Efectes nous de la teràpia combinada mitjançant la inhibició de la piroptosi induïda per caspasa-1/Gasdermin D en la nefritis lúpica

Per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang i Jin Lin

RESUM

Objectius: La teràpia combinada amb micofenolat mofetil, tacrolimus i esteroides és eficaç per aconseguir una remissió completa ennefritis lúpica(LN). La teràpia combinada va regular a la baixa de manera única la caspasa-1 en comparació amb les monoteràpies, que poden escindir la gasdermina D (GSDMD) i recentment es va identificar com lapiroptosibotxí. Per tant, vam investigar si la teràpia combinada va permetre la supressió de la caspasa-1/GSDMD mediadapiroptosien LN (nefritis lúpica).

Feu clic a cistanche deserticola ma per a la nefritis

Mètodes: Es va detectar l'expressió i l'activació de GSDMD en mostres de ronyó d'humà i ratolí amb LN (nefritis lúpica) mitjançant tinció immunohistoquímica i immunoblot. Els podòcits primaris aïllats de ratolins MRLlpr es van incubar amb LPS més ATP i es van tractar prèviament amb monoteràpia o teràpia combinada. Inhibició de la caspasa-1/GSDMD induïdapiroptosimitjançant teràpia combinada es va avaluar en ratolins MRLlpr i exemplars humans. Em van examinar amb un kit de caspasa-1 FAM i citometria de flux. La correlació entrepiroptosien sang perifèrica i es va analitzar l'índex d'activitat de la malaltia del lupus eritematós sistèmic (SLEDAl).

Resultats: mostres de teixit renal de LN (nefritis lúpica) els pacients i els ratolins van mostrar nivells d'expressió i escissió de GSDMD molt augmentats. En podòcits cultivats, el tractament combinat va suprimir significativament l'activació de NLRP3 i caspasa -1 i va reduir els nivells N-terminals de GSDMD. La teràpia combinada va reprimir la progressió de la malaltia mitjançant la inhibició de la caspasa-1/mediada per GSDMDpiroptositant en humans com en ratolins MRL/LPR. Els nombres de cèl·lules positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica es van correlacionar positivament amb SLE-DAl. LN (nefritis lúpica) els pacients amb remissió completa i remissió parcial tenien un nombre de cèl·lules positives de caspasa-1/PI notablement reduït en comparació amb la línia inicial. Ac-FLTD-CMK, un inhibidor derivat de GSDMD, va impedir el desenvolupament de LN (nefritis lúpica).

Conclusió: la teràpia combinada va suprimir la caspasa-1/GSDMD mediadapiroptosiin vitro i in vivo i redueix la progressió de la malaltia.

Paraules clau:nefritis lúpica, piroptosi, caspasa-1, gasdermin D, teràpia

Teràpia de tractament perpiroptosi

INTRODUCCIÓ

Nefritis lúpica(LN) és una inflamació renal que sorgeix com a conseqüència de la malaltia autoimmune lupus eritematós sistèmic (LES).nefritis lúpica) és una manifestació important en pacients que pateixen LES. Al voltant del 60 per cent dels pacients desenvolupen aquesta condició, amb aproximadament un 20 per cent progressant a la malaltia renal en fase terminal (ESRD)(1). La teràpia combinada amb micofenolat mofetil (MMF), inhibidors de la calcineurina (CNI) i esteroides produeix efectes complementaris i també minimitza la toxicitat (2). Aquesta teràpia es recomana com a tractament inicial per a la LN (nefritis lúpica) i produeix una millor eficàcia i una remissió més completa en comparació amb la ciclofosfamida intravenosa (IVCY) i els esteroides (3-5).

