La trombomodulina millora la transformació de la malaltia renal crònica mediada pel factor de creixement b1 mitjançant la via del senyal 15/Akt acoblada a la proteïna G

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo Inoue Inoue6 , , , , 7 Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 i Esteban C. Gabazza2,9

1 Departament de Diabetis, Metabolisme i Endocrinologia, Escola de Postgrau de Medicina de la Universitat de Mie, Tsu-city, Mie, Japó; 2 Departament d'Immunologia, Escola de Postgrau de Medicina de la Universitat de Mie, Tsu-city, Mie, Japó; 3 Departament de Medicina Pulmonar i Cures Crítiques, Escola de Postgrau de Medicina de la Universitat de Mie, Tsu-city, Mie, Japó; 4 Departament de Gastroenterologia i Hepatologia, Escola de Postgrau de Medicina de la Universitat de Mie, Tsu-city, Mie, Japó; 5 Departament de Regeneració Neural i Comunicació Cel·lular, Escola de Postgrau de Medicina de la Universitat de Mie, Tsu-city, Mie, Japó; 6 Institut Central d'Animals Experimentals, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japó; i 7 Departament de Nefrologia, Hospital de Taizhou, Universitat Mèdica de Wenzhou, Lihai, província de Zhejiang, República Popular de la Xina.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Copyright ª 2020, Societat Internacional de Nefrologia. Publicat per Elsevier Inc. Aquest és un article d'accés obert sota la llicència CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Correspondència: Esteban C. Gabazza, Departament d'Immunologia, Escola de Medicina de la Universitat de Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japó. Correu electrònic: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; o Yutaka Yano, Diabetis, Metabolisme i Endocrinologia, Escola de Postgrau de Medicina de la Universitat de Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japó. Correu electrònic: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT i TY han contribuït per igual en aquest treball. 9 YY i ECG són coautors sènior. Rebut l'1 de setembre de 2019; revisat el 24 d'abril de 2020; acceptat el 7 de maig de 2020

PARAULES CLAU: apoptosi; malaltia renal crònica; receptor acoblat a proteïna G; trombomodulina humana recombinant; factor de creixement transformador-b1

La fibrosi renal és la conseqüència comuna de les malalties renals cròniques que progressen inexorablement cap a una malaltia renal terminal amb insuficiència orgànica tractable només amb teràpia de substitució. Com que el factor de creixement transformant-b1 és el principal actor en la patogènesi de la fibrosi renal, vam plantejar la hipòtesi que la trombomodulina recombinant pot millorar la fibrosi i la insuficiència renal progressiva mediada pel factor de creixement transformant b1. Per interrogar la nostra hipòtesi, vam generar un nou ratolí transgènic del factor de creixement transformador humà específic del glomèrul-b1 per avaluar l'efecte terapèutic de la trombomodulina recombinant. Aquest ratolí transgènic va desenvolupar esclerosi glomerular progressiva i fibrosi tubulointersticial amb insuficiència renal. La teràpia amb trombomodulina recombinant durant quatre setmanes va inhibir significativament la fibrosi renal i va millorar la funció dels òrgans en comparació amb els ratolins transgènics no tractats. El tractament amb trombomodulina recombinant va inhibir significativament l'apoptosi i la diferenciació mesenquimal dels podòcits mitjançant la interacció amb el receptor 15 acoblat a la proteïna G per activar la via de senyalització Akt i per regular l'expressió de proteïnes anti-apoptòtiques, inclosa la supervivència. Així, el nostre estudi suggereix fortament la potencial eficàcia terapèutica de la trombomodulina recombinant per al tractament demalaltia renal crònicai posterior insuficiència orgànica.

cistanchellaunatractar la malaltia renalmillorar la funció renal

Declaració translacional

Fibrosi i disfunció de laronyonsactualment són problemes de salut importants a tot el món. Actualment no hi ha cap fàrmac antifibròtic aprovat per al tractament de la fibrosi renal. El factor de creixement transformador-b1 és el principal i comú motor de la fibrogènesi renal en la malaltia renal crònica causada per molts trastorns. Aquí hem trobat que la trombomodulina recombinant, un fàrmac aprovat al Japó per tractar la coagulació intravascular disseminada, suprimeix la progressió de l'esclerosi glomerular, la fibrosi tubulointersticial i la insuficiència renal causada per la sobreexpressió del factor de creixement transformant humà-b1, cosa que suggereix el seu valor terapèutic potencial per al tractament. demalalties renals cròniques.

Malaltia renal crònicaés un problema de salut pública important associat a una elevada morbiditat i mortalitat que afecta al voltant del 13% de la població adulta dels països desenvolupats.1 L'Organització Mundial de la Salut va informar quemalaltia renal crònica(ERC) va ser la causa de l'1,5 per cent de les morts a tot el món l'any 2012.1 A més, dades epidemiològiques recents indiquen un augment global constant del nombre de pacients amb ERC.2,3 En la majoria dels casos, el procés patològic evoluciona progressivament i, finalment, porta estadi d'insuficiència renal, que només es pot tractar amb diàlisi per a tota la vida o trasplantament renal.4,5 La diabetis mellitus (DM) i la hipertensió arterial són les causes més freqüents d'ERC seguida de la isquèmia, la glomeruloesclerosi d'etiologia desconeguda, les obstruccions urològiques i les infeccions cròniques6. Independentment del trastorn subjacent, la conseqüència patològica final i comuna de la ERC és la fibrosi renal.7 La fibrosi renal és la cicatrització i remodelació aberrants de les estructures parenquimàtiques dels ronyons sotmeses a lesions prolongades o repetitives caracteritzades per la presència de fibrosi tubulointersticial, glomerulosclerosi i atròfia tubular.8 El principal motor de la fibrogènesi renal és el fet de creixement transformador. o (TGF)-b1.8,9 TGFb1 pot promoure la fibrosi estimulant la secreció de proteïnes de la matriu extracel·lular i factors quimiotàctics o factors proliferants de fibroblasts, inhibint les metaloproteinases i afavorint la transició epitelial-mesenquimal.10 A part del tractament de la malaltia subjacent. , un fàrmac aprovat que s'adreça específicament a la fibrosi renal no està disponible actualment.6

La trombomodulina (TM) és una glicoproteïna transmembrana amb múltiples funcions biològiques que inclouen la modulació del sistema de coagulació, la resposta immune, les reaccions inflamatòries i la supervivència cel·lular.11 L'estructura molecular de la TM conté un domini semblant a la lectina, 6 dominis semblants al factor de creixement epidèrmic. , un domini ric en serina/treonina, una porció transmembrana i una cua citoplasmàtica.12 La trombina, un factor procoagulant generat durant l'activació del sistema de coagulació, es converteix en un factor anticoagulant i antifibrinolític després d'unir-se a TM.13 El complex TM-trombina augmenta la generació. de la proteïna C activada (APC), un anticoagulant amb activitat antiinflamatòria i citoprotectora, mitjançant l'activació de la proteïna C. A més, la TM sola pot regular directament a la baixa la resposta inflamatòria mitjançant la inhibició de l'activitat de la proteïna B del grup d'alta mobilitat-1 (HMGB1), mitjançant la supressió de cèl·lules dendrítiques immunogèniques, eosinòfils, mastòcits i el sistema del complement.13–18.

