La proteïna secretora rica en cisteïna conservada MaCFEM85 interacciona amb MsWAK16 per activar les defenses de les plantes
Oct 26, 2023
Resum: Metarhizium anisopliaeés un fong entomopatògen que pot millorar el creixement i la resistència de les plantes quan actua com a endòfit en les plantes hostes. No obstant això, es coneix poc sobre les interaccions de proteïnes o els seus mecanismes d'activació. Les proteïnes de la membrana extracel·lular dels fongs (CFEM) comuns s'han identificat com a reguladors immunològics de les plantes que suprimeixen o activen les respostes de resistència de les plantes. Aquí, vam identificar una proteïna que conté domini CFEM, MaCFEM85, que es va localitzar principalment a la membrana plasmàtica. Els assajos de dos híbrids (Y2H), de glutatió-S-transferasa (GST) i de complementació de fluorescència bimolecular van demostrar que MaCFEM85 va interactuar amb el domini extracel·lular d'unMedicago sativaproteïna de membrana (alfals), MsWAK16. Les anàlisis d'expressió gènica van mostrar que MaCFEM85 i MsWAK16 estaven significativament regulatsM. anisopliaeiM. sativa, respectivament, de 12 a 60 h després de la co-inoculació. Els assaigs addicionals de dos híbrids de llevats i la mutació específica del lloc d'aminoàcids van indicar que el domini CFEM i la cisteïna 52a eren específicament necessaris per a la interacció de MaCFEM85 amb MsWAK16. Els assajos de la funció de defensa van demostrar que la JA estava regulada, però la mida de la lesió de Botrytis cinerea i la reproducció de Myzus persicae es van suprimir mitjançant l'expressió transitòria de MaCFEM85 i MsWAK16 a la planta hoste model Nicotiana benthamiana. Col·lectivament, aquests resultats proporcionen noves idees sobre els mecanismes moleculars subjacents a les interaccions de M. anisopliae amb les plantes hostes.
Beneficis del suplement de cistanche: augmenta la immunitat
Paraules clau: cinasa associada a la paret; CFEMs; Metahizium anisopliae; immunitat de les plantes; Medicago sativa
1. Introducció
Les interaccions entre plantes i microbis estan molt esteses i són el resultat de la coevolució passada i en curs. Aquestes interaccions poden tenir resultats beneficiosos, neutrals o adversos per a cada participant [1–3]. La microbiota rizosfèrica beneficiosa pot millorar el creixement de les plantes i millorar la salut general protegint-se de les malalties transmeses al sòl o millorant l'absorció de nutrients [4,5]. Una àmplia gamma de microbis beneficiosos poden millorar les capacitats de les plantes, com ara l'absorció de nutrients, el creixement i les defenses de patògens i insectes [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın és un gènere important de fongs entomopatògens amb la capacitat de colonitzar plantes [8], però també hi ha proves que suggereixen que els membres del gènere poden millorar la resistència als patògens de les plantes. Per exemple, un estudi de laboratori va trobar una inhibició del 60% de Fusarium solani (Mart.) Sacc. en presència de Metarhizium robertsii (abans conegut com M. anisopliae) en comparació amb controls sense M. robertsii [9]. Algunes soques de Metarhizium tenen el potencial de millorar la resistència de les plantes a plagues i malalties d'insectes alterant l'expressió dels gens de defensa de les plantes. La colonització endofítica amb M. Roberts activa l'expressió de les vies de defensa tant de l'àcid jasmònic (JA) com de l'àcid salicílic (SA) a les fulles de blat de moro; a més, aquesta colonització s'associa amb la promoció del creixement de les plantes i la supressió del desenvolupament de larves d'Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense va activar la -1,{3-glucanasa i la quitinasa a la pela del fruit de Lansium parasiticum, donant lloc a la inhibició del creixement de Botrytis sp. i Fusarium sp. sobre el fruit d'Aglaia dookkoo Griff [11]. A més, quan es va aplicar M. anisopliae a les plàntules de cacauet, es van activar diversos factors de transcripció com WRKY, MYC, TGA i factors de transcripció sensibles a l'etilè, mentre que els transportadors de nitrats i les proteïnes que uneixen elements sensibles a la deshidratació també es van expressar de manera diferent [12] . Això suggereix que M. anisopliae regula els gens de defensa de les plantes mentre colonitza la planta. No obstant això, es coneix relativament poc sobre els mecanismes subjacents a les respostes de defensa de les plantes després de la infecció per Metarhizium. Els efectors són un mitjà comú pel qual els microorganismes regulen la resistència de les plantes [13]. L'activació de la resistència de les plantes normalment es caracteritza per una explosió oxidativa i la inducció d'hormones, metabòlits i altres senyals [13]. Les hormones vegetals SA i JA tenen un paper important a l'hora d'induir la resistència de les plantes, mediant dues vies de senyalització de defensa separades [14]. La via de senyalització SA funciona principalment en la resposta al·lèrgica de les plantes i en la resistència sistèmica adquirida als patògens, però també pot estar implicada en les respostes indirectes de defensa de les plantes induïdes per l'alimentació d'insectes picants [15]. L'acumulació de SA s'associa amb una major expressió de gens que codifiquen proteïnes de transferència de lípids (LTP) i fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) [16], que medien la síntesi i l'acumulació de metabòlits especialitzats aigües avall com els flavonoides i la lignina [17]. La via de senyalització JA funciona en respostes directes i indirectes a danys mecànics, patògens fúngics i plagues d'insectes. Els estudis han demostrat que la senyalització JA té un efecte regulador sobre la síntesi de metabòlits especialitzats com els terpenoides, fenilpropanoides i alcaloides, que tenen una àmplia gamma de funcions biològiques [18]. S'ha demostrat que alguns metabòlits especialitzats s'acumulen a les cèl·lules vegetals després del tractament amb metilJA (MeJA), incloent paclitaxel en espècies de Taxus [19,20], terpenoides a Centella Asiatica (L.) Urban [21] i saponines en ginseng [22] . L'aplicació de SA i quitosà (CHT) com a elicitadors va induir l'acumulació de lignina i les reaccions enzimàtiques de defensa als tomàquets, la qual cosa va reduir la incidència de la infecció de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. A més, els nivells de JA i SA al blat es van acumular significativament mitjançant l'aplicació de l'elicitor PeaT, millorant la resposta de defensa al pugó de la civada Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Això indica que la immunitat de les plantes podria ser regulada per aquests efectors mitjançant hormones vegetals i metabòlits.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Les proteïnes comuns a la membrana extracel·lular dels fongs (CFEM) estan presents en una àmplia gamma de fongs. Codifiquen dominis que solen tenir una longitud de 60 aminoàcids (aa) i contenen vuit cisteïnes espaciades de manera característica [25]. Els dominis CFEM són similars als dominis semblants al factor de creixement epidèrmic (EGF), que funcionen com a receptors extracel·lulars, transductors de senyal o molècules d'adhesió en les interaccions hoste-patogen [26]. Les proteïnes que contenen dominis CFEM poden manipular la resposta de resistència de les plantes actuant com a efectors. En el fong de rovell de la fulla de blat Puccinia triticina Erikas, el candidat efector CFEM PTTG_08198 va accelerar el progrés de la mort cel·lular i va promoure l'acumulació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) [27]. El fong antracnosi Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils conté cinc efectors (CgCFEM6, 7, 8, 9 i 15) que s'ha demostrat que suprimeixen la mort cel·lular programada induïda per BAX a Nicotiana benthamiana Domin [28]. Es va informar que el fong micorízic fitosimbiòtic Laccaria bicolor (Maire) PDOrton secretava diverses proteïnes CFEM, com ara Lac310796, Lac296573 i Lac296572, en teixits simbiòtics [29]. Tot i que les funcions complexes d'aquestes proteïnes no s'han estudiat més en la simbiosi micorízica, els resultats anteriors suggereixen que les proteïnes CFEM poden funcionar en la senyalització entre fongs i plantes. M. anisopliae pot funcionar com a fong entomopatògen o endofític en una planta hoste [30]. Tanmateix, encara no s'han informat els papers de les proteïnes CFEM. Prèviament vam identificar una proteïna que conté dominis CFEM a M. anisopliae, MaCFEM85 (ID GenBank: MZ682609) [31]. Aquí, informem sobre la relació entre MaCFEM85 i la cinasa associada a la paret de Medicago sativa MsWAK16. Vam analitzar la seqüència MaCFEM85 i vam realitzar experiments per determinar quins residus són crítics per a la interacció amb MsWAK16. Finalment, utilitzant N. benthamiana com a planta model, vam avaluar les respostes de defensa de les plantes a Botrytis cinerea i al pugó Myzus persicae amb i sense expressió transitòria de MaCFEM85 i MsWAK16.