Per investigar els mecanismes moleculars i cel·lulars de la teràpia combinada, es va utilitzar una anàlisi transcriptòmica completa en un model muri de LN. (nefritis lúpica). Els ratolins MRL/LPR es van administrar sols MMF, tacrolimus o prednisona com a monoteràpia o combinacions de tres fàrmacs. Perfils de l'expressió de gens en els ronyons de ratolins amb LN (nefritis lúpica)van revelar mecanismes potencials que podrien explicar els efectes additius i sinèrgics de la teràpia combinada en comparació amb les monoteràpies. Un dels 45 gens regulats a la baixa que es modulen de manera única per la teràpia combinada és la caspasa-1 (6). S'activa pels inflammasomes, que són oligòmers multiproteïns formats per NLRP3, pro-caspasa-1 i proteïna semblant a taques associades a l'apoptosi (ASC), amb un domini d'afinitat de caspasa integrat. L'inflamsoma NLRP3/ASC/caspase-1 ha estat reconegut com un contribuent clau a la patogènesi de LN (nefritis lúpica). L'inflamsoma NLRP3 provoca trastorns autoinflamatoris activant la caspasa-1, iniciant la generació de citocines proinflamatòries, per exemple IL-1, que se sap que desencadena la disfunció dels podòcits a LN(7-9).

La caspasa activa-1 escinda la gasdermina D (GSDMD) dins de l'enllaç dels seus dominis N i C-terminals. Aleshores, el domini N-terminal facilita la formació de porus a la membrana cel·lular, estimula la cèl·lulapiroptosii producció de citocines IL-1 i IL-18(10). Estudis emergents han demostrat que la mediació de GSDMDpiroptosiparticipa en la progressió de malalties com l'encefalomielitis autoimmune (11), l'esclerosi múltiple (12), l'hepatitis alcohòlica (13) i la malaltia inflamatòria intestinal (14). A més, la inhibició genètica o farmacològica de la caspasa-1/GSDMD ha s'ha demostrat que protegeix els ronyons de lesions en models murins de malaltia renal diabètica (15, 16) i també després d'una lesió renal aguda (17-19). Malgrat això,piroptosien LN (nefritis lúpica)encara està mal definit fins ara(20). Vam plantejar la hipòtesi que la teràpia combinada conferia efectes beneficiosos a la LN (nefritis lúpica)) mitjançant la inhibiciópiroptosiinduït per la caspasa-1/GSDMD.

En el present estudi, es va investigar l'activació de la caspasa-1 i la GSDMD als teixits renals, així com els efectes de la teràpia combinada sobre la caspasa-1/GSDMD dependent.piroptosiinhibició en ratolins MRL/LPR i pacients amb LN (nefritis lúpica). Correlacions potencials depiroptosiamb l'índex d'activitat de la malaltia del LES (SLEDAI) i també es van avaluar les respostes al tractament.

Tractament perpiroptosi

MATERIALS I MÈTODES

Estudiar la població

La cohort d'estudi estava formada per pacients diagnosticats per biòpsia amb LN (lupusnefritis) Menys o igual a 6 mesos abans de la matrícula. El rang d'edat del pacient era de 18-65 anys i tots complien els criteris de classificació de l'American College of Rheumatology for SLE (2l, 22) i la International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (2003). Es van reclutar pacients de l'Escola de Medicina de la Universitat de Zhejiang i de l'Escola de Medicina de la Universitat de Nanjing que tenien proteinúria (més o igual a 1,5 g/d) i concentracions de creatinina sèrica inferiors o iguals a 265,2 umol/L. Els criteris d'exclusió inclouen: un pacient havia estat tractat prèviament amb dosis elevades de metilprednisolona; productes biològics (orientats a molècules patògenes específiques) o teràpia combinada; plasmafèresi actual o tractament amb globulina intravenosa dins de les 12 setmanes posteriors al cribratge; funcions hepàtiques anormals; infeccions actives actuals; i un tumor maligne dins de les 4 setmanes posteriors a l'inici de l'estudi. LN (lupusnefritis) els pacients van rebre teràpia de polsos amb metilprednisolona durant 3 dies a una dosi de 0,5 g/d. Un cop finalitzada la teràpia amb polsos de metilprednisolona, ​​el grup combinat amb prednisona (0,6 mg/kg/d), MMF (0,5 g, dues dosis/dia) i tacrolimus (2 mg, dues dosis/d) durant un total de 4 setmanes. A continuació, les dosis de prednisona, que encara estaven combinades amb MMF (0,5 g, dues dosis/dia) i tacrolimus (2 mg, dues dosis/dia), es van reduir en 5 mg/dia cada 2 setmanes fins que es va aconseguir una dosi de manteniment d'10 mg/dia(4). La remissió completa (CR) es va prendre com una concentració de proteïna urinària 24-h inferior o igual a 0,4 g, l'absència de sediments d'orina actius, una concentració d'albúmina sèrica superior o igual a 35 g/L i creatinina normal. (23). La remissió parcial (PR) es va prendre com una disminució superior o igual al 50 per cent de la concentració de proteïnes urinàries 24-h a Menor o igual a 3,5 g, una concentració d'albúmina sèrica superior o igual a 30 g/ L, i un augment normal o inferior o igual al 25 per cent de la concentració de creatinina sèrica des de la línia de base. La nostra Junta de Revisió Institucional va aprovar l'estudi (núm. IIT20200410A) i tots els pacients van donar el seu consentiment per escrit abans de la inscripció.