Hi ha resultats publicats que mostren efectes preventius de la MT en la renopatia diabètica i la lesió renal per isquèmia-reperfusió.19-21 No obstant això, cap estudi ha avaluat l'efecte de la MT recombinant sobre la fibrosi renal progressiva induïda per TGFb1, un factor comú de la fibrosi renal a diverses malalties que causen ERC. Vam plantejar la hipòtesi que la TM pot millorar la fibrosi renal i la insuficiència renal mediada per TGFb1-. Per interrogar aquesta hipòtesi, es va avaluar l'efecte terapèutic de la TM recombinant en un ratolí transgènic (TG) TGFb1 específic del glomèrul recentment desenvolupat que es desenvolupa progressiu.fibrosi renal i insuficiència renal.

cistanche per ronyó

RESULTATS

L'augment dels fragments circulants de TM es correlaciona amb la disfunció renal

La TM, una glicoproteïna lligada a la membrana de les cèl·lules endotelials, es divideix en fragments, perdent les seves funcions protectores durant la lesió endotelial.22 La nefropatia diabètica s'associa amb una lesió endotelial23,24. nivells circulants de TM (4,4 enfront de 3,3 pg/ml) i TGFb1 actiu (0,28 vs. 0,24 ng/ml) (taula suplementària S1, figura suplementària S1A). La TM està significativament correlacionada amb la creatinina, el TGFb1 actiu i la podocina soluble (figura suplementària S1B). Aquestes observacions suggereixen que una pèrdua de TM funcional unida a la membrana s'associa amb un augment de l'alliberament de TGFb1 actiu i una disfunció renal.

Ratolí TG amb una expressió específica del glomèrul del gen TGFb1 humà de longitud completa

Hem desenvolupat un ratolí TG que sobreexpressa el gen TGFb1 humà de longitud completa en podòcits. El ratolí es va generar col·locant el TGFb1 humà sota el control del promotor de la podocina en una construcció de cromosoma artificial bacterià (BAC) (figura suplementària S2; figura suplementària S3). Hem obtingut 5 ratolins fundadors que expressaven 3 còpies i 3 ratolins fundadors que expressaven 1 còpia del transgen humà TGFb1. L'expressió del transgen era específica del ronyó i la descendència dels fundadors era viable (figura suplementària S3). Els ratolins van tenir embarassos a terme i les escombraries eren de mida normal. Els ratolins van néixer en la proporció mendeliana esperada.

Per caracteritzar els ratolins TG, n'hem mesurat diversosparàmetres renalscada 4 setmanes durant un període de 16 setmanes (figura suplementària S4). Les concentracions plasmàtiques i d'orina de TGFb1 van augmentar significativament als ratolins TGFb1- TG en comparació amb els ratolins de tipus salvatge (WT) des de les primeres setmanes després del naixement i després es van mantenir estables a un nivell elevat (figura 1a). Els ratolins TGFb1-TG van mostrar un augment significatiu del contingut d'hidroxiprolina en teixit renal a la 20setmana (190,5 enfront de 96,0 mg/ronyó). ), l'expansió mesangial a partir de la 4a setmana (1,9 vs. 1,1 puntuacions) i en la deposició de col·lagen a partir de la 12a setmana (0,9% vs. 0,1%) després del naixement en comparació amb els seus homòlegs WT (Figura 1a-f). ). La microscòpia òptica convencional va mostrar l'ampliació de la membrana basal de la càpsula Bowman, l'engrossiment de la membrana basal glomerular, l'augment de la deposició de col·lagen als espais mesangials i intersticials i atròfia tubular (figura 1bd). La microscòpia electrònica de transmissió va mostrar glomerulosclerosis incloent la transformació de microvellositats i l'eliminació del procés del peu dels podòcits, la disminució de la fenestració endotelial capil·lar glomerular, l'engrossiment de la membrana basal glomerular i l'augment de la deposició de la matriu mesangial (figura 2a–i). Les concentracions urinàries dels primers marcadors de la nefropatia Proteïna d'unió a àcids grassos (185,1 vs. 87,0 pg/ml) ilesió renalLa molècula 1 (441,9 enfront de 256,9 pg/ml) es va millorar significativament en els ratolins TGFb1-TG a partir de la 4a i la 8a setmana d'edat, respectivament, en comparació amb els seus ratolins WT d'edat (figura suplementària S5). La proteinúria total i la proporció total de proteïna-creatinina a l'orina van augmentar significativament a les setmanes 4a, 8a, 12a, 16a i 20è en els ratolins TGFb{1-TG en comparació amb els seus homòlegs WT (figura 3a) . El nivell plasmàtic de nitrogen ureic en sang es va elevar significativament a partir de la 4a setmana (5,1 vs. 4,1 mg/dl) i la concentració de creatinina a partir de la 8a setmana (1,1 vs. 0,4 mg/dl) en ratolins TGFb1-TG. en comparació amb els seus homòlegs WT (figura 3b).

rhTM inhibeix la glomeruloesclerosi i la fibrosi tubulointersticial

En comparació amb els ratolins TGFb{{{0}}TG tractats amb solució salina (SAL) i els ratolins WT tractats amb humans recombinants (RH) TM o SAL, els ratolins TGFb{{1-TG tractats amb ritme van mostrar una reducció significativa del mesangial expansió/cel·lularitat (puntuació 1,3 enfront de 3.{{30}}) i deposició de col·lagen tubulointersticial i glomeruloesclerosi significativament baixes (121,3 per cent enfront de 139,7 per cent) (figura 4a-e). D'acord amb aquestes observacions, el contingut d'hidroxiprolina (11,7 vs. 19,9 mg/g), les concentracions del teixit renal de col·lagen I (101,3 vs. 196,7 ng/mg de proteïna) i periostina (21,7 vs. 40,8 ng/ mg de proteïna), i l'expressió d'ARNm relativa del col·lagen I es va reduir significativament als teixits renals dels ratolins TGFb1-TG tractats amb rhTM en comparació amb els teixits renals dels ratolins control (figura 4f, taules suplementàries S2 i S3). La microscòpia electrònica de transmissió va mostrar una reducció significativa de l'esborrament del procés del peu dels podòcits i l'engrossiment de la membrana basal glomerular en ratolins tractats amb rhTM en comparació amb els ratolins tractats només amb SAL (figura suplementària S6AB i B). A més, les concentracions en el teixit renal de la proteïna quimioatraient monòcits de citocines profibròtiques-1 (45,0 vs. 76,1 pg/mg de proteïna), interleucina-13 (612,1 vs. 1002,0 pg/mg de proteïna) i TGFb1 actiu. (131, 0 vs. 151, 5 pg / mg de proteïna) es van reduir significativament en els ratolins TGFb1-TG tractats amb rhTM en comparació amb els ratolins control (figura suplementària S7). La concentració de teixit renal de HMGB1 també va disminuir significativament en els teixits renals dels ratolins TGFb1-TG tractats amb rhTM en comparació ambteixits renalsde ratolins control (figura suplementària S7). La concentració plasmàtica del complex de trombina antitrombina va augmentar significativament en el grup TGFb1-TG/SAL en comparació amb el grup WT/SAL, però no es va trobar cap diferència entre els grups TGFb{1-TG/rhTM i WT/rhTM. (Figura suplementària S8A). Com era d'esperar, hi havia una concentració elevada de TM al plasma de ratolins TGFb1-TG i WT tractats amb rhTM. La concentració plasmàtica del complex APC/antitripsina es va reduir significativament en el grup TGFb1-TG/SAL en comparació amb els grups WT/SAL i TGFb1-TG/rhTM (280,5 enfront de 384,6 pg/ml) , i no hi va haver cap diferència significativa en el nivell d'inhibidor de l'activador del plasminogen -1 (figura suplementària S8A). Els nivells de C5a en plasma, orina iteixit renal(630,1 vs. 1075,0 pg/mg de proteïna) i la podocina soluble en plasma es va reduir significativament en els ratolins TGFb{1-TG tractats amb rhTM en comparació amb els ratolins TGFb{1-TG tractats amb SAL (Figura suplementària S8B). El nivell de podocina a l'orina va ser més alt al grup TGFb1-TG/SAL que als grups WT/SAL i TGFb{1-TG/rhTM (figura suplementària S9A-C).