Beneficis de cistanche tubulosa-enfortir el sistema immunitari
Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity
【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Resultats
2.1. MaCFEM85 estava més estretament relacionat amb els CFEM fúngics no patògens i es va localitzar a la membrana plasmàtica
Es va construir un arbre filogenètic per analitzar les relacions entre MaCFEM85 i altres proteïnes CFEM de fongs model patògens i no patògens. Aquests inclouen Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl.), Neurospora crassa Shear & BODodge i Beauveria bassiana (Bals.) (vegeu la secció 4). MaCFEM85 estava més estretament relacionat amb les proteïnes CFEM de B. bassiana i, per tant, evolutivament més proper als fongs no patògens que als patògens (figura 1a).
Figura 1a
2.2. MaCFEM85 es va regular a l'alça durant les interaccions amb M. sativa
Les cinases semblants a receptors associades a la paret (WAK) representen un subgrup dins de la superfamília de proteïnes cinases semblants a receptors (RLKs) i inclouen un domini extracel·lular, una hèlix transmembrana i un domini quinasa intracel·lular. Tenen un paper important en la regulació del creixement, desenvolupament, resposta a l'estrès i vies de senyalització de resistència als patògens [32]. L'ARN es va extreure de les hifes de M. anisopliae i les arrels de M. sativa després de la co-incubació per investigar els patrons d'expressió de MaCFEM85 i MsWAK16. Tant MaCFEM85 com MsWAK16 es van expressar a nivells significativament més alts durant la co-incubació de 12 a 6 0 h (figura 1c, d). De 0 a 36 h, l'expressió de MaCFEM85 va augmentar gradualment, assolint el màxim a les 36 h. Va ser × 593 vegades més altament expressat en la combinació de M. anisopliae i M. sativa en comparació amb M. anisopliae cultivada sol. Tot i que l'expressió de MaCFEM85 es va reduir lleugerament en el període de 48 a 60 h, encara es va expressar a nivells significativament més alts que en M. anisopliae cultivat sol. MsWAK16 també es va regular significativament, amb un màxim d'expressió a les 36 h. En M. sativa infectat amb M. anisopliae, MsWAK16 estava × 89,06 vegades més altament expressat que en M. sativa sense M. anisopliae. De 36 a 60 h, els nivells de MsWAK16 van disminuir lleugerament, però la seva expressió encara era significativament superior a la de les plantes no inoculades.
2.3. MaCFEM85 interactua amb MsWAK16 in vitro i in vivo
Per investigar el mecanisme funcional potencial de MaCFEM85 en resposta al tractament amb M. anisopliae, es va realitzar una pantalla de dos híbrids de llevats (Y2H) per identificar de manera preliminar les proteïnes hoste que interaccionen amb MaCFEM85. La interacció entre el domini extracel·lular de MsWAK16 (MsWAK16-ED) i MaCFEM85 es va examinar amb un assaig de dos híbrids de llevats un a un utilitzant MaCFEM85 a pGBKT7 com a vector BD i MsWAK16 a pGADT7 com a vector AD. Tot el llevat transformat va créixer bé en un medi deficient SD-T/L, i el grup de control positiu i el grup experimental van créixer amb èxit en un medi deficient SD-T/L/H/A + X- -gal. Això indicava que MaCFEM85 podria interactuar amb MsWAK16-ED (figura 2a).
Figura 2. Validació de la interacció entre MaCFEM85 i MsWAK16.
Per a la validació in vitro, es va inserir a pGEX6-P2 etiquetat amb glutatió-S-transferasa (GST) MsWAK{3}}ED (codificació d'un producte de 60 kDa) i MaCFEM85 marcat amb polihistidina (His). que codificava un producte de 17 kDa) es va inserir en pET-21b. La immunotranslació amb anticossos His i GST va demostrar que la proteïna recombinant MaCFEM85-His va interactuar amb la presa GST-MsWAK16-ED però no només amb GST i que GST-MsWAK16- ED va interactuar amb His -MaCFEM85 (Figura 2b). Per confirmar encara més la interacció entre MaCFEM85 i MsWAK16, vam realitzar un assaig de complementació de fluorescència bimolecular (BiFC) amb construccions MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC. La coexpressió de MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC a les fulles de tabac va generar un senyal de fluorescència groc, que indica que MaCFEM85 va interaccionar amb MsWAK16 (figura 2c).
2.4. Llocs clau per a les interaccions MaCFEM85 i MsWAK16
Per definir la regió de MaCFEM85 que es requereix per a la interacció amb MsWAK16-ED, es van predir dominis proteics amb el programari en línia SMART (figura 3a). MaCFEM85 contenia un domini CFEM a la regió 19-86 aa. També es va predir l'estructura terciària (figura 3b). Les vuit cisteïnes d'aquest domini van donar lloc a quatre enllaços disulfur (CYS26 i CYS69, CYS30 i CYS64, CYS43 i CYS50, i CYS52 i CYS85), mantenint l'estabilitat de la proteïna (figura 3b). Per validar els llocs d'interacció putatius a MaCFEM85, es van generar set versions mutades de la proteïna i es van inserir a pGBKT7 com a proteïnes d'esquer. Cada vector recombinant es va co-transfectar amb AD-MsWAK16-ED a la soca Y2H Gold. La soca amb CYS52 mutat no va créixer en medis selectius (figura 3c, esbossat en vermell), cosa que indica que CYS52 és necessari per a la interacció de MaCFEM85 amb MsWAK{25}}ED.
