L'enarodustat, un inhibidor de la prolil hidroxilasa del factor inducible per la hipòxia oral, contraresta les alteracions del metabolisme energètic renal en les primeres etapes de la malaltia renal diabètica.

Contacte: emily.li@wecistanche.com

Introducció

Divisió de Nefrologia i Endocrinologia, Facultat de Medicina de la Universitat de Tòquio, Tòquio, Japó; Beca de recerca per a joves científics, Societat japonesa per a la promoció de la ciència, Tòquio, Japó; Laboratoris d'Investigació Biològica i Farmacològica,

Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japó; Departament de Farmacologia de Sistemes, Facultat de Medicina de la Universitat de Tòquio, Tòquio, Japó; Laboratori de Biologia Sintètica, Centre RIKEN per a la Recerca dinàmica de Biosistemes, Suita, Japó; i WPI International Research Center for Neurointelligence, els Instituts d'Estudis Avançats de la Universitat de Tòquio (UTIAS), la Universitat de Tòquio, Tòquio, Japó.

Els inhibidors de la prolil hidroxilasa del factor induïble per la hipòxia (HIF), també coneguts com a estabilitzadors de HIF, augmenten la producció d'eritropoyetina endògena i serveixen com a nous agents terapèutics contra l'anèmia.crònicaronyómalaltia. HIFindueix l'expressió de diversos gens relacionats amb el metabolisme energètic com a resposta adaptativa a la hipòxia. No obstant això, segueix sent fosc com el teixit intern de reprogramació metabòlica mitjançant l'estabilització de HIF afecta la fisiopatologia deronyó malalties. Estudis anteriors suggereixen que els trastorns metabòlics sistèmics com la hiperglucèmia i la dislipèmia causen alteracions del metabolisme renal, donant lloc a una disfunció renal inclosa la malaltia renal diabètica. Aquí, analitzem els efectes de l'enarodustat (JTZ-951), un estabilitzador oral de HIF, sobre el metabolisme energètic renal en les primeres etapes de la malaltia renal diabètica, utilitzant rates diabètics induïdes per estreptozotocina i ratolins diabètics induïts per al·loxà. L'anàlisi del transcriptoma va revelar que l'enarodustat contraresta les alteracions del metabolisme renal diabètic. L'anàlisi del transcriptoma va mostrar que els metabolismes d'àcids grassos i d'aminoàcids estaven regulats a l'alça en el teixit renal diabètic i regulats per enarodustat, mentre que el metabolisme de la glucosa estava regulat. Aquests canvis simètrics es van confirmar mitjançant l'anàlisi del metaboloma. Mentre que la glicòlisi i els metabòlits del cicle de l'àcid tricarboxílic es van acumular i els aminoàcids es van reduir al teixit renal dels animals diabètics, aquestes alteracions metabòliques es van mitigar amb enarodustat. A més, l'enarodustatina va augmentar la proporció de glutatió a disulfur de glutatió i va alleujar l'estrès oxidatiu al teixit renal dels animals diabètics. Així, l'estabilització HIF contraresta les alteracions del metabolisme energètic renal que es produeixen en incipientsdiabèticronyómalaltia.

Cistanche és molt bo per a la funció renal

Declaració translacional

Els inhibidors de la prolil hidroxilasa del factor induïble per la hipòxia (HIF) (també coneguts com estabilitzadors de HIF) augmenten la producció d'eritropoyetina endògena i serveixen com a nous agents terapèutics contra l'anèmia.crònicaronyómalaltia. Les nostres anàlisis de transcriptoma i metaboloma del teixit renal en models diabètics de rates i ratolins han revelat que l'enarodustat (JTZ-951), un estabilitzador oral de HIF, contraresta les alteracions del metabolisme energètic renal en les primeres etapes de la malaltia renal diabètica. Els resultats proporcionen dades importants per extrapolar els efectes dels estabilitzadors HIF sobre el metabolisme energètic renal en entorns clínics, tot i que es necessiten més estudis per aclarir com aquesta reprogramació del metabolisme renal per part dels estabilitzadors HIF afecta la progressió dediabèticronyómalaltia.