Figura 1|El ratolí transgènic (TG) del factor de creixement transformant humà b1 (TGFb1) desenvolupa una fibrosi renal progressiva. ( a ) Les concentracions de proteïna TGFb1 al plasma i a l'orina es van mesurar mitjançant un assaig immune enzimàtic i el contingut d'hidroxiprolina del teixit mitjançant un assaig colorimètric. (b–d) Les seccions de teixit renal es van tenyir amb (b) àcid periòdic-Schiff (barres ¼ 20 mm) i amb (c, d) tricrom de Masson (barres ¼ 10{{ 40}} mm) i després (e,f) quantificada mitjançant un sistema de puntuació o el programari d'imatge WinROOF (Mitani Corporation, Tòquio, Japó). El nombre de ratolins per a l'avaluació del teixit renal: per a ratolins de tipus salvatge (WT), n ¼ 4 a les 4, 12 i 20 setmanes; per a ratolins TG, n ¼ 7 a les 4 setmanes, n ¼ 8 a les 16 setmanes i n ¼ 9 a les 20 setmanes. El nombre de ratolins per a l'avaluació de plasma i orina: per a ratolins WT, n ¼ 12 a les 4 setmanes, n ¼ 8 a les 8 setmanes, n ¼ 7 a les 12 setmanes i n ¼ 4 a les 16 i 20 setmanes; per a ratolins TG, n ¼ 24 a les 4 setmanes, n ¼ 17 a les 8 i 12 setmanes i n ¼ 9 a les 16 i 20 setmanes. Les dades s'expressen com a rang interquartil mitjà. Anàlisi estadística mitjançant la prova U de Mann-Whitney. *P <0,05, **p=""><0,01, ****p=""><0,0001. ns,="" no="" significatiu.="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

Figura 2|Trobades de microscòpia electrònica de transmissió en el model de fibrosi renal induïda pel factor de creixement transformant b1. La fixació, la manipulació i l'eliminació dels ronyons dels ratolins es van realitzar tal com es descriu als Mètodes. (a, b) Transformació de microvellositats i (a, b, d, e, g) esborrament del procés del peu (puntes de fletxa blanques) dels podòcits, (c–e) disminució de la fenestració endotelial capil·lar glomerular (puntes de fletxa grogues), (f) engrossiment de la Hi ha la membrana basal glomerular (asteriscs) i (h, i) un augment de la deposició de la matriu mesangial (fletxes blanques). CL, llum capil·lar. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.kidney-international.org.

rhTM millora la funció renal

Els nivells de proteïna que uneix àcids grassos L (197,0 vs. 313,4 pg/ml),molècula de lesió renal1 (299,9 vs. 596,2 pg/ml), el nitrogen ureic sanguini (12,9 vs 34,8 mg/dl), la creatinina (0,5 vs. 1,4 mg/dl) i la relació albúmina-creatinina es van reduir significativament en Ratolins TGFb1-TG amb fibrosi renal tractats amb rhTM en comparació amb els seus homòlegs TG no tractats (figura 5). La proteïna total de l'orina i la proporció de creatinina de proteïna total també es van reduir en els ratolins TGFb1-TG tractats amb rhTM en comparació amb els seus homòlegs no tractats (figura 5).

rhTM redueix l'apoptosi de les cèl·lules glomerulars

La tinció d'etiquetatge d'extrem dUTP mediada per desoxinucleotidil transferasa terminal va mostrar una disminució significativa del nombre de cèl·lules apoptòtiques en glomèruls de ratolins TGFb1-TG tractats amb rhTM en comparació amb glomèruls de ratolins TGFb{1- TG tractats amb SAL (complementari). Figura S10A i B). La divisió de la caspasa-3 també es va reduir significativament als teixits renals de ratolins TGFb1-TG tractats amb rhTM en comparació amb els teixits renals de ratolins TGFb{1-TG tractats amb SAL (figura suplementària S10C). Elteixits renalsdels ratolins TGFb1-TG tractats amb rhTM, en comparació amb els de TGFb{1-TG tractats amb SAL, van mostrar una elevació significativa dels nivells d'ARNm del limfoma de cèl·lules B 2 (Bcl-2), B - limfoma cel·lular extragran (Bcl-XL), un inhibidor baculoviral de l'apoptosi que conté repeticions 5 (BIRC5, també conegut com a survivina) i BIRC6 (Apollon) amb una proporció Bcl-2-Bax augmentada (figura suplementària S11). ).

Figura 3|El ratolí transgènic (TG) del factor de creixement transformant humà b1 (TGFb1) té una disfunció renal. (a) La proteïna total i (b) el nitrogen ureic sanguini (BUN) es van mesurar mitjançant mètodes colorimètrics i la creatinina mitjançant un mètode enzimàtic. El nombre de ratolins per a l'avaluació de plasma i orina: per a ratolins de tipus salvatge (WT), n ¼ 12 a les 4 setmanes, n=7 a les 8 i 12 setmanes i n=4 a les 16 i 2{ {21}} setmanes; per a ratolins TG, n =24 a les 4 setmanes, n=17 a les 8 i 12 setmanes, i n=9 a les 16 i 20 setmanes. Les dades s'expressen com a mediana ± interval interquartil. Anàlisi estadística mitjançant la prova U de Mann-Whitney. *P <0,05, **p=""><0,01, ****="" p=""><>

rhTM inhibeix l'apoptosi dels podòcits

El pretractament dels podòcits amb rhTM va disminuir significativament l'apoptosi dels podòcits cultivats en presència de TGFb1, avaluat pel nombre de cèl·lules en la fase subG1 (3, 2 per cent enfront del 5, 2 per cent), cèl·lules terminals dUTP mediades per la desoxinucleotidil transferasa (etiquetatge final de nick-positiu). 1.0 vs. 5,4 cèl·lules/Fifield) i el grau d'escissió de la caspasa-3 (0proporcions {0,9 vs. 1,1) (figura 6a-e). El cribratge de factors antiapoptòtics en podòcits cultivats va demostrar que rhTM augmenta significativament l'expressió d'ARNm del factor antiapoptòtic Bcl-2 en comparació amb l'expressió en cèl·lules no tractades (figura suplementària S12). L'expressió d'ARNm del factor antiapoptòtic BIRC5 també va augmentar a les cèl·lules tractades amb rhTM en comparació amb l'expressió a les cèl·lules no tractades (figura suplementària S12). L'expressió d'ARNm del factor proapoptòtic Bax es va reduir significativament amb el tractament amb rhTM en comparació amb cap tractament (figura suplementària S12). El tractament amb rhTM també va inhibir de manera significativa l'expressió de l'annexina V i la tinció d'etiquetatge final de dUTP mediada per desoxinucleotidil transferasa en podòcits cultivats en presència de peròxid d'hidrogen (figura suplementària S13A-E) i en condicions de glucosa elevada (figura suplementària S14A-E). ) confirmant encara més la propietat antiapoptòtica de rhTM als podòcits. L'exploració de la via antiapoptòtica de la proteïna cinasa B (Akt)25 va demostrar que rhTM va millorar la fosforilació d'Akt en podòcits primaris humans cultivats en presència de peròxid d'hidrogen o TGFb1 (figura suplementària S15A i B). A continuació, vam aïllar podòcits de cada grup de ratolins i vam avaluar la fosforilació Akt mitjançant Western blotting. Hi va haver una fosforilació significativament millorada d'Akt en podòcits aïllats del grup TGFb{{30}TG/rhTM en comparació amb podòcits del grup no tractat (proporcions 1, 1 vs. 0, 7) (figura suplementària S16A i B).