2.5. La interacció de MaCFEM85 amb MsWAK16 activa la resposta immune de la planta
2.5.1. Avaluació del paper de MaCFEM85 i MsWAK16 en la resistència a la malaltia contra B. cinerea
Per explorar la possible implicació de MaCFEM85 i MsWAK16 en les respostes de defensa de patògens, vam examinar si la sobreexpressió de MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85 i MsWAK16 podria conferir una major resistència a B. cinerea. Aquests vectors els vam expressar de manera transitòria en fulles de N. benthamiana. Un assaig de Western blot va demostrar que MaCFEM85 i MsWAK16 s'expressaven a nivells comparables quan s'expressaven sols o junts, cosa que demostra que MaCFEM85 i MsWAK16 es van expressar amb èxit en el tabac (figura 4a). També es van realitzar assajos de malalties amb N. benthamiana infiltrat amb MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 o el control GFP. Les lesions eren significativament més petites (un ~ 30% als 2 dies després de la inoculació) a les fulles infiltrades amb MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 en comparació amb les plantes control (figura 4b). Aquestes dades demostren que l'expressió transitòria de MaCFEM85 a N. benthamiana va conferir una major resistència a B. cinerea i que MaCFEM85 i MsWAK16 van regular positivament la resposta de defensa contra B. cinerea.
Figura 3. Identificació del lloc d'interacció entre MaCFEM5 i MsWAK16.
Figura 4. Inducció de la resistència de les plantes per expressió transitòria de MaCFEM85 i MsWAK16.
2.5.2. Avaluació del paper de MaCFEM85 i MsWAK16 en la defensa dels pugons a N. benthamiana
Per investigar més el paper de MaCFEM85 i MsWAK16, les plantes de N. benthamiana que expressaven de manera transitòria MaCFEM85 i MsWAK16 es van infestar amb M. persicae i es van avaluar les poblacions. Per a aquest experiment, una gran àrea de cada fulla de N. benthamiana es va agroinfiltrar amb el vector binari recombinant pYBA1132 que conté MaCFEM85 i MsWAK16. Es va utilitzar GFP com a control. A les 12 h després de la infiltració, 20 adults de M. persicae van ser engabiats a cada fulla, exposant la zona infiltrada als pugons. En els tres dies següents, es va registrar la mortalitat de pugons adults i el nombre de nimfes; llavors les nimfes van ser eliminades. No hi va haver cap diferència significativa en el risc de mortalitat entre les poblacions de M. persicae que s'alimentaven de plantes que expressaven MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3,65827, DF=3, p <0,30081). ) (Figura 4c). Tanmateix, a les 24, 48 i 72 h, el nombre mitjà de descendència produïda per cada pugó adult era significativament més gran a N. benthamiana que expressava el control GFP en comparació amb els que expressaven MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 (figura 4d).
2.5.3. Avaluació del paper de MaCFEM85 i MsWAK16 en l'acumulació d'hormones i l'expressió gènica relacionada amb les hormones
Per analitzar les diferències entre les respostes de defensa de les plantes de N. benthamiana que expressen eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16, vam mesurar els nivells de JA, SA i flavonoides totals, i l'expressió de gens relacionats. Els resultats van mostrar que els nivells de JA i SA difereixen entre les plantes que expressaven eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 i MaCFEM 85+MsWAK16 (figura 5a). En comparació amb els que expressaven eGFP, els nivells de JA eren significativament inferiors a les plantes que expressaven MaCFEM85; Els nivells de SA van augmentar lleugerament, però les diferències no van ser significatives. En canvi, les plantes que expressaven MsWAK16 no van mostrar diferències significatives en els nivells de JA en comparació amb el control eGFP, mentre que els nivells de SA eren significativament més baixos que en el control (figura 5a). Els nivells de JA i SA van augmentar i disminuir significativament, respectivament, a les plantes que expressaven MaCFEM85+MsWAK16 en comparació amb eGFP.
Figura 5. Nivells hormonals i expressió gènica de resposta hormonal
El contingut total de flavonoides va ser significativament més gran a les plantes que expressaven MaCFEM85+MsWAK16 en comparació amb la resta de grups de tractament (figura 5a). Els nivells d'expressió gènica biosintètica eren similars a les plantes que expressaven MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16. Per exemple, els gens relacionats amb la resposta JA, és a dir, COI1, MYC2 i PDF1.2, es van regular significativament en comparació amb les plantes que expressaven GFP (figura 5b). De la mateixa manera, els gens relacionats amb SA NPR1, WRKY70 i PR1 es van expressar de manera significativament diferent en plantes que expressaven MsWAK16 i MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 es va regular a l'alça, mentre que WRKY70 i PR1 es van reduir en comparació amb el control (figura 5b). També vam examinar l'expressió de gens clau en les vies de síntesi de l'àcid shikimic i dels fenilpropanoides, que estan relacionades amb la síntesi de flavonoides. En general, l'expressió de MaCFEM85 sola no va induir una expressió significativament més alta d'aquests gens en el tabac. Tanmateix, aquests gens es van regular en el tabac que expressava MsWAK16 o MsWAK16+MaCFEM85 en comparació amb el control GFP (figura 5c).
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
3. Discussió
3.1. El motiu de proteïna CFEM conservada serveix per a múltiples funcions en espècies de fongs
El domini CFEM és exclusiu dels fongs i es troba habitualment en proteïnes de membrana extracel·lular dels fongs. El domini es va originar en l'ancestre comú més recent d'Ascomycota i Basidiomycota [33]. Investigacions recents han demostrat que les proteïnes CFEM en patògens fúngics poden actuar com a reguladors immunològics de les plantes, provocant la supressió o l'activació immune de la planta hoste en funció del tipus d'infecció [28,34,35]. Hi ha hagut pocs informes de proteïnes que contenen domini CFEM a M. anisopliae, només en el context d'una comparació evolutiva amb altres fongs [36]. En aquest estudi, hem comparat les proteïnes CFEM de M. anisopliae amb altres proteïnes CFEM conegudes tant en fongs patògens com no patògens. Vam confirmar que l'homòleg més proper de MaCFEM85 és Cfem5 que es troba a Beauveria bassiana, una de les 12 proteïnes CFEM d'aquesta espècie (figura suplementària S1). BbCfem5 és essencial per a l'adquisició de ferro [37]. A més, a partir de l'estructura terciària prevista, el domini CFEM a MaCFEM85 és molt similar a la proteïna de l'antigen de superfície 2 (CSA2) que es troba a Candida albicans (CPRobin) Berkhout, en la qual s'han modelat 65 residus (96% de la seqüència) amb 99,8. % de confiança [31]. Candida albicans és un patogen animal; CSA2 té un paper important en el creixement i la patogenicitat en extreure hemo de l'hemoglobina i transportant hemo de la paret cel·lular al plasma [38-40]. Presentem la hipòtesi que MaCFEM85 pot estar implicat en la virulència de M. anisopliae dels hostes d'insectes. Aquestes funcions combinades de MaCFEM85 en la infecció patògena animal i l'activació de la immunitat de les plantes fan que la proteïna sigui un focus d'investigació futur emocionant.