Models animals

Els ratolins femenins MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) van ser subministrats pel SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Xangai, Xina), tots els ratolins es van dividir aleatòriament amb l'ajuda d'un generador de números aleatoris, 5 ratolins a cada grup i cada gàbia. . Es van tractar per via oral a les 8 setmanes d'edat, amb una combinació de 0,5 mg/kg tacrolimus (MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF (MCE HY-B0199) i 1 mg/kg. kg de prednisona (MCE HY-B0214) o vehicle diari durant un total de 8 setmanes tal com s'ha descrit anteriorment(6). Ac-FLTD-CMK es va sintetitzar per MCE i es van injectar 10 mg/kg ip diàriament. Tots els tractaments es van cegar als participants responsables de la següent detecció. La relació albúmina-creatinina d'orina (UACR) es va determinar mitjançant Albuwell M i Creatinine Companion (Excell, Phil, EUA). Les mostres de ronyó es van fixar en un 4% de paraformaldehid abans de la tinció histològica i immunohistoquímica i de les escorces renals extretes per a l'anàlisi d'immunoblot. L'ús de ratolins va ser aprovat pel nostre comitè institucional de cura i ús d'animals (núm. 2019-883).

Ratolins Aïllament de glomèruls i cultiu de podòcits

Els glomèruls es van purificar dels ronyons de ratolins femelles C57 i MRL/LPR de 12-setmanes d'edat, tal com es va descriure abans (24). Els ratolins anestesiats es van perfondre amb perles magnètiques preescalfades a 37 graus C. Els ronyons es van treure i es van picar amb gel a 1 mm³. A continuació, els teixits renals es van digerir a 37 graus amb 1 mg/ml de col·lagenasa i 100 U/ml de DNasa I durant 30 minuts, després es van filtrar dues vegades amb coladors de cèl·lules Falcon 100-μm (431752, BD). Després de diversos rentats amb una solució HBSS de 4 graus (H1025, Solarbio) i una centrifugació suau a 200 g durant 5 minuts, es van recollir glomèruls que contenien perles utilitzant el suport magnètic (HY-K0200, MCE) i es van rentar amb solució HBSS tres vegades. Els glomèruls aïllats es van cultivar en plats de cultiu recoberts de col·lagen tipus I (C3867, Sigma-Aldrich) en un 5% de CO, a 37 graus segons el mètode descrit per Jeffrey (25). Els podòcits del passatge 2 es van utilitzar a l'experiment in vitro.PiroptosiDetecció d'inducció, citotoxicitat i secreció d'IL-1

Els podòcits de ratolins MRL/LPR es van preparar amb 1 mg/ml de LPS (tell-pb5lps, InvivoGen) resolt en Opti-MEM durant 4 hores, seguit d'una estimulació d'ATP de 5 mM (tlrlatpl, gen In Vivo). Els podòcits dels ratolins C57 es van tallar com a control normal. Les monoteràpies tacrolimus (10 μM), MMF (luM) i prednisona (10 μM) o la teràpia combinada es van preincubar amb les cèl·lules durant 1 h abans de l'encebació de LPS. La citotoxicitat després de l'estimulació es va determinar mitjançant un kit de detecció de citotoxicitat (11644793001, Roche) segons les instruccions del fabricant. El sobrenedant després de l'estimulació es va recollir i mesurar mitjançant el kit ELISA del ratolí IL-1 (BMS6002, Invitrogen) segons les instruccions del fabricant.