Mediació GPR15

Estudis anteriors van informar que la TM activa les vies intracel·lulars mitjançant la interacció amb el receptor 1 del factor de creixement dels fibroblasts (FGFR1) iReceptor acoblat a proteïnes G15 (GPR15).26,27 Els podòcits expressen FGFR128, però no està clar si expressen GPR15. Aquí vam aïllar podòcits de cada grup de ratolins i vam demostrar que els podòcits també expressen GPR15 (figura suplementària S17A-E). Vam trobar que els podòcits de control sa i un pacient amb glomeruloesclerosi també expressen GPR15 (figura suplementària S18). Per aclarir si FGFR1 o GPR15 media l'activitat inhibidora de rhTM en l'apoptosi dels podòcits, es va avaluar l'activitat antiapoptòtica de rhTM en podòcits tractats amb TGFb1-en presència d'inhibidor de FGFR1 o després de transfectar les cèl·lules amb un petit ARN interferent (siRNA) contra FGFR1 o GPR15. El pretractament dels podòcits amb inhibidor de FGFR1 (figura suplementària S19A i B) o siRNA de FGFR1 (13, 2 per cent enfront del 7, 9 per cent) (figura 7a i b) no va poder abolir l'activitat inhibidora de rhTM sobre l'apoptosi dels podòcits. Tanmateix, la transfecció de cèl·lules amb siRNA GPR15 va abolir completament l'activitat inhibidora de rhTM (14,6 per cent enfront del 13,8 per cent) aapoptosi dels podòcits(Figura 7a–c).

Figura 4|La trombomodulina humana recombinant (rhTM) inhibeix la glomeruloesclerosi i la fibrosi tubulointersticial. Es van tacar seccions de teixit renal (a, b) amb àcid periòdic-Schiff i (c, d) amb tricrom de Masson i (e) es van quantificar mitjançant un sistema de puntuació o el programari d'imatge WinROOF. (e) El valor mitjà del grup de tipus salvatge (WT)/salí (SAL) es va prendre com a 100 per cent. Anàlisi estadística mitjançant la prova U de Mann-Whitney. ( f ) El contingut d'hidroxiprolina dels teixits es va mesurar mitjançant un mètode colorimètric, la concentració de col·lagen I-a1 (Col1a1) i periostina mitjançant immunoassaig enzimàtic i l'expressió d'ARNm per reacció en cadena transcriptasa-polimerasa inversa. Anàlisi estadística de Kruskal Wallis anàlisi de variància i prova de Dunn corregida. n=8 a cada grup. Barres {{10}} (a,c) 50 mm i (d) 20 mm. Les dades s'expressen com a mediana ± interval interquartil. *P <0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, ****p=""><0,0001. tg,="" transgènic;="" tgfb1,="" factor="" de="" creixement="" transformador="" b1.="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

rhTM inhibeix l'EMT dels podòcits

Hi va haver una àrea significativament augmentada amb tinció positiva per a la podocina i l'actina del múscul llis a (a-SMA) (1,4 per cent enfront de l'11,2 per cent) en ratolins TGFb1-TG/SAL en comparació amb TGFb1-TG / ratolins rhTM (figura 8a i b). A continuació, vam cultivar podòcits humans primaris in vitro, pretractats amb rhTM abans d'afegir proteïna TGFb1 al medi de cultiu. La morfologia semblant als fibroblasts i l'expressió millorada d'a-SMA es van suprimir en els podòcits tractats amb rhTM en comparació amb les cèl·lules no tractades (figura suplementària S20A). A més, rhTM va inhibir l'expressió d'ARNm de fibronectina i vimentina, tot i que va millorar l'expressió d'ARNm d'E-cadherina en podòcits en comparació amb l'expressió en cèl·lules no tractades (figura suplementària S20B). Els membres de la família SMAD 2 (Smad2) i Smad3 tenen un paper crític en la transició epitelial-mesenquimal (EMT) mediada per TGFb1-.29 El tractament amb rhTM va suprimir significativament l'activació de Smad2 i Smad3 en ratolins TGFb1-TG. en comparació amb els ratolins TG no tractats (figura 8c) i en podòcits humans cultivats en presència de TGFb1 (figura suplementària S20C).29 ratolins TG tractats amb rhTM (TGFb1-TG/rhTM) també mostren menys expressió d'a-SMA. (3,7 per cent enfront del 17,2 per cent) a les cèl·lules epitelials tubulars en comparació amb els seus homòlegs no tractats (figura suplementària S21A i B).

Figura 5|La trombomodulina humana recombinant (rhTM) millora la lesió renal i la disfunció renal. La creatinina es va mesurar mitjançant un mètode enzimàtic; proteïna total per mètode colorimètric; i nitrogen ureic en sang (BUN) i albúmina, molècula 1 de lesió renal (KIM-1), proteïna d'unió a àcids grassos L (L-FABP) i factor de creixement transformant total b1 (TGFb1) mitjançant assaig immune enzimàtic. n=8 a cada grup. Les dades s'expressen com a mediana ± interval interquartil. Anàlisi estadística mitjançant l'anàlisi de la variància de Kruskal-Wallis i la prova de Dunn no corregida. * P <{{10}}.05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, ****="" p=""><0,0001, #p="0.06." ns,="" no="" significatiu;="" sal,="" salina;="" tg,="" transgènic;="" wt,="" tipus="">

GPR15 media l'activitat inhibidora de rhTM en EMT

La transfecció de podòcits amb siRNA de FGFR1 no va poder abolir l'activitat inhibidora de rhTM sobre les expressions relatives d'ARNm tant del col·lagen I-a1 com de l'a-SMA en podòcits tractats amb TGFb 1- (figura suplementària S22). Tanmateix, la transfecció de cèl·lules amb siRNA GPR15 va abolir significativament l'activitat inhibidora de rhTM sobre les expressions relatives d'ARNm tant de col·lagen I-a1 com de a-SMA en podòcits tractats amb TGFb1- (figura suplementària S22).

DISCUSSIÓ

TGFb1 i lesió de cèl·lules glomerulars

La conseqüència comuna dels trastorns que causen ERC és la fibrosi renal.8,30,31 TGFb1 és el motor comú de la fibrogènesi en els ronyons associada a la ERC causada per malalties com la DM, la hipertensió arterial i els trastorns autoimmunes.10 Cèl·lules del glomèrul i dels espais tubulointersticials. pot secretar les formes latents de TGFb1 que, quan s'activen excessivament durant la lesió dels teixits, poden provocar cicatrius renals.32 Com que TGFb1 pot estimular la seva pròpia secreció, el procés fibròtic generalment es converteix en un cercle viciós.8 Un esdeveniment primerenc en el procés patogènic de TGFb 1- va mediarfibrosi renalés una lesió de podòcits i cèl·lules endotelials glomerulars.33–35 El nivell plasmàtic de TM soluble és un marcador de lesió endotelial. D'acord amb el paper de TGFb1 en la lesió de les cèl·lules renals, aquí hem trobat una correlació significativa de TGFb1 actiu amb TM soluble, podocina soluble i creatinina al plasma de pacients amb DM. Conversació entre cèl·lules endotelials glomerulars i podòcits durant alesió renalcondueix a una expressió local de proteases que provoquen la degradació de la membrana basal glomerular.34–36 Això pot explicar la detecció de podocina soluble i la seva correlació significativa amb la TM soluble en els nostres pacients amb DM.