3.2. Els enllaços disulfur són estructures importants per a la funció de les proteïnes
La integritat conformacional d'una estructura proteica està directament relacionada amb la seva capacitat de funcionar. Els enllaços disulfur formats per parells de cisteïna promouen el plegament de proteïnes i l'estabilitat conformacional i es considera que formen llocs clau per al reconeixement i la unió de receptors o lligands específics [41]. Per exemple, la interrupció de qualsevol dels tres enllaços disulfur conservats a la proteïna efectora AVR4 del patogen vegetal Cladosporium fulvum dóna lloc a una sensibilitat a la proteasa i una capacitat d'unió de quitina reduïda [42]. En altres tres proteïnes de C. fulvum (ECP1, ECP2 i ECP5), les substitucions simples d'alanines per cisteïnes esmorteeixen la resposta hipersensible del tomàquet, cosa que indica que les cisteïnes són fonamentals per mantenir l'estabilitat i l'activitat induïdora de resposta hipersensible [43]. A més, a la proteïna madura MC69 de Magnaporthe oryzae, la mutagènesi de dos residus de cisteïna conservats (Cys36 i Cys46) pot afectar la funció de MC69 sense afectar la secreció, cosa que suggereix la importància de l'enllaç disulfur específicament en la patogenicitat de MC69 [44]. El domini CFEM sembla ser similar en mida i en el patró de residus de cisteïna als dominis semblants a EGF, que contenen tres o quatre parells d'enllaços disulfur. Les proteïnes EGF poden funcionar com a receptors de la superfície cel·lular, transductors de senyal o molècules d'adhesió en les interaccions hoste-patògen [45]. En aquest estudi, no només vam trobar que el domini CFEM de MaCFEM85 contenia vuit cisteïnes conservades que formaven quatre parells d'enllaços disulfur (figura 3b), sinó que també vam validar que CFEM era el domini crític per a la interacció entre MaCFEM85 i MsWAK16. A més, mitjançant la mutació dirigida al lloc dels residus de cisteïna a alanina, vam trobar que el residu de cisteïna a la posició 52 era el lloc central necessari per a la interacció (figura 3c). Aquests resultats proporcionen una base per a estudis posteriors de les funcions fisiològiques de la interacció CFEM85-WAK16.
3.3. La interacció de MaCFEM85 amb les defenses de plantes activades MsWAK16
En les interaccions microbiana-planta, les respostes de defensa de les plantes generalment són activades per proteïnes efectores microbianes. La defensa induïda s'està convertint en una eina important en el control biològic de plagues per promoure la resistència. Les proteïnes CFEM s'han identificat com a efectors implicats en la regulació de l'activació o inhibició immune de les plantes [28,46]. No obstant això, hi ha poca investigació publicada que vinculi la regulació d'aquests factors immunitaris amb els seus papers específics en les malalties de les plantes i la resistència als insectes. En aquest estudi, hem utilitzat un fong entomopatògen i endofític, M. anisopliae, per identificar una interacció entre MaCFEM85 i una cinasa associada a la paret cel·lular, MsWAK16, a M. sativa. Els resultats van mostrar que aquesta interacció va reduir la proporció de lesions després de la inoculació amb B. cinerea (Figura 4b) i va disminuir la taxa de creixement de la població de M. persicae (Figura 4d), cosa que indica que la interacció entre MaCFEM85 i MsWAK16 va augmentar la resistència de M. sativa als pugons. Els canvis en els nivells de JA, SA i etilè (ET) es poden utilitzar com a marcadors per avaluar la inducció de la resistència de les plantes [47,48]. Aquí, vam demostrar que MaCFEM85 va interactuar amb MsWAK16 per influir en la resistència de les plantes mitjançant la regulació hormonal i per inhibir la taxa reproductiva de M. persicae (figura 4d). Estudis similars s'han informat anteriorment. Per exemple, es va demostrar que la proteïna efectora PeBL1 de Brevibacillus laterosporus indueix l'acumulació de JA i SA als tomàquets i disminueix la taxa de creixement de les poblacions de segona i tercera generació de M. persicae que s'alimentaven d'aquestes plantes. A més, les plantes de tomàquet ruixades amb efectors tenen un efecte repel·lent sobre M. persicae [49]. L'aplicació de la proteïna elicitor PeBC1 a la mongeta comuna (Phaseolus vulgaris L.) condueix a efectes subletals pronunciats i significatius sobre els pugons del préssec verd. Les plantes tractades amb PeBC1 mostren una regulació positiva significativa dels gens relacionats amb JA i SA [50]. L'elicitador PeBb1 de Beauveria bassiana redueix la fecunditat de M. persicae en el tabac i indueix l'expressió de gens relacionats amb JA i ET [51]. En el present estudi, l'expressió transitòria de MaCFEM85 i MsWAK16 al tabac va augmentar significativament els gens relacionats amb la resposta JA COI1, MYC2 i PDF1.2 (figura 5b) i va augmentar el contingut de JA i flavonoides total (figura 5a), que era comparable als resultats. a la literatura tal com s'ha descrit anteriorment. Tanmateix, no vam detectar nivells elevats de SA al tabac 12 hores després de la infiltració, i les plantes que expressaven transitoriment MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 van mostrar nivells de SA significativament reduïts i una regulació a la baixa dels gens implicats en la resposta SA (figura 5a, b) . Això va demostrar que l'estimulació de diferents hormones vegetals pot conduir no només a activitats sinèrgiques, sinó també a diafons i retroalimentació, permetent que les plantes responguin adequadament a diferents estímuls. S'han informat anteriorment a les plantes un augment dels nivells de JA però nivells baixos de SA. Per exemple, en A. thaliana defectuosa per a l'acumulació de SA, els nivells de JA eren 25- vegades més alts que en A. thaliana de tipus salvatge, i es van activar gens sensibles a JA [52]. També s'ha informat que alguns bacteris poden augmentar els nivells de JA a les plantes per inhibir l'acumulació de SA, evitant el dany causat per SA. Per exemple, Pseudomonas syringae s'adreça al receptor COI1 a través d'una toxina, la coronatina, que regula negativament la via JA [53]. Això promou la regulació a l'alça induïda per MYC2- dels factors de transcripció ANAC019, ANAC055 i ANAC072 [54], inhibint la transcripció d'ICS1 (un gen clau per a la síntesi de SA) i, per tant, regulant a la baixa la producció de SA i la transducció del senyal. En el present estudi, la interacció entre MaCFEM85 i MsWAK16 va provocar un augment de l'acumulació de JA i la regulació de gens sensibles a JA, però la inhibició de l'acumulació de SA i la transcripció de gens relacionats amb SA. Això va indicar que la interacció entre MaCFEM85 i MsWAK16 va induir JA, millorant així la resistència de les plantes als pugons.