La introducció

Els inhibidors de la prolil hidroxilasa del factor induïble per la hipòxia (HIF) augmenten la producció d'eritropoyetina endògena i serveixen com a nous agents terapèutics contra l'anèmia en la malaltia crònica.ronyómalaltia. Les cèl·lules estan dotades d'un mecanisme defensiu contra la hipòxia, i HIF és un regulador mestre d'aquesta defensa. Els ronyons estan fisiològicament exposats a la hipòxia i la hipòxia crònica es reconeix com una via comuna final que condueix a la malaltia renal terminal. Tenint en compte que l'HIF indueix l'expressió de diversos gens relacionats amb les respostes d'hipòxia, els estabilitzadors d'HIF poden tenir efectes pleiotròpics en la progressió deronyómalaltiesaixí com la millora de l'anèmia en la crònicaronyómalaltia. Curiosament, HIF indueix l'expressió de gens glicolítics i de la piruvat deshidrogenasa cinasa, que inhibeix la piruvat deshidrogenasa d'utilitzar piruvat per alimentar el cicle de l'àcid tricarboxílic mitocondrial (TCA). per a l'adaptació de cèl·lules exposades a ambients hipòxics. No obstant això, segueix sent fosc com la reprogramació metabòlica del teixit renal mitjançant l'estabilització de l'HIF afecta la fisiopatologia deronyó malalties. La malaltia renal diabètica (DKD) és la principal causa de malaltia renal en fase terminal. Els trastorns metabòlics sistèmics com la hiperglucèmia i la dislipèmia causen alteracions del metabolisme renal, que condueixen a una disfunció renal inclosa la DKD. Estudis anteriors han demostrat un augment del flux metabòlic i l'acumulació de metabòlits del cicle de glucosa i TCA al teixit cortical renal diabètic, que podria estar relacionat amb la disfunció mitocondrial i la progressió de la DKD. Vam plantejar la hipòtesi que els estabilitzadors d'HIF podrien revertir les alteracions del metabolisme en el teixit cortical renal diabètic, tenint en compte que l'HIF, com a resposta adaptativa a la hipòxia, redueix el flux metabòlic a les cèl·lules per reprimir el consum d'oxigen. Així, utilitzant anàlisis de transcriptoma i metaboloma, vam realitzar un estudi de prova de concepte per entendre de manera exhaustiva com l'enarodustat (JTZ-951), un estabilitzador oral d'HIF, afecta les alteracions del metabolisme renal que es produeixen en les primeres etapes de la DKD.

RESULTATS: Enarodustat indueix la reprogramació metabòlica des del cicle TCA fins a la glucòlisi a les cèl·lules del túbul proximal renal.

Com que l'escorça renal es compon principalment de túbuls proximals, primer vam examinar els efectes de l'enarodustat sobre el flux metabòlic de les cèl·lules del túbul proximal renal in vitro. En primer lloc, es van realitzar la prova d'estrès Mito (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) i l'assaig de velocitat glicolítica (Agilent) en cèl·lules HK-2 cultivades, una línia cel·lular epitelial del túbul proximal humà (figura 1a). Enarodustat va reduir significativament la respiració mitocondrial (cicle TCA) i va augmentar la glucòlisi basal, cosa que indica una reprogramació metabòlica del cicle TCA a la glucòlisi (figura 1; figura suplementària S1). També vam realitzar un experiment amb ARN interferent petit (siRNA) per a HIF -1 (figura 2; figura suplementària S2). La derrota de HIF-1 per siRNA va revertir les alteracions metabòliques (respiració basal, respiració màxima, capacitat respiratòria de recanvi i producció de trifosfat d'adenosina [ATP]) induïdes per enarodustat, que va demostrar que la reprogramació metabòlica es feia principalment a través de HIF-1 estabilització (figura 2; figura suplementària S2). L'activitat de la piruvat deshidrogenasa, un factor important perquè les cèl·lules utilitzin piruvat per alimentar el cicle TCA, també es va reduir amb l'enarodustat (figura 2f), que era compatible amb les observacions publicades anteriorment.