Figura 6|La trombomodulina humana recombinant (rhTM) suprimeix l'apoptosi dels podòcits induïda pel factor de creixement transformant b1 (TGFb1). ( a ) rhTM es va afegir al medi de cultiu de podòcits 1 hora abans d'induir l'apoptosi amb 10 ng/ml TGFb1 durant 48 hores. ( b ) El percentatge de cèl·lules a la fase subG1 es va detectar mitjançant citometria companya. (a,b) n=3 a cada grup. ( c, d ) El nombre de cèl·lules amb fragmentació de l'ADN es va mesurar mitjançant l'anàlisi d'etiquetatge final de nick dUTP (TUNEL) mediada per desoxinucleotidil transferasa (n=3 en grups salins [SAL]/SAL i rhTM/SAL; n=6 en els grups SAL/TGFb1 i rhTM/TGFb1) i (e) es va mesurar el grau de divisió de la caspasa-3 mitjançant Western blotting (n=4 a cada grup). Barres=100 mm. Les dades s'expressen com a mediana ± interval interquartil. Anàlisi estadística mitjançant la prova U de Mann-Whitney. *P <0,05. dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenilindol;="" hpf,="" camp="" d'alta="" potència;="" ns,="" no="" significatiu.="" els="" histogrames="" es="" mostren="" com="" a="" percentatge="" màxim="" (percentatge="" del="" valor="" màxim),="" escalant="" cada="" corba="" al="" mode="100" percentatge="" .="" per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

Fibrosi renal associada a la sobreexpressió de TGFb1 humà específic del podòcit

Un fàrmac que pugui contrarestar l'efecte del TGFb1 seria ideal per bloquejar la fibrosi renal. Aquí hem generat un ratolí TG que sobreexpressa el gen TGFb1 humà al glomèrul que desenvolupa esclerosi glomerular espontània i progressiva i fibrosi tubulointersticial amb insuficiència renal tan aviat com 4 setmanes després del naixement. El model mostra una glomerulopatia avançada amb lesió de podòcits i cèl·lules endotelials glomerulars; engrossiment de la membrana basal glomerular i expansió mesangial amb cicatrius intersticials; augment dels marcadors de lesió del teixit renal i disfunció renal; i augment de TGFb1 al plasma,teixit renal, i orina. L'augment de l'excreció urinària de proteïnes, TGFb1 i l'activació del sistema del complement poden explicar el desenvolupament simultània de cicatrius intersticials en el nostre model actual.37–40 Experiments posteriors van revelar un augment de les cèl·lules apoptòtiques i l'activació de proteïnes Smad al teixit renal a partir de TGFb no tractat. {3}}Ratolins TG en comparació amb ratolins WT. En general, aquestes troballes assenyalen aquest nou ratolí TGFb1-TG com un model adequat per al descobriment de fàrmacs enfibrosi renal.

Figura 7|El receptor acoblat a proteïna G (GPR15) media la inhibició de la trombomodulina humana recombinant de l'apoptosi (rhTM) als podòcits. Les cèl·lules de podòcits primaris humans es van transfectar amb el receptor 1 del factor de creixement de fibroblasts (FGFR1) petit ARN interferent (siRNA), GPR15 siRNA o siRNA remenat durant 48 hores, i després es va afegir rhTM al cultiu cel·lular 1 hora abans de tractar-lo amb el factor de creixement transformant b1 (TGFb1). Les cèl·lules apoptòtiques es van (a) avaluar mitjançant citometria de companys i (b) després es van quantificar. ( c ) Es van preparar lisats cel·lulars per a Western blotting. n{{10}} a cada grup. Les dades s'expressen com a mediana ± interval interquartil. Anàlisi estadística mitjançant la prova U de Mann-Whitney. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="">

Figura 8|Inhibició de la transició epitelial-mesenquimal per la trombomodulina humana recombinant (rhTM). ( a ) La podocina i l'actina muscular llisa (a-SMA) es van tacar tal com es descriu als Mètodes. ( b ) L'àrea positiva per a la tinció d'a-SMA es va quantificar pel programari de processament d'imatges WinROOF. n=3 en grups de tipus salvatge (WT)/salí (SAL) i WT/rhTM i n=5 enfactor de creixement transformador-b1-transgènic(Grups TGFb{{0}}TG)/SAL i TGFb1-TG/rhTM. ( c ) Les proteïnes totals (t) i fosforilades (p) dels membres de la família SMAD (Smad) es van avaluar mitjançant Western blotting. n=8 a cada grup. Les dades s'expressen com a mediana ± interval interquartil. Anàlisi estadística mitjançant anàlisi de variància Kruskal-Wallis i prova de Dunn corregida. *P <0.05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, #p="0,08." per="" optimitzar="" la="" visualització="" d'aquesta="" imatge,="" consulteu="" la="" versió="" en="" línia="" d'aquest="" article="" a="">

rhTM millora la fibrosi renal

Hem demostrat que la rhTM millora la fibrosi pulmonar desenvolupada en ratolins que sobreexpressen TGFb1 humà als pulmons mitjançant la supressió de l'apoptosi de les cèl·lules epitelials alveolars.41 Els assaigs clínics també han demostrat la millora de la fibrosi pulmonar idiopàtica després del tractament amb rhTM.42,43 Aquestes observacions anteriors suggereixen aquestes observacions anteriors per a la teràpia de la fibrosi d'òrgans. Vam plantejar la hipòtesi que rhTM seria eficaç en la fibrosi renal associada a TGFb1-. Per provar aquesta hipòtesi, vam tractar ratolins TGFb1-TG específics del ronyó amb rhTM.44 L'administració de rhTM durant 4 setmanes va atenuar significativament la lesió, la disfunció i la fibrosi dels ronyons. Els ratolins tractats amb rhTM van mostrar nivells urinaris baixos de proteïna total, albúmina, TGFb1, C5a i nivells renals reduïts de citocines profibròtiques, C5a i HMGB1.45 La teràpia amb rhTM també va inhibir tant l'apoptosi com l'EMT dels podòcits. Tanmateix, rhTM no va exercir cap efecte sobre el complex de trombina antitrombina, un marcador d'activació de la coagulació, tot i que va augmentar la generació d'APC, un factor anticoagulant amb activitat antiinflamatòria i antiapoptòtica23. Val la pena assenyalar que la trombina, l'enzim procoagulant, pot paradoxalment promouen l'anticoagulació en estats protrombòtics de baix grau formant el complex TM/trombina, que augmenta la generació de l'APC anticoagulant. Tanmateix, la trombina funciona principalment com a procoagulant en estats protrombòtics excessius (per exemple, sèpsia).46 Aquest efecte dual i paradoxal de la trombina pot explicar l'aparent ineficàcia de la rhTM per inhibir l'activació de la coagulació en el nostre model, que es troba en un estat protrombòtic de baix grau. . En general, aquestes observacions suggereixen que rhTM amelio-taxa la fibrosi progressiva i la disfunció de laronyonsallargant la supervivència o prevenint l'EMT de les cèl·lules glomerulars i suprimint la inflamació, l'activació del complement i l'activitat del factor de creixement directament o indirectament mitjançant l'activació de la via de la proteïna C i la reducció de l'expressió de HMGB1. La millora de la nefropatia diabètica en ratolins amb un augment del domini semblant a la lectina TM circulant i el deteriorament de la malaltia en els ratolins que no tenen el domini semblant a la lectina donen suport a l'efecte beneficiós de la rhTM sobre la fibrosi renal.20,21.

Inhibició de l'apoptosi dels podòcits

Els podòcits tenen un paper crític en el manteniment de la barrera de filtració glomerular i en la formació del diafragma d'escletxa per evitar la pèrdua de proteïnes circulants essencials.47Lesió renalcausada per espècies reactives d'oxigen, glucosa alta o mediadors inflamatoris, inclòs TGFb1, indueix l'apoptosi dels podòcits que condueix a l'esgotament dels podòcits que pot acabar provocant una disfunció renal.47 Després d'unir i activar el complex receptor transmembrana heteromèric tipus I i tipus II de serina/treonina cinasa. , TGFb1 emet senyals intracel·lulars a través de la família de factors de transcripció Smad o a través de vies de senyalització independents de Smad.48 L'activació de la via dependent de Smad es produeix quan el receptor TGFb1 activat fosforila Smad2 i Smad3, que amb Smad4 es transloquen al nucli.2/49 L'Smad. El complex Smad3/Smad4 estimula la transcripció dels factors proapoptòtics i redueix la dels factors antiapoptòtics que condueixen a l'apoptosi cel·lular.49 D'acord amb això, hem trobat l'elevat nivell renal del factor proapoptòtic Bax i un nivell baix dels factors antiapoptòtics Bcl2 i Bcl-XL. en ratolins TGFb1- TG. La TM pot inhibir l'apoptosi de diferents tipus de cèl·lules.21,41,49 D'acord amb això, aquí hem trobat que rhTM inhibeix l'apoptosi dels podòcits induïda per peròxid d'hidrogen, glucosa alta o TGFb1, i aquesta troballa pot explicar l'efecte beneficiós de rhTM en la ERC. . A més, rhTM va inclinar l'equilibri cap a la inhibició de l'apoptosi reduint l'expressió de Bax, augmentant l'expressió de Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 i BIRC6 i augmentant l'activació de la via Akt ateixits renals. En general, aquestes observacions suggereixen que rhTM estimula la supervivència dels podòcits afavorint l'activació d'Akt i l'expressió del factor antiapoptòtic.