A N. benthamiana que expressava de manera transitòria MaCFEM85 i MsWAK16, es van augmentar els nivells de JA i es van reduir les mides de lesions de B. cinerea (figura 4b), d'acord amb estudis anteriors. La JA està implicada en la resistència de les plantes a insectes i patògens necròtròfics [52,55]. Com a patogen necròtrof, B. cinerea va ser inhibit per l'acumulació de JA i ET [56]. A l'eina mutant amb deficiència d'ET d'A. thaliana2-1 i al mutant de resposta JA coi1-1, els nivells del gen de defensa aigües avall, PDF1.2 es van reduir significativament i es va millorar la sensibilitat a B. cinerea [ 57]. Hem trobat aquí que l'acumulació i transcripció de JA de gens relacionats amb JA es van incrementar significativament a N. benthamiana expressant transitoriment MaCFEM85 i MsWAK16, mentre que es va inhibir l'acumulació de SA i la transcripció de gens relacionats amb SA. L'expressió MaCFEM85 i MsWAK16 també va mostrar un efecte inhibidor sobre B. cinerea. Això va indicar que JA va ser activat per MaCFEM85 i MsWAK16 i va tenir un paper destacat en la resistència de les plantes a B. cinerea.
4. Materials i Mètodes
4.1. Soques de fongs, materials vegetals i mètodes de cultiu
Les soques aïllades de Metarhizium anisopliae Ma 9 es van cultivar en medi de potato-sugar-agar (PSA) (20{0 g d'extracte de patata pelada bullida en aigua, 20 g de sacarosa i 15 g d'agar/L). La pols d'esporangi fresc es va recollir després de 10 d. Les plantes de Nicotiana benthamiana es van cultivar en una cambra de clima artificial amb un cicle de llum/foscor de 14/10 h (27/25 ◦C). Per a l'expressió gènica transitòria mitjançant la transformació mediada per Agrobacterium, la soca GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens es va cultivar en medi Luria Broth (LB) (10 g de triptona, 5 g d'extracte de llevat i 10 g de NaCl/L). La soca de llevat Gold (OE Biotech Co., Ltd., Xangai, Xina) es va cultivar en mitjà d'extracte de llevat peptona dextrosa (YPDA) (10 g d'extracte de llevat, 20 g de peptona, 20 g de glucosa i 0,03 g d'hemisulfat d'adenina/L). Per a cada vector i soca, es van utilitzar antibiòtics adequats, és a dir, rifampicina, kanamicina o ampicil·lina (25, 50 o 50 µg/mL, respectivament). Les soques i plasmidis utilitzats en aquest estudi es mostren a la taula complementària S1. Les llavors de Medicago sativa es van esterilitzar superficialment amb etanol al 75% durant 1 min, seguides de NaClO al 50% (5,5%) durant 15 min. Les llavors es van barrejar a fons i després es van rentar amb aigua estèril tres vegades durant 5 minuts cadascuna. Les llavors es van incubar a 4 ◦ C a la foscor durant més de 24 hores, després van germinar en plaques d'agar d'aigua a l'1% a temperatura ambient durant la nit. Tres dies després de la germinació, les plàntules en desenvolupament es van transferir a paper de filtre en plaques de Petri estèrils de 9-cm, amb 20 plàntules per plat. Els tractaments i el control es van assignar a 15 plats cadascun, respectivament. Les plàntules es van regar amb 10 ml de suspensió d'espores de M. anisopliae que contenia 107/ml, i el control es va regar amb 10 ml d'aigua estèril. A les 0, 12, 24, 48 i 60 h, es va prendre una selecció aleatòria de plàntules de tres plaques de Petri per a cada interval de temps. Les mostres es van congelar en nitrogen líquid i es van emmagatzemar a -80 ◦ C.
4.2. qRT-PCR i construcció de plasmidis
L'ARN total es va extreure de M. anisopliae (hifes) i M. sativa (arrels) amb reactiu TRIzol (Invitrogen, CA, EUA) seguint les instruccions del fabricant. La qualitat i l'abundància de l'ARN resultant es van mesurar amb un NanoPhotometer® (Implen, Münich, Alemanya). La síntesi d'ADNc de la primera cadena (fins a 2 ug d'ARN) es va realitzar mitjançant 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canadà) seguint les instruccions del fabricant. La qRT-PCR es va realitzar amb 2×SYBR Green qPCR Master Mix de la US EVER BRIGHT ® INC. i el sistema ABI QuantStudio 5 seguint les instruccions del fabricant. Els cebadors utilitzats per a cada gen es mostren a la taula complementària S2. Maury [58], Msactin [59] i Nbactin [60] es van utilitzar com a gens de referència interns per a la normalització de les dades d'expressió. La reacció es va realitzar en les condicions següents: 5 min a 95 ◦C, seguits de 40 cicles a 95 ◦C durant 15 s i a 60 ◦C durant 40 s. Hi havia tres rèpliques tècniques per a cada mostra. L'expressió relativa es va calcular mitjançant el mètode 2−∆∆Ct [61]. La significació estadística es va determinar mitjançant una anàlisi de variància unidireccional (ANOVA) i la prova de rang múltiple de Duncan a SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Expressió transitòria de proteïnes a N. benthamiana
La seqüència de codificació MaCFEM85 (CDS) es va amplificar amb ADN polimerasa d'ultra fidelitat utilitzant cDNA com a plantilla. Per als assajos de localització subcel·lular, els productes de PCR que contenien el CDS per MaCFEM85 es van clonar a pYBA1132-eGFP (digerit amb EcoRI i SalI) i cirera pcambia1300- (EcoRI i SacI), respectivament. Totes les construccions es van validar amb seqüenciació (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, Xina). Els primers utilitzats en aquest estudi es mostren a la taula complementària S2. Per a l'expressió transitòria de MaCFEM85-eGFP i MaCFEM85-mCherry a N. benthamiana, la soca GV3101 d'A. tumefaciens es va transformar amb cada plasmidi i es va verificar amb PCR. L'Agrobacterium es va cultivar durant la nit a 28 ◦ C amb agitació. Les cèl·lules es van recollir mitjançant una centrifugació de 5 min a 5000 rpm a temperatura ambient, es van rentar tres vegades amb aigua doble destil·lada estèril i es van tornar a suspendre en tampó MgCl2 10 mM (que contenia 10 mM MES i 10 mM acetosiringona, pH 5, 7). La suspensió cel·lular es va ajustar a una DO600 de 0,5, després es va infiltrar a la part inferior de les fulles de 4- a 5-N. benthamiana d'una setmana d'edat amb una xeringa de 1-ml. Cada fulla es va infiltrar amb 50 µL d'A. tumefaciens; es van tractar tres fulles per planta i es van tractar tres plantes a cada grup de tractament. Les fulles tractades es van recollir després de 30 h i es van visualitzar amb un microscopi confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Alemanya) per determinar la localització subcel·lular.