Dades de fons de rates diabètics induïdes per estreptozotocina

A partir dels resultats d'experiments in vitro, vam plantejar la hipòtesi que els estabilitzadors HIF podrien alleujar les alteracions del metabolisme en el teixit cortical renal diabètic mitjançant la reprogramació metabòlica des del cicle TCA fins a la glucòlisi. Primer vam triar rates diabètics induïdes per estreptozotocina (STZ) com a model per a l'experiment de prova de concepte per provar la hipòtesi esmentada anteriorment. En aquest model, la diabetis s'indueix ràpidament, cosa que ens permet observar els efectes nets de la diabetis i dels estabilitzadors de l'HIF sobre el metabolisme energètic del teixit renal en un període curt de temps. A la figura 3a es mostren el protocol d'estudi i les dades bàsiques d'experiments en rates diabètiques induïdes per STZ. Vam dividir les rates en 3 grups: grup A (falsa), grup B (DKD) i grup C (DKD + enarodustat). La glucosa en plasma sanguini, l'hemoglobina glicosilada HbA1c, els triglicèrids i els nivells de colesterol total el dia 14 van augmentar significativament en els grups diabètics en comparació amb el grup A, mentre que no hi va haver diferències significatives entre els grups B i C (figura 3d-g). Tot i que els nivells de creatinina plasmàtica no eren diferents entre els grups, l'excreció d'albúmina urinària va augmentar significativament i la glomerulomegàlia es va notar al grup B en comparació amb el grup A, i l'enarodustat va tendir a revertir aquests canvis (figura 4). Els nivells de nitrogen d'urea en sang van ser més alts en els grups diabètics, cosa que reflecteix la deshidratació a causa de la diabetis. En resum, els ronyons de rates tractades amb STZ del nostre estudi representen les primeres etapes de DKD. Les anàlisis de transcriptoma i metaboloma es van realitzar utilitzant el teixit cortical renal d'aquestes rates.

Anàlisi del transcriptoma del teixit cortical renal

Els resultats de l'anàlisi del transcriptoma del teixit cortical renal es mostren a les figures 5 i 6. L'anàlisi de components principals i l'anàlisi de agrupació jeràrquica van indicar que els grups A, B i C es van separar en diferents grups, respectivament (figura 5a i b). Els gens expressats de manera diferent es van seleccionar mitjançant │log2 fold-change (FC) │ Major o igual a 0.5 i valor Q <0.05. les="" anàlisis="" d'ontologia="" gènica="" i="" de="" vies="" canòniques="" van="" revelar="" que="" els="" gens="" relacionats="" amb="" el="" metabolisme="" dels="" àcids="" grassos="" estaven="" regulats="" al="" grup="" b="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" a.="" en="" canvi,="" els="" gens="" relacionats="" amb="" el="" metabolisme="" de="" la="" glucosa="" i="" la="" resposta="" a="" la="" hipòxia,="" inclosa="" la="" xarxa="" hif-1,="" es="" van="" regular="" al="" grup="" c="" en="" comparació.="" amb="" el="" grup="" b="" (figura="" 5c="" i="" d).="" també="" vam="" realitzar="" una="" anàlisi="" d'enriquiment="" de="" conjunts="" de="" gens="" (gsea)="" mitjançant="" les="" dades="" transcriptòmiques="" (figura="" 6,="" taules="" 1="" i="" 2).="" els="" conjunts="" de="" gens="" del="" metabolisme="" dels="" àcids="" grassos="" i="" dels="" aminoàcids="" es="" van="" regular="" al="" grup="" b="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" a="" (figura="" 6).="" en="" canvi,="" aquests="" conjunts="" de="" gens="" es="" van="" regular="" a="" la="" baixa="" i="" els="" conjunts="" de="" gens="" del="" metabolisme="" de="" la="" glucosa="" es="" van="" regular="" al="" grup="" c="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" b,="" mostrant="" que="" l'enarodustat="" va="" revertir="" les="" alteracions="" del="" metabolisme="" induïdes="" per="" la="" diabetis="" (figura="" 6).="" a="" més,="" els="" conjunts="" de="" gens="" del="" cicle="" tca="" es="" van="" reduir="" al="" grup="" c="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" b="" (taula="" 2),="" cosa="" que="" és="" compatible="" amb="" la="" noció="" de="" reprogramació="" metabòlica="" induïda="" per="" enarodustat="" en="" túbuls="" proximals="" observada="" en="" el="" nostre="" estudi="" in="" vitro.="" en="" resum,="" enarodustat="" va="" contrarestar="" les="" alteracions="" del="" metabolisme="" renal="" diabètic="" des="" de="" les="" perspectives="">

