semblava suprimir l'activació dels macròfags. Això es va confirmar per les seves accions inhibidores sobre el NO in vitro i in vivo, que és el principal mediador inflamatori produït pels macròfags. Així, l'efecte de l'extracte de CT sobre els macròfags podria ser degut a una supressió de l'expressió d'ARNm i/o a una inhibició directa de l'activitat iNOS en aquestes cèl·lules.

PGE2 també és un dels principals mediadors inflamatoris. Augmenta paral·lelament a l'edema dels teixits, que és suprimit pels AINE, inhibidors de la COX. La carragenina pot augmentar la producció de PGE2 induint l'ARNm de la COX-II i la proteïna COX-II a l'exsudat de la bossa. En aquest model, la carragenina va augmentar significativament la quantitat de PGE2 i es va suprimir substancialment per l'extracte CT. És interessant assenyalar que aquest resultat era coherent amb un efecte que obtindria una indometacina AINE. Per tant, dels resultats es dedueix que l'extracte de TC té propietats addicionals dels AINE. En conjunt, es creu que l'extracte de TC va exercir efectes tant corticosteroides com AINE en el model d'inflamació induïda per carragenina i que el fucoidan va millorar elefectes antiinflamatoris de l'extracte de TCbloquejant la infiltració de cèl·lules inflamatòries.

Tot i que la definició del mecanisme d'acció exacte requereix un estudi addicional, una barreja de fucoidan i extracte de CT va atenuar notablement els signes inflamatoris bloquejant les vies TNF--NO i COX-II-PGE2 en la inflamació de la bossa d'aire induïda per carragenina. Aquestes troballes proporcionen proves que el tractament combinat de fucoidan i extracte de TC podria ser un candidat prometedor per alleujar diversos tipus d'inflamació que responen als corticoides o AINE.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A PROHIBICIÓ DE MALALTIES INFLAMATORIES PHGS75% ECH 30% ACT 12%