Els beneficis de cistanche per als homes enforteixen el sistema immunitari
4.4. Anàlisi filogenètica
Es va construir un arbre filogenètic mitjançant el mètode d'unió de veïns a MEGA X. 1000 rèpliques d'arrencada estaven utilitzant el model de distància P. Les seqüències d'aminoàcids utilitzades per generar l'arbre es van obtenir amb cerques BLASTP a la base de dades NCBI de fongs relacionats (per exemple, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus rose fumigatus, Lasiodiplodia, Glioclabroma, Glioclabroma). , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana i Paecilomyces lilacinus) utilitzant MaCFEM85 com a consulta.
4.5. Assajos de dos híbrids de llevats
El sistema de dos híbrids Matchmaker Gold Yeast (Clontech Laboratories, Inc.; ara Takara Bio USA, Inc.) es va utilitzar per verificar la interacció entre MaCFEM85 i MsWAK16. MaCFEM85 sense el pèptid senyal es va introduir a pGBKT7 com a esquer i el domini extracel·lular de MsWAK16 (MsWAK16-ED) es va inserir a pGADT7 com a presa. La preparació i les transformacions de cèl·lules competents en llevats es van realitzar mitjançant un Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, EUA) seguint les instruccions del fabricant. Els plasmidis d'esquer i preses es van co-transformar a la soca de llevat Gold. Les interaccions proteïna-proteïna es van analitzar en funció del creixement en plaques de medi d'abandonament doble SD (DDO, SD/-Trp-Leu) i medi d'abandonament quàdruple SD (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).
4.6. Assaig BiFC
Per generar les construccions BiFC, els vectors pUC-SPYNE i pUC-SPYCE es van linealitzar mitjançant la digestió amb BamHI. Els CDS de longitud completa de MaCFEM85 i MsWAK16 es van clonar cadascun i es van inserir als plasmidis linealitzats mitjançant un enzim recombinant per obtenir les construccions MaCFEM85-YFPN i MsWAK16-YFPC. Els plasmidis que contenien MaCFEM85 i MsWAK16 es van co-transformar amb vectors buits com a controls negatius (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE i pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Tots els vectors es van introduir a N. benthamiana mitjançant la transformació mediada per Agrobacterium tal com es descriu anteriorment. Es van observar senyals de fluorescència a les cèl·lules epidèrmiques de les fulles mitjançant un microscopi confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Alemanya). Els primers utilitzats per a la construcció de vectors es mostren a la taula complementària S2.
4.7. Assaig desplegable GST
Per als assajos desplegables GST, MsWAK16-ED es va inserir al vector pGEX-6P{-2 i MaCFEM85 es va inserir al pET-21b. Les proteïnes de fusió purificades (GST-MsWAK16- ED) i la pGEX-6P{-2 proteïna sense càrrega (GST) es van utilitzar com a proteïna d'esquer i pET purificat-21 La proteïna de fusió b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) es va utilitzar com a presa. Els assajos pulldown GST es van realitzar amb el sistema de purificació de proteïnes Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Xangai, Xina) seguint les instruccions del fabricant. Breument, les Mag-Beads es van rentar cinc vegades amb 1 × solució salina tamponada amb fosfat (PBS, pH 7,4) per alliberar el protector d'alcohol i després es van afegir 10 ml de GST o GST-MsWAK16-ED. Les perles es van barrejar per inversió a temperatura ambient durant 30 min. Després d'eliminar el sobrenedant, les Mag-Beads es van rentar cinc vegades amb 1 × PBS. His-MaCFEM85 es va afegir a Mag-Beads ja unides amb GST i la barreja es va incubar durant la nit a 4 ◦ C amb rotació. Les perles es van rentar cinc vegades amb 1 × PBS per eliminar les proteïnes no lligades. Posteriorment, les proteïnes immobilitzades a les perles es van separar mitjançant SDS-PAGE, es van transferir a una membrana de nitrocel·lulosa (100 V, 1 h) i es van analitzar mitjançant Western blot. Les membranes es van rentar tres vegades durant 10 minuts cadascuna amb PBS + Tween (PBST). Les membranes es van bloquejar durant 2 h a temperatura ambient amb llet desnatada al 5%, després es van incubar amb un anticòs monoclonal del ratolí ProteinFind anti-His (TransGen Biotech, Beijing, Xina) (diluït 1:3000) o un anticòs monoclonal del ratolí ProteinFind anti-GST per a 2 h a 4 ◦C. A continuació, les membranes es van submergir en anticòs IgG (H + L) (HRP) anti-conill de ProteinFind (TransGen Biotech, Beijing, Xina) (diluït 1:5000) durant 1 h a temperatura ambient. Les membranes es van visualitzar amb el kit EasySee® Western Blot (TransGen Biotech, Beijing, Xina) seguint les instruccions del fabricant.
4.8. Identificació del lloc clau a MaCFEM85
Per determinar la mida necessària per a la interacció de MaCFEM85 amb MsWAK16, es va realitzar una amplificació per PCR per generar múltiples formes truncades de MaCFEM85. El domini CFEM (MaCFEM85-CFEM; aa residus 19–86) i el terminal C sense el domini CFEM (MaCFEM85-C, aa residus 87–170) es van inserir al vector pGBKT7 com a proteïna d'esquer (taula suplementària S1). Es van construir altres cinc variants utilitzant la síntesi de polipèptids per mutar la cisteïna a alanina a les posicions 26, 30, 43, 52 i 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8530, ∆,CFEM8543/50/52/64/69/85). CFEM8552 i ∆CFEM858 tots, respectivament). Aquestes variants es van utilitzar per realitzar experiments Y2H amb MsWAK16-ED. Es va analitzar el creixement de les cèl·lules de llevat transformades en plaques SD/-Trp-Leu sintètiques i plaques SD/-Trp-Leu-His-Ade que contenien X- -galactosidasa (X- -Gal).
4.9. Assajos de resistència vegetal
Myzus persicae es van obtenir de Henan Quanying Biological Co., Ltd. Una setmana abans de l'inici dels bioassaigs, es van col·locar 150 pugons adults en tres plantes de N. benthamiana (50 pugons per planta). Després de 72 h, es van eliminar tots els adults amb un pinzell suau d'artista i es va deixar que les nimfes s'alimentessin durant quatre dies addicionals abans de ser transferides a N. benthamiana per als assajos de rendiment dels pugons.
4.10. Assajos de rendiment dels pugons
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) es va utilitzar per avaluar el rendiment de M. persicae, la resistència a les malalties de les plantes contra B. cinerea i l'expressió de gens relacionats amb les hormones. Els agrobacteris que portaven pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 o pYBA-MaCFEM 85+pYBA-MsWAK16 es van cultivar en LB complementat amb antibiòtics adequats durant 36 h a 28 ◦C. Les cèl·lules es van rentar tres vegades i després es van tornar a suspendre en tampó d'infiltració (MgCl2 10 mM, MES 10 mM i acetosiringona 100 µM, pH 5,6) fins a una DO600 de 0,6. Per a la coinfecció, els bacteris que portaven MaCFEM85 i MsWAK16 es van ajustar a una OD600 d'1, 2 i després es van barrejar en volums iguals. Les fulles totalment expandides es van infiltrar amb bacteris mitjançant xeringues sense agulles de 1-ml. Es van infiltrar tres fulles a cada planta i cada tractament es va aplicar a tres plantes per a un total de 12 plantes per experiment.
