Estudis toxicològics sobre la seguretat de l'extracte de Cistanche Deserticola

Resum:

Objectiu Avaluar la toxicitat general iToxicitat genètica de Cistanche deserticola extractei proporcionar una base perdesenvolupament d'estudis funcionals posteriors. Mètodes Anprova de toxicitat oral agudai una dosi repetida90-Toxicitat oral diàriaes van realitzar proves en rates per observar la toxicitat general deExtracte de Cistanche deserticola. Per avaluar la toxicitat genètica de l'extracte de Cistanche deserticola es van dur a terme tres assaigs de mutagenicitat que inclouen una prova de mutació inversa bacteriana (test d'Ames), un eritròcit policromàtic de medul·la òssia de ratolí i una prova de cromosomaberració de mamífers in vitro. Tots els mètodes de prova es van dur a terme d'acord amb les normes nacionals. Les dades experimentals es van processar estadísticament mitjançant la prova de χ{{0}} o l'anàlisi de la variància. El nivell de prova de va ser 0,05.

Resultats Eldosi letal mitjana oral aguda(LD50) deExtracte de Cistanche deserticolatant en ratolins femelles com mascles va ser superior a 10g/kg. Els resultats de la prova d'Ames van mostrar que l'extracte de Cistanche deserticola no va provocar cap augment de colònies de mutació posterior de totes les soques provades, i hi va haver un resultat negatiu. Els resultats dels eritròcits policromàtics de medul·la òssia del ratolí van mostrar que no hi havia cap diferència estadísticament significativa (χ2=3. 036, 1. 755, tots P > 0. 05) en les taxes de micronucli en ratolins femelles i mascles entre els grups de dosi i el dissolvent. grup control i hi va haver un resultat negatiu. Els resultats de la prova d'aberració cromosòmica de mamífers in vitro van mostrar que, amb o sense sistema d'activació metabòlica, hi havia diferències estadísticament significatives (χ2=13. 244,9. 955, tots P<0. 05) in chromosome aberration rate of Chinese hamster lung (CHL) cell between the positive control groups and the solvent control groups, and there were no statistically significant differences (χ 2 = 0. 436,1. 008, all P>0. 05) en la taxa de cèl·lules d'aberració cromosòmica entre els grups de dosi d'extracte de Cistanche deserticola i els grups de control de dissolvents, i hi va haver un resultat negatiu. Durant el període de la prova de toxicitat oral de dosis repetides 90-dia en rates, les activitats, el consum d'aliments i el consum d'aigua dels animals eren normals. No es va observar cap canvi de comportament evident ni manifestacions d'enverinament, i no es va observar cap mort. En comparació amb el grup control, no es va observar cap anormalitat òbvia en la massa corporal, el consum d'aliments, els índexs hematològics i bioquímics, el pes dels òrgans i el pes relatiu dels òrgans de les rates de cada grup de dosi. No es va trobar cap canvi patològic anormal evident en l'examen histopatològic. Conclusió En les condicions experimentals actuals, l'extracte de Cistanche deserticola no té toxicitat general ni toxicitat genètica, i es podrien dur a terme estudis funcionals addicionals.

Paraules clau:avaluació de la seguretat;Extracte de Cistanche deserticola; Toxicitat aguda; Toxicitat genètica; Toxicitat general

MATÈRIA PRIMERA NATURAL DE CISTANCHE EN VENDA

Els fitoquímics són una classe de substàncies bioactives de baix pes molecular que contenen diverses funcions per a la salut a més de nutrients essencials a les plantes [1]. En els darrers anys, amb el desenvolupament continu de la ciència de la nutrició, s'han descobert contínuament els efectes beneficiosos de diversos fitoquímics sobre el cos humà, com ara l'antifatiga, la reducció dels lípids a la sang i la millora de la immunitat. Cistanche deserticola, també conegut com a esperit terrestre, cistanche i dia, es coneix comunament com "ginseng del desert" [2]. Al meu país, hi ha 6 espècies i 1 variant, a saber, Cistanche deserticola, Cistanche alsa, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, Cistanche lanzhouensis, Cistanche ambigua i la variant Cistanche salsavar [3]. Cistanche deserticola creix principalment en terres salines-àlcalis, terres sorrenques i entorns desèrtics. Al meu país, es distribueix principalment a la regió autònoma de Mongòlia Interior, la província de Gansu i la província de Shaanxi. El seu extracte té beneficis per a la salut com hidratar els intestins, millorar la immunitat cel·lular i protegir el fetge [4-7]. Actualment, hi ha pocs estudis de toxicitat animal sobre l'extracte de Cistanche deserticola. Aquest estudi va avaluar sistemàticament la seva toxicitat aguda, toxicitat general i toxicitat genètica per avaluar-ne la seguretat i establir les bases per a més investigacions en profunditat en el futur.