cistanche per a la malaltia renal crònica

Inhibició de l'EMT

L'EMT dels podòcits també contribueix a la fibrosi renal. Els podòcits sotmesos a EMT alliberen proteïnes de la matriu extracel·lular que s'acumulen i es dipositen durant la fibrogènesi renal associada a TGFb1-50. TGFb1 promou l'EMT mitjançant l'activació mediada pel receptor del complex Smad2/Smad3/Smad4. Smad3 fosforilat promou l'EMT estimulant la transcripció de proteïnes de la matriu i reduint l'expressió de marcadors epitelials.51 D'acord amb això, vam trobar un augment de l'EMT de podòcits en ratolins TGFb1-TG i podòcits cultivats en presència de TGFb1 o menys. condicions oxidants o de glucosa alta. Informes anteriors van suggerir que rhTM suprimeix EMT.52,53 Aquí vam trobar que rhTM inhibeix l'EMT de podòcits i cèl·lules epitelials tubulointersticials en ratolins TGFb1-TG. La inhibició de l'activació de la proteïna Smad sembla ser el mecanisme de l'efecte beneficiós de rhTM sobre l'EMT perquè els ratolins TGFb1-TG i els podòcits primaris tractats amb rhTM van representar una fosforilació significativament reduïda de Smad2 i Smad3 en comparació amb condicions no tractades. Aquestes troballes donen suport a l'activitat inhibidora de la TM a l'EMT.

Mediació del receptor en l'activitat protectora de rhTM

Estudis anteriors han demostrat que GPR15 o FGFR1 media l'activitat citoprotectora de TM.26,27,54 Hem provat si aquests receptors medien l'activitat protectora de rhTM contra l'apoptosi i l'EMT. Si bé la regulació a la baixa de la proteïna GPR15 per siRNA va abolir completament l'activitat supressiva de rhTM en l'apoptosi mediada per TGFb1-de podòcits, ni el siRNA de FGFR1 ni el seu inhibidor la van abolir, cosa que suggereix que GPR15 media l'activitat protectora de rhTM. Hi va haver una fosforilació millorada d'Akt en podòcits cultivats i podòcits aïllats de ratolins TGFb1-TG després del tractament amb rhTM, cosa que suggereix la implicació de la via intracel·lular Akt. Un treball que mostra que rhTM activa la via Akt a les cèl·lules endotelials dóna suport a aquesta troballa.55 L'activació de la via de senyalització Akt pot potenciar encara més l'efecte rhTM augmentant l'expressió superficial de GPR15.56 Aquestes observacions indiquen que rhTM protegeix els podòcits de l'apoptosi en el nostre TGFb{ {13}}Ratolins TG mitjançant l'activació de l'eix GPR15/Akt que condueix a una expressió millorada de factors antiapoptòtics i una disminució de l'expressió de factors proapoptòtics.57 D'altra banda, estudis anteriors van demostrar que les anafilatoxines C3a i C5a a través dels seus GPR poden contribuir a La CKD lesionant els podòcits i que l'APC pot inhibir l'apoptosi dels podòcits i la fibrosi renal mitjançant el seu receptor de proteïna C endotelial i el seu receptor activat per proteasa 1.23,58-61 Aquí, vam trobar que rhTM inhibeix el sistema del complement i augmenta la generació d'APC. Per tant, a part de l'activació de la via GPR15/Akt, la inhibició dels factors del complement i l'augment de l'activació de la proteïna C i els seus receptors també poden explicar els efectes beneficiosos de rhTM en el nostre TGFb1-associat.model de fibrosi renal.

A més, la regulació a la baixa de GPR15 però no la de FGFR1 va bloquejar l'efecte inhibidor de rhTM sobre l'EMT, cosa que suggereix que GPR15 també media aquesta activitat protectora de rhTM. La inhibició de les proteïnes Smad està implicada en la supressió de l'EMT perquè el tractament amb rhTM va inhibir la fosforilació tant de Smad2 com de Smad3 en ratolins TGFb1-TG i podòcits cultivats. Tanmateix, el mecanisme precís de la inhibició de la proteïna Smad mitjançant GPR15 no està clar. Algunes proves mostren que la via Akt pot interaccionar i regular amb la via de senyalització de Smad,62–64 i que Akt pot prevenir la fosforilació de Smad3 interaccionant directament amb Smad3 no fosforilat per segrestar-lo fora del nucli, provocant la inhibició de la transcripció i l'EMT.62– 64 A partir d'aquests informes, és concebible que Akt s'hagi activat després de la unió de rhTM a GPR15 segresta Smad3 no fosforilada que condueixi a la inhibició de l'EMT dels podòcits. Val la pena assenyalar que aquest efecte beneficiós mediat per Akt s'observa només en cèl·lules no malignes.65–67 En cèl·lules malignes, la interacció de TGFb1 amb els seus receptors pot activar directament la via fosfoinosítid 3-quinasa/Akt/Cargol i provocar EMT.65–67 En general, els resultats del nostre estudi donen suport al paper de GPR15 com a receptor que media els efectes beneficiosos de rhTM sobre els podòcits.

Conclusió

En resum, aquí informem per primera vegada d'un nou ratolí transgènic TG que sobreexpressa la longitud completa del gen TGFb1 humà específicament en glomèruls que desenvolupen esclerosi glomerular espontània i progressiva, fibrosi tubulointersticial iinsuficiència renal, i la millora de la fibrosi renal/insuficiència renal establerta mitjançant la interacció rhTM amb GPR15 que inhibeix l'apoptosi i la transició mesenquimal dels podòcits.

MÈTODES

Generació del ratolí TGFb1 BAC TG

El ratolí TGFb1-BAC-TG que expressava el gen TGFb1 humà de longitud completa sota el control del promotor de la podocina del ratolí es va generar mitjançant injecció pronuclear en 392 embrions de ratolí C57BL/6J (CLEA Japan, Inc., Tòquio, Japó). Hem avaluat els fundadors de TG i la transmissió de la línia germinal de la construcció BAC TG mitjançant Southern blotting (materials i mètodes suplementaris).

Animals experimentals

Els ratolins TGFb1-TG es van criar durant més de 10 generacions amb fons C57BL/6 abans d'utilitzar-los als experiments. Els companys de camada WT es van utilitzar com a animals de control. Tots els animals es van mantenir en un entorn específic lliure de patògens i es van sotmetre a un cicle de llum-foscor 12-hores a una temperatura i humitat ambientals que oscil·laven entre els 22 i els 26 graus i el 40 i el 70 per cent, i amb accés ad libitum. al menjar i l'aigua a la casa dels animals de la Universitat de Mie (materials i mètodes suplementaris).

Declaració ètica

El Comitè de Seguretat de l'Experiment d'ADN recombinant (aprovació núm. I-629; data: 19 de setembre de 2013) i el Comitè d'Investigació Animal de la Universitat de Mie (aprovació núm. 27-4; data: 19 d'agost de 2015) va aprovar els protocols de l'estudi. Tots els procediments amb animals es van realitzar d'acord amb les directrius institucionals de la Universitat de Mie i seguint els principis de cura dels animals de laboratori aprovats internacionalment publicats per l'Institut Nacional de Salut (https://olaw.nih.gov/).

