Els glucòsids totals de Cistanche Deserticola afavoreixen la recuperació de la funció neurològica induint la regeneració neurovascular mitjançant la via Nrf- 2/Keap-1 en rates MCAO/R-Ⅰ

INTRODUCCIÓ

Els ictus es consideren una de les principals causes de mort i discapacitat al món. Gairebé el 87% de tots els casos d'ictus són provocats per un ictus isquèmic. Actualment, l'agent més eficaç i l'únic medicament aprovat per la FDA que s'utilitzatractament de l'ictus isquèmicés un activador tissular recombinant del plasminogen. No obstant això, una gran quantitat de pacients amb ictus no responen a aquest fàrmac, a causa de la seva estreta finestra de temps terapèutica i del greu risc de complicacions hemorràgiques. Un repte important del tractament trombolític és la lesió per isquèmia/reperfusió (I/R), que es considera una causa principal de lesió cerebral i destrucció de la funció. La reperfusió després d'una isquèmia cerebral augmenta el risc d'hemorràgia cerebral alhora que condueix a lesions neurovasculars i produeixen espècies reactives d'oxigen (ROS) excessives que danyen la barrera hematoencefàlica. Diversos estudis han confirmat que la interrupció de la BBB és una de les principals causes de la patogènesi de l'ictus isquèmic.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER AL TRACTAMENT DE L'ACV ISCÈMIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

El BBB està format principalment per cèl·lules endotelials, pericits, astròcits, neurones i les membranes basals. Els components bàsics de la BBB són cèl·lules endotelials microvasculars cerebrals que estan unides per unions estretes, restringint així les molècules exògenes al cervell. Les alteracions patològiques de les unions estretes, en particular occludina, claudina-5 i zonula occludens-1 (ZO-1), afecten significativament la funció BBB durant un ictus isquèmic, especialment la permeabilitat de la barrera. Durant els períodes I/R, l'excés de ROS és un dels principals factors que condueixen al dany directe de les neurones cerebrals. La sobreproducció de ROS condueix a la degradació de determinades unions i a la interrupció de la BBB, la qual cosa fa que molècules exògenes entren al cervell a través de la BBB, donant lloc a un agreujament del dany cerebral. Per tant, la protecció del BBB mitjançant antioxidants s'ha considerat com una manera potencial de prevenir lesions de reperfusió.

A més de la ruptura de la BBB, I/R pot provocar lesions neurovasculars i mort neuronal. Durant un ictus, l'augment de la mort de les cèl·lules neuronals pot resultar de l'estrès oxidatiu i nombrosos estudis han demostrat que ROS agreuja la gravetat de l'ictus i el dany neurològic. Tot i que els assaigs clínics no han obtingut resultats satisfactoris, la neuroprotecció segueix sent una estratègia prometedora per al tractament de l'ictus isquèmic agut. Per tant, trobar fàrmacs de neuroprotecció efectius per tractar els ictus és un benefici per als pacients amb ictus.

La medicina tradicional xinesa (MTC) pren mesures per intervenir contra el desequilibri intern del cos. A causa de la complexa patogènesi dels ictus isquèmics, l'efecte multifactorial de la MTC i els seus components actius tenen un paper crític en el tractament dels ictus.Cistanchedeserticola YC Ma, estès a les zones àrides o semiàrides de Mongòlia i el nord-oest de la Xina, ha estat una herba de TCM molt utilitzada per al tractament de diverses malalties com l'oblit i la depressió durant més d'1,000 anys a la Xina. Els estudis farmacològics moderns van indicar que els extractes bruts de C. deserticola mostraven múltiples activitats farmacològiques, com aramillora la funció d'aprenentatge i memòria, neuroprotecció, immunitat, efectes antioxidants, antienvelliment i antifatiga. L'anàlisi química de C. deserticola va demostrar que els seus components principals inclouenglicòsids feniletanoides, glicòsids iridoides, polisacàrids i oligosacàrids. Tanmateix, els components actius de C. deserticola per a la protecció del cervell no estan molt clars.

La propietat neuroprotectora de C. deserticola implica el seu potencial terapèutic en malalties cognitives relacionades com l'ictus i la depressió, així com la malaltia d'Alzheimer. Tanmateix, la investigació sobre l'impacte de C. deserticola en els ictus, inclosos els seus components actius i mecanismes d'acció, és molt limitada. En el treball actual, hem explorat l'efecte protector de tres extractes de C. deserticola, glicòsids totals (TG, glicòsids feniletanoides i altres glicòsids), polisacàrids (PS) i oligosacàrids (OS) sobre lesions cerebrals I/R. Les nostres troballes poden contribuir a l'aplicació clínica precisa de C. deserticola i proporcionar un agent candidat perteràpia de l'ictus isquèmic.