Anticossos i reactius

Es van avaluar els nivells de caspasa-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) segons les instruccions del fabricant.Piroptosien sang perifèrica es va mesurar mitjançant el kit FAM FLICAMCaspase-1 (Bio-Rad, EUA) mitjançant citometria de flux.

Anàlisi estadística

Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant GraphPad Prism (vers. 8.0) i les dades es donen com a mitjanes ± SD. Es van realitzar dues comparacions de grups mitjançant la prova t de Student i les anàlisis de correlació mitjançant la correlació de Pearson. Pàg de dues cues<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tractament perpiroptosi anefritis lúpica (LN)

RESULTATS

Mediat per GSDMDPiroptosiS'activa als ronyons afectats per LN (lupusnefritis)

Investigar si GSDMD va contribuir a la patogènesi de LN (lupusnefritis), primer vam provar el nivell d'expressió de proteïnes de GSDMD en mostres de ronyó extretes de LN (lupusnefritis) pacients. L'anàlisi immunohistoquímica va revelar nivells d'expressió notablement augmentats de GSDMD en mostres de biòpsia renal extretes de LN (lupusnefritis) pacients amb tipus IV, V, I més Vand IV més V, i en comparació amb subjectes sans. GSDMD es va expressar universalment en podòcits glomerulars, cèl·lules tubulars i cèl·lules intersticials infiltrades a LN (lupusnefritis) pacients. L'àrea amb tinció positiva (fletxes vermelles) i negativa (fletxes negres) es va ampliar (figura 1A). Aleshores es va estimar el percentatge d'àrea positiva per GSDMD al ronyó (figura 1B). Es van trobar resultats similars als ronyons de ratolins MRL/LPR i controls de tipus salvatge. L'anàlisi d'immunoblotting va confirmar un gran augment de l'expressió i la divisió de GSDMD en mostres de ronyó de ratolins MRL / LPR (figura 1C). El GSDMD en podòcits glomerulars, cèl·lules tubulars i cèl·lules intersticials infiltrades es va elevar en ratolins MRL / LPR en comparació amb els ratolins control (figura 1D). Aquestes dades suggereixen que la mediada per GSDMD es va activar en el teixit renal afectat per LN (lupusnefritis).

FIGURA 1|La GSDMD està fortament elevada i escindida als ronyons de pacients i ratolins afectats per LN (nefritis lupus).

(A) Tinció immunoquímica de GSDMD en mostres renals preses de subjectes sans i LN (lupusnefritis) pacients, es va ampliar la tinció positiva (fletxes vermelles) i negativa (fletxes negres).

(B) La quantificació de les àrees positives GSDMD es mostra al tipus III més V, IV, IV més V, V LN (lupusnefritis) pacients i subjectes sans.

(C) Anàlisi d'immunoblot del domini N-terminal escindit de longitud completa i del domini C-terminal GSDMD a l'escorça renal de tres parells de ratolins control i MRL/LPR.

(D) Tinció immunoquímica de GSDMD en mostres de ronyó extretes de controls i ratolins MRL/LPR.

*p < {{0}},05,="" **p=""><0,01. ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; FL, sencer; NT, domini N-terminal; TC, domini C-terminal.

El tractament combinat suprimeix la mediació de GSDMDPiroptosiActivació en podòcits primaris in vitro