Per als assajos de rendiment de pugons, es van aplicar 20 pugons adults a la zona infiltrada de cada fulla 12 hores després d'aplicar l'Agrobacterium. Els pugons es van confinar amb gàbies de clip de 5 mm de diàmetre. Cada tractament es va repetir cinc vegades. La mortalitat de pugons adults i el nombre de nimfes acabades de posar es van registrar diàriament durant tres dies. B. cinerea es va cultivar durant cinc dies el PDAY. A les 12 h després de la infiltració d'Agrobacterium, la B. cinerea recentment conreada es va perforar en un pastís de fongs de 5- mm i la superfície de creixement del miceli es va unir a l'àrea d'infiltració a la superfície de la fulla. Per facilitar el desenvolupament de la malaltia, les plantes es van mantenir humides cobrint-les amb film plàstic en safates a 22 ◦C per facilitar la progressió de la malaltia. Després de 48 h, es va estimar el progrés de la malaltia a les fulles inoculades mesurant la mida de les lesions. Per quantificar l'expressió relativa dels gens rellevants, es van recollir les tres fulles infiltrades de cada planta 12 h després de la infiltració, després es van congelar en nitrogen líquid i es van emmagatzemar a -80 graus. L'extracció total d'ARN, la síntesi d'ADNc i la qRT-PCR es van realitzar tal com es descriu a la secció 3.2. Es van mesurar els nivells d'àcid salicílic (SA), àcid jasmònic (JA) i flavonoides en 15 fulles de N. benthamiana filtrades per tractament. Les fulles es van recollir, es van congelar en nitrogen líquid i després es van emmagatzemar a -80 graus. Les hormones vegetals es van quantificar mitjançant els kits ELISA d'àcid salicíclic vegetal i àcid jasmònic vegetal (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) i els flavonoides es van quantificar mitjançant el kit d'assaig de flavonoides de microplantes (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) instruccions del fabricant.
4.11. Anàlisi estadística
Les dades es van analitzar a SPSS v20.0. Es van determinar diferències significatives en els nivells d'expressió de MaCFEM85 i MsWAK16 mitjançant una prova t de Student. Es van determinar diferències significatives en els nivells de SA, JA i flavonoides mitjançant ANOVA unidireccional i la prova de rang múltiple de Duncan amb un llindar de p <0, 05.
5. Conclusions
En aquest estudi, vam identificar i caracteritzar una nova proteïna secretada, MaCFEM85, a M. anisopliae. Es va trobar que era un efector conservat que pot interactuar amb MsWAK16 i activar la resposta de defensa de N. benthamiana. Vam demostrar que el domini CFEM i el residu de cisteïna a la posició 52 a MaCFEM85 eren crítics per a la interacció. Aquesta interacció pot activar les respostes immunes relacionades amb la JA i els mecanismes resistents a les malalties i als insectes a la planta.
Referències
1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Col·laboracions entre plantes i microbis: implicacions per al creixement i la salut de les plantes. A Plant Microbe Symbiosi: Fundamentals and Advances; Springer: Berlín/Heidelberg, Alemanya, 2013; pàgines 105–117. [Ref creuat]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Desenvolupant interaccions planta-microbi: pot ajudar la transcriptòmica multiespècies? Tendències Biotecnologia. 2012, 30, 177–184. [Ref creuat]
3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Alimenta els teus amics: els exsudats de les plantes donen forma al microbioma de l'arrel? Tendències Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [Ref creuat]
4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Rizobacteris que promouen el creixement de les plantes. Ann. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [Ref creuat]
5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Resistència sistèmica induïda i respostes de les plantes als agents de biocontrol de fongs. Ann. Reverent Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [Ref creuat]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Canvis metabòlics i transcriptòmics induïts en Arabidopsis pel rizobacteri Pseudomonas fluorescens SS101. Physiol vegetal. 2012, 160, 2173–2188. [Ref creuat]
7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Comunicació arrel-microbe de plantes en la formació de microbiomes arrel. Planta Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [Ref creuat]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ El fong patògen d'insectes Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) també és un endòfit que estimula el desenvolupament de les arrels de les plantes. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [Ref creuat]
9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonisme del fong patògen d'insectes endofítics Metarhizium robertsii contra el patogen de les plantes de fesols Fusarium solanif. sp. phaseoli. Llauna. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [Ref creuat]
10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii promou el creixement del blat de moro, suprimeix el creixement d'insectes i altera l'expressió gènica de defensa de les plantes. Biol. Control 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Chairin, T.; Petcharat, V. Inducció de respostes de defensa a la fruita de Hong Kong (Aglaia dookkoo Griff.) contra els fongs de podridura de la fruita per Metarhizium guizhouense. Biol. Control 2017, 111, 40–44. [Ref creuat]
12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Resposta de les arrels de cacauet Arachis hypogaea a la presència de fongs beneficiosos i patògens mitjançant l'anàlisi del transcriptoma. Ciència. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Capítol 11: paper dels elicitadors de fongs en el mecanisme de defensa de les plantes. A Aspectes moleculars dels microbis beneficiosos per a les plantes a l'agricultura; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; Premsa acadèmica: Cambridge, MA, EUA, 2020; pàgines 143–158. [Ref creuat]
14. Dong, X.; Sa, JA Etilè i resistència a malalties en plantes. Curr. Opina. Biol vegetal. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Les vies de resposta de defensa depenent del jasmonat i depenent del salicilat en Arabidopsis són essencials per a la resistència a diferents patògens microbians. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine amoníaliasa (PAL) Promou les defenses antivirals contra el virus del mosaic Panicum i els seus satèl·lits. mBio 2021, 12, e03518-20. [Ref creuat]
17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Perfil d'expressió d'un gen PAL d'Astragalus membranaceus var. Mongholicus i el seu paper crucial en el flux a la biosíntesi de flavonoides. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [Ref creuat]
18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Maquinària transcripcional en el metabolisme secundari de les plantes provocades per jasmonats. Tendències Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [Ref creuat]
19. Mirjalili, N.; Linden, JC Efectes de la composició en fase gasosa en cultius en suspensió de Taxus cuspidata. Biotecnologia. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [Ref creuat]
20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Perfil transcripcional de cèl·lules de taxus chinensis en resposta al jasmonat de metil. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]
21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, PA; Dubery, IA Coneixements derivats de la metabolòmica sobre la manipulació de la síntesi de terpenoides a les cèl·lules de Centella asiàtica mitjançant jasmonat de metil. Biotecnologia vegetal. Rep. 2015, 9, 125–136. [Ref creuat]
22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Efectes de l'elicitació sobre la producció de saponina en cultiu cel·lular de Panax ginseng. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [Ref creuat]
23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, Alaska; Acharya, P. Respostes de defensa induïdes per elicitor a Solanum lycopersicum contra Ralstonia solanacearum. Ciència. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francesc, F.; Qiu, D. L'elicitador de proteïnes PeaT1 va millorar la resistència contra el pugó (Sitobion avenae) al blat. Gestió de plagues. Ciència. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Ampliació del paper fisiològic de l'helicasa DnaB hexamèrica. Tendències Bioquímica. Ciència. 2003, 28, 116–118. [Ref creuat]