1 Materials i mètodes

1. 1 Material

1. 1. 1 Substància de prova

L'extracte de Cistanche deserticola és un sòlid en pols, produït i subministrat per Inner Mongolia Yuhangren High-tech Industry Co., Ltd., número de lot: 211101. El consum humà recomanat és de 0,72 g/d, que es converteix en un consum diari recomanat de 12 mg/kg·pc.

1. 1. 2 Animals d'experimentació

Es van comprar rates de grau Sprague-Dawley (SD) sense patògens específics per a adults (SPF) a Hunan Slake Jingda Experimental Animal Co., Ltd., amb un número de llicència de producció animal de SCXK (Xiang) 2019-0014. Es van guardar a la sala d'animals de grau barrera de l'Institut de Prevenció i Control de Malalties Professionals de Hunan, amb una temperatura de 21 ~ 24 graus i una humitat del 45% ~ 68%. El número de llicència d'ús d'animals experimentals és SYXK (Xiang) 2017-0001.

1. 1. 3 Bacteris

Salmonella typhimurium deficient en histidina. Les soques són TA97, TA98, TA100 i TA102, totes proporcionades per MOLTOX, EUA, i identificades pel nostre laboratori com a complint els requisits.

1. 1. 4 Cèl·lules Línia cel·lular de pulmó de hàmster xinès (CHL), adquirida al Banc de cèl·lules de l'Acadèmia Xinesa de Ciències (Xangai, Xina).

1. 2 Mètodes

1. 2. 1 Prova de toxicitat oral aguda

Aquesta prova va adoptar el mètode del límit. Es van seleccionar 20 rates SD amb un pes corporal de 185.80 ~ 220. 00g, meitat femella i meitat mascle, i van dejunar durant 16 h. Configureu un grup de dosis de 10,00g/kg·pc, agafeu 50,04 g de la mostra de prova i afegiu aigua pura a 75,00 ml per preparar una solució de prova amb una concentració de 666,70 mg/ml. La solució de prova es va administrar per via oral a una dosi de 15,00ml/kg·pc. El període d'observació va ser de 14 dies i es van registrar diàriament els símptomes d'intoxicació i les morts dels animals. Els animals es van pesar al començament de l'experiment, el 7è dia després de l'administració i al final de l'experiment. Després del període d'observació, les rates van ser assassinades amb anestèsia de CO2 i es va completar l'examen anatòmic brut dels animals.

1.2.2 Test d'Ames

Configureu 5 dosis de 50, 158, 500, 1580 i 5000 ug/plat, i configureu un grup de control de mutació positiu i un grup de control de dissolvent. Les substàncies positives són azida de sodi, 2-aminofluorè, 1, 8-dihidroxiantraquinona i diclorotiazida, i el dissolvent és aigua pura. Es van establir tres plats paral·lels per a cada grup de dosi en aquesta prova. La prova es va realitzar en dos sistemes amb S9 (enzim microsòmic hepàtic) i sense S9, i les cèl·lules es van cultivar en una incubadora de temperatura constant de 37 graus durant 48 hores després de l'administració.

1.2.3 Prova del micronucli d'eritròcits policromàtics de medul·la òssia del ratolí

Ratolins Kunming, 25 femelles i 25 mascles, amb un pes corporal de 29,3~35.0g. La prova va establir tres grups de dosis de 2,5, 5,0 i 10,0 g/kg·pc, un grup de control positiu i un grup de control de dissolvent. La substància positiva va ser la ciclofosfamida (CP; fabricant: Baxter; número de lot: OH397A) i la dosi va ser de 40 mg/kg·pc. El grup de control de dissolvent i el grup de dosi van rebre 40 ml/kg·pc, i el grup de control positiu se'ls va donar 20 ml/kg·pc. El mètode d'administració va ser administrar el fàrmac dues vegades en 30 hores, i l'última administració es va realitzar 24 hores després de la primera administració. Els animals es van matar 6 hores després del final de l'administració, es va prendre la medul·la òssia de l'estèrnum per a la seva preparació i es va comptar amb un microscopi el nombre de cèl·lules que contenien micronuclis (fabricant: Olympus, model: CX23).