MATERIALS I MÈTODES

Productes químics i reactius

Les tiges de Cistanche deserticola van ser comprades a Alashan, Mongòlia Interior, i identificades per un dels autors (P.-F. Tu). Els TG, els PS i els SO es van preparar segons el nostre mètode informat anteriorment. L'anàlisi quantitativa dels TG es va realitzar mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) tal com s'ha descrit anteriorment, i el seu cromatograma es mostra a la figura 1. Els components principals dels TG són l'equinacòsid, el tubulòsid A, l'acteòsid, l'isoacteòsid i el 2'-acetilacteòsid; els seus continguts són 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g i 12,045 mg/g, respectivament. Els continguts de PS i OS són del 69,42% i del 65,24%, respectivament, segons es determina per HPLC i l'anàlisi fenol-àcid sulfúric, respectivament.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER AL TRACTAMENT DE L'ACV ISCÈMIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Les referències estàndard d'equinacòsid (A0282), tubulòsid A (A0942), acteòsid (A0280), isoacteòsid (A0281) i 2'-acetilacteòsid (A0943) es van comprar a Chengdu Must Biotechnology. Les pureses de tots els estàndards són més del 98%. Els kits d'H&E de taques Nissl es van comprar a Boster. Edaravone (T0407-1) ​​es va comprar a Target Mol (Xangai, Xina). S'han comprat MAP anti-rata de conill-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) i CD31 antirata de ratolí (ab24590) d'Abcam Inc. Rabbit antirata Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) i Occludin (BS72035) es van comprar a Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, EUA) va ser la font de sinapsina antirata de conill-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) es va comprar a Proteintech Group, Inc. Els anticossos secundaris van ser subministrats per Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, Xina). Hoechst 33258 es va obtenir de Beyotime.

Animals

Les rates Sprague-Dawley (mascles, amb un pes de 250 a 300 g) es van obtenir de Vital River Laboratory Animal Technology i es van allotjar en una habitació amb aire condicionat mantinguda en un cicle de llum/foscor de 12 hores. Tots els experiments amb animals es van realitzar segons les directrius ARRIVE d'investigació amb animals i es van aprovar pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals del Centre de Ciències de la Salut de la Universitat de Pequín.

Protocols experimentals amb animals

Les rates van ser sotmeses a MCAO/R, tal com es va descriure anteriorment (Wang et al., 2018). Breument, es van exposar l'artèria caròtida comuna esquerra (CCA), l'artèria caròtida externa (ECA) i l'artèria caròtida interna (ICA) i es va inserir una sutura de monofilament de niló 3-0 des de l'ECA a l'ICA fins arribar al mig. artèria cerebral (ACM). Després d'1,5 h d'oclusió de MCA, es va simular la reperfusió eliminant el filament. Durant el procediment quirúrgic, la temperatura corporal de totes les rates es va mantenir a 37,0 graus. Droga

Administració

Les rates es van separar aleatòriament en sis grups mitjançant el programari SPSS versió 22.0 tal com es descriu: grup normal (NOR); grup de models (MOD); grup edaravona (medicament positiu, 6 ml/kg, EDI); grup TGs (280 mg/kg, TGs); Grup PS (280 mg/kg, PS) i grup SO (280 mg/kg, OS). Els TG, els PS i els SO es van administrar una vegada al dia després de MCAO/R durant 14 dies. Els grups NOR i MOD es van tractar amb solució salina normal. El nombre d'animals es mostra a la taula 1.

Mesurament del pes i puntuacions de dèficit neurològic modificat (mNSS)

El pes corporal es va controlar el dia 14 mitjançant una bàscula digital ADVENTURE™ (OHAUS, Nova Jersey, EUA). El mNSS es va avaluar segons el mètode descrit per FJ Wang (Wang et al., 2018), amb revisions menors.

2, 3, 5-Tinció de clorur de trifeniltetrazoli (TTC)

El volum de l'infart es va mesurar tal com es va descriure anteriorment. En resum, els cervells es van seccionar en set blocs coronals igualment espaiats (2 mm). Aquestes seccions es van tacar amb un 2% de TTC a 37 graus durant 15 min. Volum de l'infart (%)=(volum de l'hemisferi isquèmic ipsilateral - volum de l'hemisferi isquèmic contralateral)/volum de l'hemisferi isquèmic contralateral × 100.