Anàlisi del metaboloma del teixit cortical renal

Es van mesurar les concentracions absolutes de 116 metabòlits relacionats amb l'energia al teixit cortical renal de rates (n =4, per a cada grup) seleccionats aleatòriament de cada grup (taula suplementària S1; figura suplementària S3). Es va realitzar una anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials (PLS-DA) per avaluar la importància de la discriminació de classe (figura 7). Hem realitzat una anàlisi d'enriquiment del conjunt de metabòlits (MSEA) utilitzant els metabòlits amb una puntuació de projecció variable PLS-DA (VIP) 1 $. Diferències en el metabolisme dels aminoàcids, com ara glicina, serina, metionina, aspartat, glutamat, arginina, prolina, i es van observar b-alanina entre els grups A i B. També es van observar diferències en el metabolisme dels aminoàcids entre els grups B i C. A més, els processos del metabolisme de la glucosa, com la glucòlisi i la gluconeogènesi, van mostrar tendències diferents entre els grups B i C (Figura 7).

Visualització de dades de transcriptoma i metaboloma al mapa de la via metabòlica de l'energia

Es van visualitzar les dades del transcriptoma i del metaboloma per a una comprensió completa de les alteracions del metabolisme energètic (figura 8). Es va trobar que els metabòlits del cicle de la glucòlisi i el TCA s'acumulen al grup B en comparació amb el grup A, cosa que podria ser degut a l'excés d'entrada de glucosa i a la regulació del metabolisme dels àcids grassos en DKD. La concentració d'aminoàcids es va reduir al grup B en comparació amb el grup A, cosa que reflecteix la regulació del metabolisme dels aminoàcids (figura 8a). En canvi, l'acumulació de metabòlits de la glucòlisi es va alleujar amb enarodustat, a causa del flux facilitat de la glucòlisi. Enarodustat també va revertir els canvis induïts per la diabetis en els metabòlits i els aminoàcids del cicle TCA (figura 8b). A més, l'enarodustat va alleujar l'acumulació de disulfur de glutatió (GSSG) al teixit renal diabètic i, per tant, va mostrar una relació glutatió/GSSG més alta, cosa que va suggerir que l'enarodustat va alleujar l'estrès oxidatiu en DKD (figura 8a i b). La reducció de l'estrès oxidatiu es va confirmar pels nivells del marcador de peroxidació lipídica malondialdehid al teixit cortical renal: enarodustat va revertir l'acumulació de malondialdehid al teixit cortical renal diabètic (figura suplementària S4). En resum, la integració de les dades del transcriptoma i del metaboloma ha demostrat que l'enarodustat contraresta les alteracions del metabolisme energètic renal que es produeixen en les primeres etapes de la DKD.

Les alteracions simètriques del metabolisme (diabetis vs. enarodustat) es confirmen en un model alternatiu

Hem realitzat anàlisis de transcriptoma en ratolins diabètics induïts per al·loxà, un altre model animal de diabetis, per confirmar les nostres troballes en el model de rata. Els protocols d'estudi i les dades de fons per al model de ratolí es mostren a la figura 9. L'excreció d'albúmina urinària va augmentar significativament al grup B en comparació amb el grup A, que es va revertir per enarodustat (figura 9d). A més, vam aplicar una anàlisi 3-dimensional completa (cóctels d'imatges corporals i cerebrals clares i sense obstruccions i anàlisi computacional [CUBIC]-ronyó)16 per visualitzar els glomèruls al ronyó. La glomerulomegàlia es va notar al grup B en comparació amb el grup A, que es va revertir per enarodustat (figura 9e). L'anàlisi del transcriptoma del teixit renal en ratolins diabètics induïts per al·loxà va mostrar alteracions simètriques del metabolisme (diabetis vs. enarodustat) de la mateixa manera que en el model de rata diabètica induïda per STZ (Figura 10): el metabolisme dels àcids grassos va ser regulat per la diabetis, mentre que la glucosa. el metabolisme va ser regulat per enarodustat. A més, el metabolisme dels aminoàcids va ser regulat per la diabetis i per enarodustat. Així, l'enarodustat va contrarestar les alteracions del metabolisme energètic renal que es van produir en les primeres etapes de la DKD en el model de ratolí diabètic induït per al·loxà, així com en el model de rata diabètica induïda per STZ.