Investigar els efectes inhibidors de la teràpia combinada sobrepiroptosi, vam aplicar el mètode d'estimulació LPS més ATP per induirpiroptosien podòcits de ratolins MRL/LPR, prenent podòcits de ratolins C57 de tipus salvatge com a control normal. Els podòcits de ratolins MRLlpr es van preparar durant 4 h amb LPS i posteriorment es van tractar durant 4 h amb ATP, un estímul d'ús habitual per a la mediació de GSDMD.piroptosiactivació (26). En comparació amb el control normal, els podòcits van mostrar després característiques morfològiques piroptòtiques com la inflor i el bombolleig cel·lular. El pretractament amb teràpia combinada va millorar significativament les característiques morfològiques piroptòtiques i la citotoxicitat (figura 2A). LPS més ATP van induir citotoxicitat dels podòcits. De manera comparable, la teràpia combinada va disminuir significativament la citotoxicitat i la secreció d'IL-1 en el sobrenedant induït per LPS més estimulació d'ATP (figures 2B, C). Per verificar encara més l'activació de GSDMDpiroptosi, vam analitzar els inflamasomes canònics i l'activació de GSDMD mitjançant immunoblot. D'acord amb els canvis morfològics piroptòtics i la citotoxicitat, LPS més ATP van activar significativament NLRP3, caspasa -1 i van escindir GSDMD als podòcits (figura 2D). El tractament combinat va suprimir notablement l'activació de NLRP3 i caspasa -1 i va reduir el nivell de GSDMD N-terminal. En particular, les monoteràpies amb tacrolimus, MMF o prednisona van suprimir LPS més ATP van estimular la citotoxicitat cel·lular i la secreció de L-1, però la teràpia combinada va mostrar un efecte inhibidor més significatiu sobre la caspasa-1 i la GSDMD. Aquests resultats van proporcionar proves que recolzaven l'opinió que el tractament combinat va millorar la mediació de GSDMDpiroptosisuprimint l'activació de NLRP3 i caspasa-1.

FIGURA 2|El tractament combinat millora la piroptosi en podòcits in vitro.

(A) Les característiques piroptòtiques es van mostrar en podòcits primaris cultivats després d'incubar-los amb LPS més ATP i pretractats amb tractament combinat. Les fletxes indicaven cèl·lules que presentaven característiques semblants a la piroptòtica.

(B) Els sobrenedants de cèl·lules desafiades es van analitzar per a la mort cel·lular, mesurada per la secreció de LDH.

(C) Els sobrenedants de les cèl·lules desafiades es van analitzar per alliberar IL-1b.

(D) Anàlisi d'immunoblotting de l'expressió NLRP3, caspasa-1, GSDMD-NT i ASC després de tacrolimus, MMF, prednisona o tractament combinat després de l'activació de l'inflamsoma NLRP3.

*p <{{0}}.05; **p=""><0,01; ***p=""><0,001; ****p="">< 0,0001.="" ldh,="" lactat="">

DSMO, sulfòxid de dimetil, FK506, tacrolimus; MMF, micofenolat de mofetil; SNP, prednisona; COM, teràpia combinada; ASC, proteïna semblant a mota associada a l'apoptosi.

Tractament combinat Induït per caspasa-1/GSDMD suprimitPiroptosien ratolins MRL/LPR

Els ratolins MRL/LPR de vuit setmanes van rebre una combinació de MMF, tacrolimus i prednisona o control de vehicles. D'acord amb un estudi anterior (6), després del tractament durant 8 setmanes, no es va trobar cap diferència en la mortalitat o el pes corporal entre el vehicle i els grups de tractament combinat. En contrast amb el grup de vehicles, la teràpia combinada va ser molt eficaç per prevenir la proteinúria, la glomeruloesclerosi i la infiltració de cèl·lules immunitàries intersticials renals (figura suplementària 1).

A continuació, vam examinar els nivells d'expressió de caspasa-1 i GSDMD en grups de teràpia combinada i control de vehicles. L'anàlisi immunohistoquímica va revelar que l'expressió de la caspasa intersticial glomerular i renal -1 i GSDMD es va reduir notablement al grup de teràpia combinada (figura 3A). L'anàlisi d'immunoblotting també va trobar una disminució de l'expressió i la divisió de la caspasa -1 i GSDMD a les còrtexs renals del grup de tractament combinat (figura 3B). A més, es van comptar cèl·lules doble positives de caspasa-1/iodur de propidi (PI) mitjançant citometria de flux i unpiroptosiKit FAM Caspase-1. Els resultats van revelar una reducció marcada del nombre de cèl·lules de sang perifèrica de caspasa-1*/PI' en ratolins MRL/LPR que van rebre el tractament combinat en comparació amb els ratolins MRL/LPR tractats amb vehicle. (Figures 3C, D). A més, el tractament combinat també va reduir significativament la concentració sèrica Ii (figura 3E). Així, vam concloure que el tractament combinat va suprimir la caspasa-1/GSDMD induïdapiroptosials ronyons i les cèl·lules sanguínies de LN (lupusnefritis) ratolins.