Tinció de Nissl i H&E

Les rates van ser profundament anestesiades i tot el cervell es va retirar ràpidament del crani fixat amb un 4% de paraformaldehid incrustat en cera de parafina i seccionat en rodanxes de 7 µm de gruix. Les seccions es van tenyir amb Nissl i H&E. En aquest estudi, es van capturar sis camps aleatoris de 200 × 200 µm a cada mostra de teixit amb un microscopi de llum. El nombre de cossos de Nissl es va comptar amb la versió 6.0 del programari IPP.

Assaig Evans Blue

Les rates es van injectar amb un 2% d'EB després de MCAO/R. Dues hores més tard, les rates van ser anestesiades i tot el cervell es va eliminar ràpidament i es va homogeneïtzar en acetona. Els sobrenedants es van analitzar a 620 nm mitjançant un lector d'absorbància de 800 TS.

Mesura de les activitats de la catalasa (CAT), la superòxid dismutasa (SOD), el malondialdehid (MDA) i la glutatió peroxidasa (GSH-Px)

Totes les mostres de sèrum es van centrifugar a 4, 000 × rpm durant 15 min a 4 graus i després es van analitzar per detectar les activitats de MDA, CAT, SOD i GSH-Px seguint les instruccions del fabricant.

Anàlisi de Western Blotting

Els teixits cerebrals (100 mg) recollits de cada rata es van homogeneïtzar i lisar en tampó de lisi RIPA i després es van analitzar per detectar la concentració de proteïnes mitjançant un kit de BCA. Les proteïnes totals del teixit es van carregar en gels SDS-PAGE al 10% i es van transferir a una membrana de nitrocel·lulosa. La membrana es va bloquejar amb llet desnatada al 5%, després es va incubar durant la nit amb anticossos primaris a 4 graus. Després es va incubar la membrana amb un anticòs secundari. L'anàlisi de Western blot es va analitzar mitjançant el sistema d'imatge digital Kodak.

Anàlisi immunofluorescent

Es va realitzar una tinció d'immunofluorescència per a CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludina, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 i Keap-1. Els anticossos primaris contra Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludina, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP{-2 i Keap-1 es van diluir a 1 :200 i 1:100, respectivament. Els anticossos secundaris de la IgG anti-conill de ratolí Alexa Flur 488 i la IgG de cabra anti-conill de rodamina (TRITC) es van diluir a 1:200. Els nuclis es van tacar amb Hoechst 33258. Les imatges es van capturar mitjançant el sistema automatitzat d'imatges de patologia quantitativa Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, EUA). L'expressió de proteïnes es va analitzar mitjançant la versió 6.0 del programari IPP. Anàlisi estadística

Totes les dades es van descriure com a mitjana ± SD. La versió 22 del programari SPSS.0 es va realitzar per a l'anàlisi estadística. Es va utilitzar ANOVA unidireccional en comparar diferents grups. Es va considerar que P <{3}},05 era la diferència estadística.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MALALTIA ANTIISQUÈMICA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RESULTATS

Els TG augmenten el pes corporal i redueixen els danys cerebrals en rates MCAO/R

Després de 14 dies de curació amb TG, PS, Oss i EDI, es van avaluar els pesos corporals, els dèficits neurològics i els volums d'infart de rates I/R. Els resultats van mostrar que els pesos corporals del grup MOD es van reduir molt, mentre que els pesos disminuïts en els grups TG, PS i EDI van augmentar (figura 2A). Les puntuacions de dèficit neurològic es van reduir substancialment per EDI i TG (figura 2B). Les rodanxes de cervell de les rates del grup NOR eren de color vermell intens i no hi va haver infarts, mentre que les rates del grup MOD van mostrar un gran infart cerebral ipsilateral. Després del tractament amb TG, els volums d'infart es van reduir significativament (figures 2C, D). El tractament amb PS i OS no va mostrar cap efecte evident sobre els índexs anteriors. Les dades anteriors van mostrar que els TG podrien alleujar notablement la lesió cerebral induïda per I/R, però els PS i els SO no ho van poder.

Els TG milloren el dany histopatològic en rates MCAO/R

Per determinar alguns dels efectes del tractament amb TG, PS i OS sobre el dany histopatològic, es va fer una tinció de H&E per revelar danys patològics. Les estructures histomorfològiques dels cervells del grup NOR es van organitzar regularment. Els canvis de morfologia en els grups TGs van ser més lleus que els del grup MOD. Tanmateix, els grups de tractament amb PS i OS no van mostrar cap millora significativa dels canvis de morfologia (figura 3).