DISCUSSIÓ

En aquest estudi, hem demostrat que l'enarodustat (JTZ{0}}), un estabilitzador oral d'HIF, contraresta les alteracions del metabolisme energètic renal que es produeixen en les primeres etapes de la DKD en models de diabetis de rata i ratolí. Les anàlisis del transcriptoma i del metaboloma han mostrat alteracions simètriques del metabolisme al teixit renal (diabetis versus enarodustat): els metabolismes d'àcids grassos i d'aminoàcids es van regular a la DKD, mentre que l'enarodustat va regular a la baixa aquestes vies i, a més, va augmentar el metabolisme de la glucosa (figures 5-10).

No s'ha dilucidat del tot si l'estabilització de l'HIF té efectes protectors sobre la fisiopatologia de la DKD o no. Estudis anteriors han demostrat que el teixit renal diabètic està exposat a la hipòxia17 i que l'expressió de HIF al teixit renal diabètic és insuficient per respondre a les seves condicions hipòxiques, que és parcialment causada per l'estrès oxidatiu. dany tubulointersticial a la DKD induïda per STZ.19 Els resultats de l'estudi amb animals també van indicar que l'estabilització de l'HIF va protegir contra el desenvolupament de l'obesitat,20 va millorar la sensibilitat a la insulina20 i va reduir els nivells de colesterol sèric.21 Aquests resultats suggereixen els efectes protectors de l'estabilització de l'HIF en el desenvolupament de DKD. En canvi, es va informar que l'estabilització suprafisiològica de l'HIF per supressió de von Hippel-Lindau indueix fibrosi renal.22 El paper de l'estabilització de l'HIF en la progressió de la DKD pot dependre del context donats els efectes pleiotròpics de l'HIF i l'existència de fenotips variats de DKD. L'objectiu d'aquest estudi va ser aclarir els efectes nets de l'estabilització de l'HIF sobre el metabolisme energètic al ronyó diabètic. Informes anteriors han indicat que es produeixen alteracions del metabolisme energètic a la DKD. Sas et al.10 van mostrar un augment del flux metabòlic energètic i l'acumulació de metabòlits de glucosa al teixit cortical renal diabètic, que podria estar relacionat amb una disfunció mitocondrial. You et al.23 van informar que el fumarat, un metabòlit del cicle del TCA, es va acumular al teixit renal diabètic i va contribuir directament a la progressió de la DKD. Prèviament hem demostrat que els metabòlits del cicle del TCA s'acumulen al teixit renal diabètic, que es va revertir per la inhibició del cotransportador de sodi-glucosa 2 o la restricció calòrica.11 A més, Qi et al. es van incrementar en pacients diabètics tipus 1 sense DKD en comparació amb pacients amb DKD. L'activació de PKM2 va revertir l'acumulació de metabòlits de la glucòlisi i va restaurar la funció mitocondrial, parcialment augmentant el flux glicolític.24,25 Aquests informes anteriors suggereixen que l'acumulació de metabòlits de glicòlisi i del cicle de TCA podria afectar la progressió de la DKD, que es pot mitigar mitjançant la glucòlisi facilitada, inclosa la PKM2. activació. En el nostre estudi, l'estabilització de HIF per enarodustat va revertir les alteracions del metabolisme energètic i va mitigar l'acumulació de metabòlits del cicle de glucòlisi i TCA al teixit cortical renal diabètic (figura 8). L'expressió d'enzims glicolítics inclòs PKM2 també va ser regulada per enarodustat (figura suplementària S4B). A més, l'enarodustat va alleujar l'acumulació de GSSG i va augmentar la relació glutatió/GSSG, cosa que suggereix que l'enarodustat va alleujar l'estrès oxidatiu en DKD (figura 8). Aquesta reducció de l'estrès oxidatiu induïda per enarodustat també es va confirmar pels canvis en els nivells de malondialdehid al teixit cortical renal (figura suplementària S4A). Aquests resultats suggereixen que l'estabilització de l'HIF hauria de tenir funcions protectores sobre la fisiopatologia de la DKD almenys des de les perspectives metabòliques. És cert que no podem examinar si la reprogramació metabòlica mitjançant l'estabilització de l'HIF té efectes directes en la progressió de la DKD, perquè pot ser impossible discernir els efectes nets de les alteracions del metabolisme sobre el resultat renal a causa del paper pleiotròpic de l'HIF. Tanmateix, en el nostre estudi, l'enarodustat va mitigar l'excreció urinària lleu d'albúmina i les anomalies patològiques renals (glomerulomegàlia i engrossiment de la membrana basal glomerular) induïdes per la