FIGURA 3|El tractament combinat va atenuar la piroptosi mediada per caspasa-1/GSDMD en ratolins MRL/LPR.

(A) Tinció immunoquímica de GSDMD i caspasa-1 en mostres de ronyó de ratolins MRL/LPR. En comparació amb el control del vehicle, l'expressió de caspasa-1 i GSDMD es van inhibir notablement en el grup de tractament combinat.

(B) Anàlisi d'immunoblot de GSDMD i caspasa de longitud completa i escindida -1 en exemplars d'escorça renal de ratolins MRL/LPR; comparació dels resultats dels grups de tractament amb vehicle i combinació.

(C) FACS de cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica de ratolins MRL/LPR als quals se'ls va administrar o no un tractament combinat.

(D) Quantificació de cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica de ratolins MRL/LPR que es van rebre o no teràpia combinada.

(E) Quantificació de les concentracions sèriques d'IL{{0}}b en ratolins MRL/LPR amb tractament combinat o no. ####P <0,0001. facs,="" classificació="" cel·lular="" activada="" per="" fluorescència;="" tc,="" teràpia="">

Caspasa suprimida per teràpia combinada-1/GSDMD induïdaPiroptosien LN (lupusnefritis) Pacients

Entre gener de 2020 i juny de 2020, 47 pacients amb NL (lupusnefritis) es van inscriure i es van completar 43 24-setmanes de teràpia combinada. La malaltia inicial i la demografia de la cohort inscrita s'enumeren a la taula suplementària 1. Quantificació de la caspasa-1/iodur de propidi (les cèl·lules PI doble positives es van realitzar en pacients amb LN (lupusnefritis) tipus III, IV, V, III més V, IV més V i en controls sans utilitzant apiroptosiKit FAM Caspase-1 i citometria de flux. En comparació amb els controls sans, es va augmentar el nombre de cèl·lules dobles positives de caspasa -1/PI a la sang perifèrica (figures 4A, B). També vam examinar les cèl·lules de caspasa-1/PI doble positives després de 24-setmanes de teràpia i a la línia de base. Després de 24-setmanes de teràpia d'inducció, la incidència de CR i PR va ser del 39,5% (17/43) i del 32,6% (14/43), respectivament. Els nombres de cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica dels pacients amb CR i PR es van reduir notablement en comparació amb la línia inicial (figura 4C). També vam identificar una correlació entre la caspasa-1 induïdapiroptosii la SLEDA; les dades van mostrar clarament que la proporció positiva de caspasa -1/PI a la sang perifèrica es va correlacionar positivament amb SLEDAI (figura 4D). Ac-FLTD-CMK, un inhibidor derivat de GSDMD, va impedir el desenvolupament de LN (lupusnefritis).

FIGURA 4|La teràpia combinada va atenuar la piroptosi mediada per caspasa-1-en pacients amb LN (nefritis lupus).

(A) FACS de cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica de LN (lupusnefritis) pacients tractats amb o sense teràpia combinada.

(B) Quantificació de cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica de tipus III, IV, V, III més V i IV més V LN (lupusnefritis) pacients i subjectes sans.

(C) Quantificació de cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica de LN (lupusnefritis) pacients a l'inici, CR, PR i no remissió després de la teràpia combinada.

(D) Anàlisi de correlació de les proporcions de cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI amb SLE-DAI.

**p <0.01. facs,="" classificació="" cel·lular="" activada="" per="" fluorescència;="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; CR, remissió completa; PR, remissió parcial; SLE-DAI, índex d'activitat de la malaltia del lupus eritematós sistèmic.