Per a la investigació clínica, es va donar el consentiment informat per escrit de tots els pacients i subjectes sans, i el protocol d'estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ètica per a la Investigació Clínica de la Universitat de Mie (aprovació núms. 1043 i 2194).

Disseny experimental

Per a la caracterització delronyómodel de fibrosi, vam assignar ratolins masculins TGFb{{0}}TG (n=24) i ratolins masculins WT (n=12) de 4 setmanes d'edat i amb un pes de 20 a 23 g en 3 grups amb 8 ratolins TGF b1-TG i 4 ratolins WT a cada grup. Els ratolins de cada grup WT i TGFb1-TG van ser sacrificats les setmanes 0, 8 o 16 per recollir mostres d'orina, sang i ronyó per avaluar els canvis en la fibrosi i els paràmetres de la funció renal al llarg del temps.

Per avaluar l'eficàcia terapèutica de rhTM (rhTM va ser amablement proporcionat per Asahi Kasei Pharma Corporation, Tòquio, Japó) en fibrosi renal, ratolins TGFb1-TG (n= 8) o companys de camada WT (n {{2} }}) es van tractar amb rhTM (3 mg/kg) per injecció ip, 3 vegades a la setmana durant les 4 setmanes anteriors a la mort dels ratolins. Els ratolins TGFb1-TG (n =8) o els companys de camada WT (n= 8) ​​que rebien una quantitat igual de SAL fisiològica per injecció ip es van utilitzar com a ratolins de control negatiu.

El protocol del present estudi va seguir les directrius d'investigació animal: Informes d'experiments in vivo (ARRIVE) per a la investigació amb animals. Els ratolins van ser aleatoritzats i els investigadors que van mesurar els paràmetres van ser cegats als grups de tractament.

Anàlisi bioquímica

Les concentracions de proteïna total (kit d'assaig de proteïnes BCA; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), proteïna quimioattractora de monòcits-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), complex de trombina antitrombina (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canadà) es van mesurar mitjançant kits comercials d'immunoassaig enzimàtic seguint les instruccions del fabricant (Materials i mètodes suplementaris).

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules primàries dels podòcits humans es van comprar a CELPR OGEN (Torrance, CA). Les cèl·lules primàries de podòcits humans es van cultivar en el medi Eagle modificat de Dulbecco en una atmosfera humidificada, al 5% de CO2 a 37 graus. El medi es va complementar amb sèrum boví fetal inactivat per calor al 10% (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 UI/ml de penicil·lina, 100 mg/ml d'estreptomicina i L-glutamina (materials i mètodes suplementaris).

Anàlisi estadística

Les dades s'expressen com a mediana ± interval interquartil. La diferència estadística entre les variables es va calcular mitjançant l'anàlisi de la variància de Kruskal-Wallis amb l'anàlisi post hoc mitjançant la prova de Dunn. Es va utilitzar la prova U de Mann-Whitney per avaluar les diferències entre 2 grups. Les anàlisis estadístiques es van fer amb GraphPad Prism versió 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). La significació estadística es va considerar com a P <>

DIVULGACIÓ

ECG, CND-G i YY tenen una patent sobre el ratolí TGFb1-TG ambfibrosi renalutilitzat en el present estudi. CND-G i YY van rebre una subvenció del Ministeri d'Educació, Cultura, Esports, Ciència i Tecnologia del Japó per al present estudi. ECG, TY, CND-G i MT van rebre una subvenció de Shionogi Pharmaceuticals. Tots els altres autors no van declarar interessos en competència.

AGRAÏMENTS

Aquesta investigació va comptar amb el suport en part de subvencions del Ministeri d'Educació, Cultura, Esports, Ciència i Tecnologia del Japó (Kakenhi núm. 17K09824 per a YY; Kakenhi núm. 17K08442 per a CND-G) i en part per una subvenció de Shionogi & Co, Ltd., Japó. Els finançadors no van tenir cap paper en el disseny de l'estudi, l'anàlisi de dades, la decisió de publicar o la preparació del manuscrit.

Part d'aquest treball es va publicar en forma de resum.

APORTACIONS DE L'AUTOR

AT va preparar el model de malaltia i va escriure el primer esborrany del manuscrit. TY, KN, TT, RI i CND-G van preparar els models de malaltia i van mesurar els paràmetres. AM i SW van realitzar l'estudi microscòpic de transmissió. MT, YO i AU van mesurar paràmetres i van realitzar els experiments in vitro. YT, LQ, TK i VFD van aportar contribucions intel·lectuals. YY i ECG van corregir l'esborrany del manuscrit i van dissenyar l'estudi.

cistanche per als símptomes d'insuficiència renal

MATERIAL COMPLEMENTARI

Fitxa suplementària (PDF) Materials i mètodes suplementaris.

Taula S1. Característiques de les assignatures.

Taula S2. Primers per a RT-PCR de teixits de ratolí.

Taula S3. Primers per a RT-PCR de podòcits humans.

Figura S1. Els fragments de trombomodulina solubles es correlacionen amb TGFb1 i creatinina en pacients amb DM.

Figura S2. Construcció de cromosoma artificial bacterià (BAC) TGFb1 humà. Figura S3. Ratolins fundadors que expressen la longitud completa del gen TGFb1 humà.

Figura S4. Caracterització del ratolí transgènic b1 del factor de creixement transformant específic del glomèrul.

Figura S5. El ratolí transgènic TGFb1 humà ha augmentat els marcadors de lesió renal.

Figura S6. La teràpia amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) redueix l'esborrament dels podòcits i l'engrossiment de la membrana basal glomerular.

Figura S7. Els ratolins transgènics TGFb1 tractats amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) tenen una baixa concentració de factors profibròtics i HMGB1 al teixit renal. Figura S8. La teràpia amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) augmenta la generació de proteïna C activada, inhibeix el sistema del complement, disminueix la podocina soluble circulant, encara que no exerceix cap efecte sobre el sistema de coagulació en ratolins transgènics TGFb1.

Figura S9. La teràpia amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) redueix la concentració d'orina de podocina.

Figura S10. La teràpia amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) redueix l'apoptosi de les cèl·lules glomerulars.

Figura S11. El tractament de la fibrosi renal associada a la sobreexpressió de TGFb1- amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) inhibeix l'apoptosi al teixit renal.

Figura S12. La trombomodulina humana recombinant (rhTM) augmenta l'expressió de factors antiapoptòtics als podòcits.

Figura S13. La trombomodulina humana recombinant (rhTM) suprimeix l'apoptosi dels podòcits induïda pel peròxid d'hidrogen.

Figura S14. La trombomodulina humana recombinant (rhTM) suprimeix l'apoptosi dels podòcits induïda per nivells elevats de glucosa.

Figura S15. La trombomodulina humana recombinant (rhTM) augmenta l'activació de les vies Akt als podòcits.

Figura S16. La teràpia amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) augmenta la fosforilació Akt en podòcits de ratolins TGFb1-TG.

Figura S17. Els podòcits de cada grup de tractament de ratolins expressen ARNm de GPR15.

Figura S18. Tinció de GPR15 en podòcits d'un individu sa i un pacient amb glomerulosclerosi segmentària focal.

Figura S19. El receptor del factor de creixement dels fibroblasts-1 no està implicat en l'activitat inhibidora de la trombomodulina humana recombinant (rhTM) als podòcits.

Figura S20. La trombomodulina humana recombinant (rhTM) inhibeix la transició epitelial-mesenquimal dels podòcits.

Figura S21. La teràpia amb trombomodulina humana recombinant (rhTM) inhibeix l'expressió de l'actina del múscul llis a als túbuls renals.

Figura S22. El receptor acoblat a proteïna G (GPR15) media l'activitat inhibidora de la trombomodulina humana recombinant (rhTM) en la transició epitelial-mesenquimal dels podòcits.

Referències complementàries.