diabetis, en associació amb la normalització del metabolisme energètic renal. Vam extreure els gens els canvis d'expressió dels quals es correlacionaven amb els nivells d'albúmina urinària (257 sondes; 232 gens) de les dades de microarrays del model de ratolí diabètic induït per al·loxà i vam realitzar una anàlisi d'enriquiment de la via (figura suplementària S5). Com a resultat, les vies relacionades amb la membrana mitocondrial i el transport d'electrons respiratoris estan regulades associades als nivells d'albúmina urinària, cosa que indica que la càrrega mitocondrial està estretament relacionada amb l'excreció d'albúmina urinària. Per tant, hi ha la possibilitat que la normalització metabòlica del teixit renal diabètic mitjançant estabilitzadors HIF pugui reduir la càrrega mitocondrial i mitigar la progressió de la DKD. Les nostres dades suggereixen la fisiopatologia de la DKD des de les perspectives metabòliques de la següent manera: la hiperglucèmia crea demanda d'energia per a la reabsorció de glucosa als túbuls proximals renals; així, el cicle del TCA en els mitocondris s'activa a la força per satisfer la demanda energètica en les primeres etapes de la DKD (regulació del metabolisme dels àcids grassos i dels aminoàcids). I els estabilitzadors HIF podrien mitigar aquesta càrrega mitocondrial mitjançant la reprogramació metabòlica del cicle del TCA a la glucòlisi (reducció del metabolisme d'àcids grassos i aminoàcids i regulació de la glucòlisi), que podria tenir funcions protectores contra la progressió de la DKD. Es necessiten més estudis que incloguin òmics unicel·lulars per aclarir com la càrrega mitocondrial del teixit renal afecta directament la fisiopatologia de la DKD. Una altra pregunta interessant és si els estabilitzadors HIF afecten directament l'absorció de glucosa als túbuls proximals. Les nostres dades in vitro van mostrar que la producció d'ATP es redueix significativament per enarodustat mitjançant la reprogramació metabòlica des del cicle del TCA fins a la glucòlisi (figures 1 i 2). Tenint en compte que l'ATP és necessari per a la reabsorció de glucosa pel cotransportador sodi-glucosa 2, primer vam plantejar la hipòtesi que la reabsorció de glucosa podria ser inactivada per enarodustat. Tanmateix, els nivells de glucosa urinàries no eren significativament diferents entre el grup B i el grup C en ambdós models animals (figura suplementària S6). Probablement, la reducció de la producció d'ATP per enarodustat és molt més suau en una situació fisiològica en comparació amb el seu efecte in vitro; per tant, l'estabilització de l'HIF no afecta l'absorció de glucosa a través del cotransportador sodi-glucosa 2, almenys en els nostres experiments amb animals. El nostre estudi tenia 2 limitacions. En primer lloc, vam utilitzar rates diabètiques induïdes per STZ i ratolins diabètics induïts per al·loxà com a models de DKD en fase inicial i vam observar els efectes a curt termini de les condicions diabètiques. No obstant això, en l'àmbit clínic, els estabilitzadors d'HIF s'administrarien a pacients amb anèmia en fase tardana de DKD. Es necessiten més estudis per entendre l'efecte de l'estabilització de l'HIF sobre les alteracions del metabolisme renal en la DKD en fase tardana. En segon lloc, l'estudi no tenia prou potència estadística pel que fa a la dispersió de les concentracions de metabòlits a les dades del metaboloma, mentre que les dades del transcriptoma tenien un poder estadístic prou gran per aclarir tota la imatge del metabolisme energètic. Com que no molts metabòlits van mostrar una diferència significativa entre els grups, vam realitzar PLS-DA i vam seleccionar els metabòlits amb una puntuació VIP PLS-DA superior o igual a 1 per a MSEA. Tot i que és difícil verificar un canvi metabòlic només utilitzant dades de metabolòmica, els resultats de l'anàlisi del metaboloma eren compatibles amb les dades transcriptòmiques (figures 7 i 8), proporcionant suport addicional per als efectes observats de les alteracions del transcriptoma sobre el metabolisme energètic renal. En conclusió, l'enarodustat (JTZ-951), un estabilitzador oral d'HIF, contraresta les alteracions del metabolisme energètic renal en les primeres etapes de la DKD. El nostre estudi suggereix que l'estabilització de l'HIF pot servir com a possible intervenció dirigida al metabolisme energètic renal desregulat en DKD.