Un estudi recent va trobar que GSDMDhmice va desenvolupar un augment de la deposició renal de C3 i IgG, una lesió renal més greu i una major mortalitat en un model de LES induït per imiquimod.17 Per aclarir encara més el paper de GSDMD en LN (lupusnefritis), els ratolins MRL/LPR es van tractar amb Ac-FLTD-CMK21 a partir de les 8-setmanes d'edat, amb el vehicle pel que fa al control. Després de 8-setmanes de tractament, no es va trobar cap diferència en la mortalitat o el pes corporal entre el vehicle i el grup tractat amb Ac-FLTD-CMK. En comparació amb els ratolins de control de vehicles, els ratolins MRL/LPR tractats amb Ac-FLTD-CMK tenien una proporció d'albúmina-creatinina d'orina més baixa (figura 5A), una concentració de creatinina sèrica més baixa (figura 5B), glomerulosclerosi reduïda (figura 5C) i CD3. , infiltració de cèl·lules positives CD4 i CD68 (figura 5D). Els resultats de la immunohistoquímica van mostrar una expressió reduïda de GSDMD (figura 5D) i la secreció sèrica IL-1 suprimida determinada per ELISA (figura 5E). Col·lectivament, les dades van suggerir que Ac-FLTD-CMK inhibiapiroptosien ronyons afectats per LN (lupusnefritis).

FIGURA 5|Ac-FLTD-CMK, un inhibidor derivat de GSDMD, va impedir el desenvolupament de LN (nefritis lupus).

(A) La relació albúmina-creatinina d'orina es va calcular en ratolins MRL/LPR als quals se'ls va rebre o no un inhibidor de GSDMD.

(B) Creatinina sèrica en ratolins MRL/LPR als quals s'ha rebut o no un inhibidor de GSDMD.

(C) Imatges representatives d'exemplars de ronyó tenyits amb àcid periòdic-Schiff (PAS) i percentatge de glomerulosclerosi de quantificació.

(D) Tinció immunoquímica de CD3, CD4, F4/80 i GSDMD. (E) Quantificació de les concentracions sèriques d'IL-1b en ratolins MRL/LPR que es van rebre o no un inhibidor de GSDMD.

Les dades es mostren com a mitjana ± SEM. #p < {{0}},05,="" ##p=""><>

DISCUSSIÓ

La teràpia combinada és una estratègia prometedora a causa de les taxes de resposta global i de CR més altes, un temps més breu per a la remissió i menys efectes secundaris. Fins ara, no es coneixien els mecanismes moleculars subjacents de la teràpia combinada. Recentment, Fu et al.(6) van tractar ratolins MRL/LPR amb monoteràpies o teràpia combinada i van realitzar una anàlisi transcriptòmica completa sobre ronyons sencers. Curiosament, van trobar que la teràpia combinada, però no les monoteràpies, suprimia de manera específica i única l'expressió de caspasa-1.

L'inflamsoma NLRP3/ASC/caspase-1 ara es reconeix com un contribuent clau a la patogènesi de la LN (lupusnefritis). Els inflammasomes NLRP3 dels podòcits s'activen en ratolins propensos al lupus i també en pacients amb LN (lupusnefritis). Quan es van suprimir els inflamasomes NLRP3 amb un inhibidor de la caspasa-1, es va trobar que la proteinúria, les lesions histològiques renals i l'esborrament del procés del peu podòcit es van millorar en ratolins propensos al lupus(8). Huang et al. (27) va informar que NLRP3 es va expressar en cèl·lules tubulars de LN (lupusnefritis) classe IV i que l'activació de NLRP3 es va correlacionar positivament amb la puntuació de l'índex d'activitat dels pacients amb LN. S'ha demostrat que la caspasa-1 té un paper vital en el lupus i la disfunció vascular i, per tant, és un objectiu potencial per a noves intervencions terapèutiques(28). Els fàrmacs experimentals emergents com RIP3(29), antagonistes del receptor P2X7(30), inhibidors de GSK-3 (31) i un agonista de Nrf2 (32) van inhibir el desenvolupament de LN (lupusnefritis) en ratolins MRL/LPR mitjançant la modulació de l'activitat inflammasoma NLRP3/ASC/caspase-1, cosa que posa de manifest la importància i la criticitat de l'inflamsoma NLRP3/ASC/caspase-1 a LN. Les concentracions sèriques elevades d'IL-18 estan correlacionades amb la gravetat de la malaltia i el grau de lesió/afectació renal en pacients amb LES(33). Segons el que sabem, sembla que la família gasdermin pot ser essencial per al desenvolupament depiroptosi, però hi ha hagut poca evidència de la presència de GSDMD/GSDME en pacients amb LES.