26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Les tres proteïnes ancorades a GPI del domini CFEM d'Aspergillus fumigatus (CfmA-C) afecten l'estabilitat de la paret cel·lular però no tenen cap paper en la virulència dels fongs. Fongs. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [Ref creuat]
27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Identificació a tot el genoma de candidats efectors amb motius conservats del fong de rovell de la fulla del blat Puccinia triticina. Davant. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Anàlisi bioinformàtica i caracterització funcional de les proteïnes CFEM en el fong antracnosi del blat de moro Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agrícola. 2020, 19, 541–550. [Ref creuat]
29. Martín, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et al. El genoma de Laccaria bicolor proporciona informació sobre la simbiosi micorízica. Natura 2008, 452, 88–92. [Ref creuat]
30. Stefan, V.; Lara, RJ Fongs entomopatògens com a endòfits: interaccions planta-endofit-herbívor i perspectives d'ús en control biològic. Curr. Ciència. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Anàlisi bioinformàtica i caracterització funcional de les proteïnes CFEM de Metarhizium anisopliae. J. Fongs. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; i Kanyuka, K. WAKsing immunitat de les plantes, malalties minvant. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [Ref creuat]
33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Les anàlisis sistemàtiques revelen la singularitat i l'origen del domini CFEM en fongs. Ciència. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Un nou gen efector SCRE2 contribueix a la virulència total d'Ustilaginoidea virens a l'arròs. Davant. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, una proteïna que conté domini CFEM amb un lloc putatiu ancorat a GPI, està implicada en la patogenicitat, la producció de conidials i la tolerància a l'estrès a Botrytis cinerea. Davant. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Anàlisi comparativa a tot el genoma dels receptors putatius relacionats amb Pth11-acoblats a proteïnes G en fongs pertanyents a Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Les contribucions sistemàtiques del domini CFEM que conté proteïnes a l'adquisició de ferro són essencials per a la interacció entre espècies del fong patògen filamentos Beauveria bassiana. Entorn. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Roy, U.; Kornitzer, D. Adquisició de ferro hemo en fongs. Curr. Opina. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, un membre de la família de proteïnes Rbt5, està implicat en la utilització del ferro de l'hemoglobina humana durant el creixement de la hifal de Candida albicans. FEMS Llevat Res. 2014, 14, 674–677. [Ref creuat]
40. Pérez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; López-Ribot, JL; Martinez, JP Formació de biofilm per mutants de Candida albicans per a gens que codifiquen proteïnes fúngiques que presenten el domini CFEM que conté vuit cisteïnes. FEMS Llevat Res. 2006, 6, 1074–1084. [Ref creuat]
41. Hogg, PJ Enllaços disulfur com a interruptors per a la funció de proteïnes. Tendències Bioquímica. Ciència. 2003, 28, 210–214. [Ref creuat]
42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Els mutants alterats per l'enllaç disulfur natural d'AVR4 del patogen del tomàquet Cladosporium fulvum són sensibles a la proteòlisi, eluden la resistència mediada per Cf-4-, però conserven la seva capacitat d'unió a la quitina. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Millora de múltiples trets agronòmics per un gen de resistència a les malalties mitjançant el reforç de la paret cel·lular. Nat. Plantes 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. La interrupció gènica a gran escala a Magnaporthe oryzae identifica MC69, una proteïna secretada necessària per a la infecció per patògens fúngics monocot i dicot. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Un domini CFEM que conté vuit cisteïnes exclusiu d'un grup de proteïnes de membrana fúngiques. Tendències Bioquímica. Ciència. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Identificació sistèmica i caracterització funcional de proteïnes de membrana extracel·lulars de fongs comuns a Lasiodiplodia theobromae. Davant. Planta Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Bari, R.; Jones, JD Paper de les hormones vegetals en les respostes de defensa de les plantes. Planta Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [Ref creuat]
48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Regulació mediada per hormones vegetals de les respostes a l'estrès. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [Ref creuat]
49. Javed, K.; Qiu, D. L'elicitador de proteïnes PeBL1 de Brevibacillus laterosporus millora la resistència contra Myzus persicae al tomàquet. Patògens 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Caracterització molecular i funcional de l'elicitor PeBC1 extret de Botrytis cinerea implicat en la inducció de resistència contra el pugó verd del préssec (Myzus persicae) en fesols comuns (Phaseolus vulgaris L.). Insectes 2019, 10, 35. [CrossRef]
51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Paper putatiu d'un elicitador de proteïnes encara no caracteritzat PeBb1 Derivat de Beauveria bassiana ARSEF 2860 Soca contra Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) a Brassica rapa ssp. pekinensis. Patògens 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; et al. NPR1 modula la conversa creuada entre les vies de defensa dependents dels salicilats i els jasmonats mitjançant una nova funció al citosol. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [Ref creuat]
53. Xin, XF; Ell, SY Pseudomonas syringae pv. tomàquet DC3000: un patogen model per sondejar la susceptibilitat a les malalties i la senyalització hormonal a les plantes. Ann. Reverent Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sol, Y.; Mou, Z. La subunitat 16 del complex mediador d'Arabidopsis regula positivament la resistència adquirida sistèmica mediada per salicilat i les vies de defensa induïdes per jasmonat/etilè. Plant Cell 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vásquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA L'àcid salicílic inhibeix la síntesi d'inhibidors de proteïnases a les fulles de tomàquet induïda per la sistemina i l'àcid jasmònic. Physiol vegetal. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC En xarxa per hormones de molècules petites en la immunitat de les plantes. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [Ref creuat]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF L'activació concomitant de les vies de resposta de jasmonat i etilè és necessària per a la inducció d'un gen de defensina vegetal a Arabidopsis. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [Ref creuat]
58. Fang, W.; Bidochka, MJ Expressió de gens implicats en la germinació, la conidiogènesi i la patogènesi a Metarhizium anisopliae mitjançant RT-PCR quantitativa en temps real. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [Ref creuat]
59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Expressió gènica de la cel·lulosa sintasa d'alfals sota estrès abiòtic: una guia d'autoestopista per a la normalització de RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [Ref creuat]
60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. A Verticillium dahliae pectat liasa indueix respostes immunitàries de les plantes i contribueix a la virulència. Davant. Planta Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Anàlisi de dades d'expressió gènica relativa mitjançant PCR quantitativa en temps real i el mètode 2(-Delta Delta C(T)). Mètodes 2001, 25, 402–408. [Ref creuat]