Els TG atenuen la lesió neuronal després de rates induïdes per I/R

La tinció de Nissl va mostrar els canvis histopatològics de les neurones a la penombra de la zona isquèmica. Com es mostra a la figura 4, les neurones normals tenien un nuclèol clar i una estructura intacta. Al grup MOD, les neurones tenien espais intercel·lulars engrandits. Els cossos nissl van desaparèixer, encongits i profundament tacats. Tanmateix, aquests canvis poques vegades es van observar als grups EDI, TG i PS. Aquests resultats van il·lustrar que els TG i els PS podrien de manera significativaatenuar la lesió neuronal induïda per isquèmia/reperfusió.

Els TG atenuen la interrupció del BBB després de rates tractades amb I/R

L'assaig blau d'Evans és un mètode clàssic per investigar el canvi de permeabilitat BBB. Els resultats de l'experiment van mostrar que es va observar un augment del blau d'Evans al grup MOD, mentre que el blau d'Evans va disminuir significativament a les rates tractades amb TG i EDI. A més, no hi va haver cap diferència significativa entre els grups de teràpia amb PS i SO (figura 5). Aquests resultats van suggerir que els TG podrien atenuar significativament la interrupció del BBB.

Els TG promouen l'angiogènesi en rates lesionades per I/R

Estudis més recents mostren que l'angiogènesi té un paper crític en la recuperació funcional neurològica i els resultats pronòstics després d'un ictus isquèmic agut (Yuen et al., 2015). Per avaluar els efectes dels TG, PS i OS sobre l'angiogènesi, es van utilitzar CD31 i a-SMA per quantificar els nombres capil·lars. La tinció d'immunofluorescència va mostrar que el grup MOD va provocar una disminució notable de les expressions de CD31 (figures 6A, B) i a-SMA (figures 6C, D) a la penombra de les àrees isquèmiques de rates I/R, en comparació amb les rates normals. . Aquest resultat va il·lustrar que I/R podria causar danys vasculars a la penombra de l'escorça dels hemisferis isquèmics. Tanmateix, el tractament amb TG i EDI va augmentar notablement la densitat capil·lar, l'angiogènesi i l'arteriogènesi, tal com indica l'augment de les expressions de CD31 i a-SMA. Aquests resultats suggereixen que els TG podrien promoure l'angiogènesi a la penombra isquèmica de rates I/R, però els PS i OS no ho podrien.

Els TG augmenten l'expressió de proteïnes d'unió estreta en rates lesionades per I/R

La interrupció del BBB pot augmentar el contingut d'aigua cerebral i la inflor dels teixits, donant lloc a lesions cerebrals. Les proteïnes d'unió estreta són components estructurals importants de la BBB. Per provar si el tractament amb TG, PS i OS després de l'ictus podria influir en la integritat de la BBB, les expressions de ZO-1, claudina-5 i ocludina es van realitzar mitjançant anàlisi d'immunofluorescència. Els resultats van indicar que les expressions de claudina-5, occludina i ZO-1 van disminuir visiblement al grup MOD. No obstant això, van augmentar substancialment després de 14 dies de la seva administració. Els grups PS i OS no van mostrar canvis significatius en aquestes expressions de proteïnes (figura 7). Aquestes dades van indicar que els TG poden regular les expressions de proteïnes d'unió estreta i probablement mantenir la integritat del BBB després de la lesió I/R.

Els TG augmenten la cobertura de pericits als capil·lars en rates lesionades per I/R

La cobertura de pericits als capil·lars té un paper crític en el manteniment de la integritat de la BBB. Així, vam provar si la cobertura de pericits es podia augmentar amb el tractament amb TG, PS i OS. Els resultats de l'anàlisi d'intensitat d'immunofluorescència van mostrar que tant les expressions PDGFRb com CD31 es van reduir dràsticament al grup MOD. L'administració de TG a les rates I/R va recuperar o fins i tot augmentar significativament les intensitats d'expressió del PDGFRb i CD31, però no es va observar cap diferència en els grups de tractament amb PS i OS (figura 8). Així, el tractament dels TG podria augmentar significativament la cobertura de pericits. Aquestes troballes van confirmar a més que els TG poden mantenir la integritat de la BBB després de l'I/R.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER PREVENIR L'ACV ISQUÈMIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%