1.2.4 Prova d'aberració cromosòmica de cèl·lules de mamífers in vitro

La prova va establir un grup de control de dissolvent (aigua pura), grups de dosi de 250, 500 i 1000 ug/ml i un grup de control positiu. Els controls positius van ser 20 ug/ml de metanosulfonat de metil (MMS) (fabricant: West Asia Reagent, número de lot: 20200109) (sense sistema d'activació metabòlica) i 10 ug/ml de ciclofosfamida (fabricant: Baxter, número de lot:

OH397A) (amb sistema d'activació metabòlica). Després de confirmar que les cèl·lules no estan contaminades, ajusteu la concentració cel·lular a 5 × 10

5/ml, afegiu 2,00ml de suspensió cel·lular a cada ampolla i, a continuació, afegiu 3,00ml de medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMED) (fabricant: Zhejiang Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd. , número de lot: 22112501) i col·loqueu-lo a la incubadora durant unes 24 hores. Després de succionar el medi de cultiu de l'ampolla, afegiu 4,95 ml de medi complet DMEM (sense sistema d'activació metabòlica) o 4,45 ml de medi complet DMEM i 0,50 ml de solució mixta S9 (amb sistema d'activació metabòlica) a cada ampolla i, finalment, afegiu 50 ul de la mostra de prova preparada o de la mostra de control i col·loqueu l'ampolla de cultiu a la incubadora (fabricant: Shanghai Lishen Scientific Instrument Co., Ltd., model: HF160W) durant 4 hores d'exposició al verí. Després de la infecció, descarteu el medi de cultiu, renteu les cèl·lules tres vegades amb la solució de sal equilibrada de Hanks (HBSS) (fabricant: Zhejiang Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd., número de lot: 2109220213) i després afegiu-ne 5.{{19} }ml de medi de cultiu complet DMEM a cada ampolla, cultiu durant 24 hores i colliu les cèl·lules.

4 h abans de la collita, afegiu 50 ul de 100 mg/ml de colquicina a cada ampolla, incubeu durant 4 h, digeriu amb una solució de tripsina al 0,25% (fabricant: Zhejiang Jinuo Biopharmaceutical Technology Co., Ltd., número de lot: 22071201), centrifugar i collir les cèl·lules, preparar diapositives segons el mètode rutinari, preparar una diapositiva per ampolla i tacar amb un 10% de tinció de Giemsa [fabricant: China Pharmaceutical (Group) Shanghai Chemical Reagent Company, número de lot: 20220114].

Sota una lent d'immersió en oli (fabricant: Olympus, model: CX23), es van analitzar 100 metafases a cada grup, es va observar i registrar el nombre de cèl·lules aberrants, el tipus d'aberració i les coordenades del camp visual aberrant, i es va registrar la taxa d'aberració cromosòmica. calculada.

1.2.5 90-Dia de prova de toxicitat oral en rates

120 rates SD, de 4 setmanes, meitat femella i meitat mascle, amb un pes corporal de 75.5-97,0 g a l'inici de la prova per a rates femelles i 80.{{6} },8 g per a rates mascles. L'experiment va establir tres grups de dosis de 600, 1.200 i 3.600 mg/(kg·pc·d) i un grup control positiu, amb 10 animals femelles i mascles a cada grup. A més, hi havia un grup de satèl·lits de control a mig termini, un grup de satèl·lits de control del període de recuperació, un grup de satèl·lits a dosis altes a mig termini i un grup de satèl·lits de dosis altes de període de recuperació, amb 5 ratolins femelles i mascles a cada grup. La dosi dels grups de dosis baixa, mitjana i alta era equivalent a 50, 100 i 300 vegades el consum humà recomanat, respectivament. La solució de prova es va preparar recentment cada dia i el volum de sonda era de 10 ml/(kg·bw·d). Els animals es van observar cada dia durant l'experiment i es van registrar les seves condicions generals. Al final de l'experiment, es va recollir sang després de dejunar durant 16 hores, es va mesurar la rutina sanguínia i la bioquímica de la sang, i es van observar lesions macroscòpiques d'òrgans i exàmens histopatològics.

1.3 Anàlisi estadística

Es va utilitzar el programari estadístic IBM SPSS Statistics 20.0 per analitzar les dades. La prova del micronucli d'eritròcits de mamífers es va analitzar estadísticament mitjançant l'anàlisi de distribució i variància de Poisson. La prova d'aberració cromosòmica de cèl·lules de mamífers in vitro es va analitzar estadísticament mitjançant la prova χ2. La prova de toxicitat oral de 90-dia es va analitzar estadísticament mitjançant l'anàlisi de variància unidireccional i (o) la prova t. P<0.05 was considered statistically significant, and the test level was α = 0.05.