MÈTODES

Prova d'estrès Mito i assaig de velocitat glicolítica

Les cèl·lules HK-2 es van sembrar en una microplaca de 96-pou a una densitat d'1 * 10⁴cèl·lules/pou. L'endemà, l'analitzador Seahorse XFe96 (Agilent) va mesurar el flux metabòlic en temps real mitjançant Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) o Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent). Les concentracions de glucosa, piruvat i glutamina en medis de cultiu eren de 10 mmol/l, 1 mmol/l i 2 mmol/l, respectivament.

transfecció de siRNA

La derrota de HIF-1 va ser realitzada per Stealth RNAi per a HIF1A humà (HSS104774 [#1] i HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Com a control negatiu es va utilitzar Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific).

Western blotting

Els anticossos primaris utilitzats per a la tinció van ser anticossos anti-HIF-1 humans (conill policlonal, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) i anticossos anti-actina humana (conill policlonal, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Un anticòs secundari va ser l'anticòs IgG anti-conill de cabra conjugat amb peroxidasa de rave picant (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Experiments amb animals

Crl: rates CD (Sprague Dawley) i ratolins Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) es van obtenir de Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Japó). Tots els experiments van ser aprovats per la Junta de Revisió Institucional de la Universitat de Tòquio (número d'aprovació P17-110). Tots els procediments amb animals es van realitzar segons les directrius dels Instituts Nacionals de Salut (Guia per a la cura i l'ús dels animals de laboratori). Els protocols d'estudi es mostren a les figures 3 i 9.

Anàlisi del transcriptoma

L'ARN total del teixit cortical renal es va aïllar mitjançant GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). L'ARN total (100 ng) es va etiquetar mitjançant el kit d'etiquetatge d'amplificació ràpida de baixa entrada (Agilent) i després es va hibridar amb SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (per a la rata; Agilent) i SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (per al ratolí), respectivament. Tots els experiments de microarrays van ser realitzats per DNA Chip Research Inc. (Tòquio, Japó). Les dades en brut es van processar amb el paquet R limma a Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) per realitzar la correcció de fons i la normalització de dades mitjançant el mètode de normalització quantil. ComBat (Bioconductor) va eliminar els efectes del lot a l'experiment de rata. Els gens expressats de manera diferent es van determinar per│log2 FC│ Major o igual a 0,5 i el valor Q <0,05. les="" anàlisis="" de="" l'ontologia="" gènica="" i="" la="" via="" canònica="" es="" van="" realitzar="" mitjançant="" basespace="" correlation="" engine="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" les="" dades="" de="" microarrays="" s'han="" dipositat="" al="" national="" center="" for="" biotechnology="" information="" gene="" expression="" omnibus="" com="" a="" sèries="" gse131221="" (rata)="" i="" gse139317="">

Anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens

GSEA és un mètode computacional que determina si un conjunt de gens definits a priori mostra diferències estadísticament significatives i concordants entre dos estats biològics. GSEA es va realitzar mitjançant GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Les vies amb una taxa de fals descobriment <0,25 es="" van="" considerar="">

Anàlisi del metaboloma

Les mesures del metaboloma van ser realitzades per Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japó). Les concentracions de metabòlits es van calcular normalitzant l'àrea màxima de cada metabòlit respecte a l'àrea de l'estàndard intern i utilitzant corbes estàndard, que es van obtenir a partir de calibracions de 3-punts. Vegeu també els mètodes suplementaris.

Anàlisi d'enriquiment del conjunt de metabolits

L'anàlisi de les dades de metabolòmica es va dur a terme mitjançant la plataforma integrada basada en web MetaboAnalyst 4.0. Es va realitzar PLS-DA i es van calcular les puntuacions VIP associades. Els metabòlits amb una puntuació VIP PLS-DA superior o igual a 1 es van utilitzar per al MSEA.

Quantificació d'àrees glomerulars en patologies renals

Vam prendre aleatòriament 3 imatges patològiques de la imatge de tinció periòdica d'àcid-Schiff de cada mostra i vam mesurar cada àrea glomerular respectivament mitjançant Fiji (una distribució d'ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

CUBIC-ronyó

Es va realitzar una imatge 3-dimensional completa dels glomèruls al teixit renal mitjançant CUBIC segons els nostres articles anteriors. En resum, es van submergir els ronyons de ratolí fixos a CUBIC-L per a la seva delipidació i després es van sotmetre a una tinció immunofluorescent. Finalment, l'índex de refracció es va comparar amb la col·locació de les mostres a CUBIC-R plus. Es van adquirir imatges completes en 3D de ronyons transparents amb microscòpia de fluorescència de làmines de llum personalitzada (MVX10-LS; Olympus, Tòquio, Japó). L'anticòs primari utilitzat per a la tinció va ser l'anticòs anti-podocina (policlonal de conill, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). L'anticòs secundari era Alexa Flour 555- IgG anti-conill conjugada d'ase (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Anàlisi estadística

Per a comparacions múltiples, s'ha aplicat l'anàlisi de la variància {{{0}}modal seguida de les proves de comparacions múltiples de Tukey post hoc, si escau. Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar amb el programari GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). P <0,05 es="" va="" considerar="" estadísticament="" significatiu.="" les="" dades="" es="" presenten="" com="" a="" mitjana="" ±="">

DIVULGACIÓ

MN ha rebut honoraris, honoraris d'assessorament o finançament de recerca de KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim , i Alexion. TT ha rebut una beca de recerca de JT. Enarodustat (JTZ-951) va ser proporcionat per JT, Tòquio, Japó. EAS i HRU són inventors de patents propietat de RIKEN. Part d'aquest estudi es va fer en col·laboració amb Olympus Corporation i un programari amable amb el suport de Bitplane. L'altre autor va declarar que no hi havia interessos oposats.

AGRAÏMENTS

Estem agraïts al Dr. Shuhei Yao i al Dr. Shinji Tanaka per les valuoses discussions. També donem les gràcies al Dr. Tsuyoshi Inoue, al Dr. Satoru Fukuda i a la Sra. Kahoru Amitani pel seu suport tècnic. Aquest treball es va dur a terme parcialment amb el suport del Isotope Science Center, la Universitat de Tòquio. Aquest treball va comptar amb el suport de la beca de recerca de la Societat japonesa per a la promoció de la ciència (JSPS) (subvenció JSPS KAKENHI 19J11928 a SH), subvenció per a la investigació científica (B) (beca JSPS KAKENHI 18H02824 a MN). ), Subvenció per a la investigació científica (C) (subvenció JSPS KAKENHI 17K09688 a TT) i Subvenció per a la investigació científica en àrees innovadores (subvenció KAKENHI 26111003 a MN).