REFERÈNCIES

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Malaltia renal crònica. Lanceta. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Avaluació de l'estat de salut renal global. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Salut renal mundial 2017 i més enllà: un full de ruta per tancar les llacunes en l'atenció, la investigació i les polítiques. Lanceta. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Prevalència, detecció, avaluació i gestió de la malaltia renal crònica. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Tractament de la malaltia renal crònica. Ronyó Int. 2012;81:351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. La propera generació de terapèutiques per a la malaltia renal crònica. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Fibrosi renal: nous coneixements sobre la patogènesi i la terapèutica. Ronyó Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Mecanismes cel·lulars i moleculars de la fibrosi renal. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. La reducció de la senyalització endotelial de TGF-beta és suficient per reduir la transició endotelial-mesenquimal i la fibrosi en la CKD. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. Senyalització de TGF-beta1/p53 a la fibrogènesi renal. Senyal cel·lular. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. La trombomodulina i el seu paper en la inflamació. Semin Immunopathol. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. La trombomodulina i l'endoteli vascular: coneixements sobre aspectes funcionals, reguladors i terapèutics. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. La trombomodulina vincula la coagulació amb la inflamació i la immunitat. Objectius de fàrmacs Curr. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. La trombomodulina inhibeix l'activació dels eosinòfils i els mastòcits. Immunol cel·lular. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. La inhibició de l'asma bronquial al·lèrgica per la trombomodulina està mediada per cèl·lules dendrítiques. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Funcions de modulació dual de la trombomodulina a la via alternativa del complement. Tendències de Biosci. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. La trombomodulina modula les cèl·lules dendrítiques mitjançant els dos antagonismes de la proteïna B1 del grup d'alta mobilitat i un mecanisme independent. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. El domini semblant a la lectina de la trombomodulina interfereix amb l'activació del complement i protegeix contra l'artritis. J Tromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. La trombomodulina soluble protegeix els ronyons isquèmics. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. El domini semblant a la lectina de la trombomodulina millora la glomerulopatia diabètica mitjançant la inhibició del complement. Tromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, et al. El domini 1 de la trombomodulina millora la nefropatia diabètica en ratolins mitjançant la inflamació mediada per l'inflamsoma anti-NF-kappaB/NLRP3, la millora de l'activitat antioxidant de NRF2 i la inhibició de l'apoptosi. Diabetologia. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Activitat de trombomodulina soluble i antigen de trombomodulina soluble al plasma. J Tromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. La proteïna C activada exògena inhibeix la progressió de la nefropatia diabètica. J Tromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Millora de la diabetis per proteïna S. Diabetis. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptosi i lesió renal aguda. Ronyó Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, et al. FGFR1 media l'angiogènesi induïda pel domini de trombomodulina recombinant. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. La cinquena regió semblant al factor de creixement epidèrmic de la trombomodulina alleuja la sèpsia induïda per LPS mitjançant la interacció amb GPR15. Tromb Haemost. 2017;117:570–579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, et al. Identificació a tot el genoma de gens essencials per als citoesquelets de podòcits basats en la seqüenciació d'ARN unicel·lular. Ronyó Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, et al. La senyalització canònica de BMP a les cèl·lules tubulars media la recuperació després d'una lesió renal aguda. Ronyó Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Hipòxia crònica i lesió tubulointersticial: una via final comuna a la insuficiència renal terminal. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Malaltia renal crònica i les seves complicacions. Prim Care. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. Expressió renal de proteïnes de matriu fibròtica i d'isoformes del factor de creixement transformant beta (TGF-beta) en ratolins transgènics TGF-beta. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. La proteïna motora Myo1c regula la senyalització beta del factor de creixement transformant i la fibrosi en els podòcits. Ronyó Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, et al. El receptor d'endotelina-A media la degradació de la capa de la superfície endotelial glomerular mitjançant la diafonia patològica entre els podòcits activats i les cèl·lules endotelials glomerulars. Ronyó Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Lesió de cèl·lules endotelials glomerulars i diàleg creuat en la malaltia renal diabètica. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287–F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, et al. La microscòpia electrònica d'escaneig modificada revela la diafonia patològica entre les cèl·lules endotelials i els podòcits en un model murí de glomerulonefritis membranoproliferativa. Ciència Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Les cèl·lules tubulars proximals promouen la fibrogènesi mitjançant la inducció mediada per TGF-beta1-de miofibroblasts peritubulars. Ronyó Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Lesió del túbul renal: una força impulsora cap a la malaltia renal crònica. Ronyó Int. 2018;93:568–579.

39. Loefffler I, Wolf G. Transforming growth factor-beta and the progression of renal disease. Trasplantament de Nephrol Dial. 2014;29(suppl 1):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Factor de creixement transformant urinari-beta en pacients amb malalties glomerulars. Pediatr Nefrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Inhibició de l'apoptosi cel·lular i millora de la fibrosi pulmonar per trombomodulina. Sóc J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Trombomodulina humana recombinant en l'exacerbació aguda de la fibrosi pulmonar idiopàtica. pit. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Trombomodulina per a les exacerbacions agudes de la fibrosi pulmonar idiopàtica: un estudi de prova de concepte. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Selecció òptima del pacient per a la teràpia anticoagulant en la sèpsia: una proposta basada en l'evidència del Japó. J Tromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, et al. El paper del quadre de grup 1 d'alta mobilitat (HMGB1) en la patogènesi de les malalties renals. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Efectes diferencials de la trombina depenent de la dosi en l'asma bronquial al·lèrgica. J Tromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. Nous coneixements sobre la biologia dels podòcits en la salut i la malaltia glomerulars. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Vies dependents de Smad i independents de Smad en la senyalització de la família TGF-beta. Naturalesa. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mecanismes de l'apoptosi mediada per TGF-beta. Teixit cel·lular Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Biologia cel·lular i patologia dels podòcits. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. Orientació a la senyalització TGF-beta en la fibrosi renal. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, et al. La trombomodulina influeix en la supervivència dels pacients amb càncer colorectal no metastàtic mitjançant la transició epitelial-mesenquimal (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. La trombomodulina redueix el potencial tumorigènic i metastàsic de les cèl·lules canceroses de pulmó mitjançant la regulació de l'E-cadherina i la baixada de l'expressió de la N-cadherina. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. El receptor 15 acoblat a proteïna G media l'angiogènesi i la funció citoprotectora de la trombomodulina. Ciència Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. La trombomodulina recombinant exerceix una acció anti-autofàgica a les cèl·lules endotelials i proporciona efecte anti-aterosclerosi en ratolins amb deficiència d'apolipoproteïna E. Ciència Rep. 2017;7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. Expressió superficial de proteïnes mediada per senyalització PI3K/Akt detectada pel motiu d'interacció 14-3-3. FEBRER J. 2009;276:5547–5558.

57. Sánchez-Capelo A. Doble funció del TGF-beta1 en l'apoptosi. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Proteïna C activada, receptor 1 activat per proteasa i neuroprotecció. Sang. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. La proteïna C activada protegeix contra la nefropatia diabètica mitjançant la inhibició de l'apoptosi endotelial i dels podòcits. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. El paper de les anafilatoxines en la salut i la malaltia. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D, et al. El bloqueig del receptor C3a protegeix els podòcits de lesions en la nefropatia diabètica. JCI Insight. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Akt interacciona directament amb Smad3 per regular la sensibilitat a l'apoptosi induïda per TGF-beta. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Cooperació de la via de senyalització en la transició epitelial-mesenquimal induïda per TGF-beta. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt modula la senyalització TGF-beta mitjançant una interacció directa amb Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. TGF-beta promou la senyalització PI3K-AKT i la migració de cèl·lules de càncer de pròstata mitjançant la ubiquitilació mediada per TRAF6-de p85alpha. Senyal Sci. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z, et al. Efectes de la dicotomia de la senyalització Akt en el càncer de mama. Càncer de Mol. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. La senyalització FAM83A indueix la transició mesenquimal epitelial per la via PI3K/AKT/Snail en NSCLC. Envelliment (Albany NY). 2019;11:6069–6088.