En general, es va examinar l'activació i l'expressió de GSDMD en mostres de biòpsia renal extretes de LN (lupusnefritis) pacients i ratolins MRL/LPR. La GSDMD es va induir i escindir fortament en podòcits glomerulars i cèl·lules tubulars i cèl·lules intersticials infiltrades. Posteriorment, als ratolins MRL/LPR se'ls va donar una combinació de MMF, tacrolimus i prednisona o vehicle. En comparació amb el grup de control del vehicle, l'activació de la caspasa-1 i la GSDMD es va reduir al grup de tractament combinat. El grau depiroptosia la sang perifèrica també va ser molt inferior a la LN (lupusnefritis) pacients després de l'administració de la teràpia combinada. A més,piroptosia la sang perifèrica es va correlacionar positivament amb SLEDAI, cosa que va suggerir quepiroptosia la sang perifèrica podria actuar com a marcador significatiu de l'activitat del LES. Així, vam plantejar la hipòtesi que la teràpia combinada podria conferir efectes beneficiosos a la LN (lupusnefritis) mitjançant la inhibiciópiroptosiinduït per la caspasa-1/GSDMD. Estudis anteriors d'estructura de cristall de caspasa-1 en un complex amb Ac-FLTD-CMK van revelar moltes interaccions enzim-inhibidor que van impedir el reconeixement de GSDMD per caspasa-1. Tanmateix, vam trobar que Ac-FLTD-CMK, que actua com a inhibidor derivat de GSDMD, va inhibirpiroptosien LN (lupusnefritis), que podria ser induïda per un mecanisme diferent.

Recentment, en un model murí induït per TLR7-de LES(34), els ratolins GSDMD-/- van desenvolupar un major grau de dany renal i un augment de la mortalitat, cosa que inicialment va suggerir que la supressió de GSDMD tindria un efecte protector i s'associaria amb inflamació sistèmica i producció d'autoanticossos amb augment de la mortalitat associat. Els ratolins amb deficiència de GSDMD desenvolupen una deposició més destacada d'un complex immune glomerular en mostres de ronyó i una proteïnúria més elevada en comparació amb els ratolins de tipus salvatge. També es va trobar una secreció millorada de HMGB1 extracel·lular en GSDMD-/limfòcits que suggereixen que la necrosi/piroptosies va produir quan GSDMD estava absent.

Activadors de la caspasa-1piroptosiper clivage GSDMD. En canvi, a les cèl·lules amb deficiència de GSDMD o GSDMD baixes, la caspasa-1 desencadena l'apoptosi i després la necrosi secundària depenent de GSDME ipiroptosi. Quan l'activitat de GSDMD està absent després de la teràpia, GSDME potser també podria canviar l'apoptosi mediada per la caspasa{0}}apiroptosi(35,36). A més, l'activació de la caspasa-8 es va millorar molt en els macròfags que eren deficients en GSDMD. També es va trobar una activació significativa de la caspasa-8 a la LN deficient de GSDMD induïda per TLR7- (lupusnefritis) ratolins (34). Per tant, en absència de GSDMD, és probable que la caspasa-1 cooperi amb la caspasa-8 per provocar que l'apoptosi mediada per caspasa-3-cambiï a l'apoptosi mediada per GSDME.piroptosien LN (lupusnefritis), una hipòtesi que requereix més investigació experimental.

Hi ha diverses limitacions en l'estudi actual. Primer, a partir de les dades actuals, vam comprovar que la teràpia combinada podria suprimirpiroptosi, però altres tractaments com la teràpia dual d'esteroides i MMF, esteroides i tacrolimus o anticossos anti-CD20 també poden tenir efectes comparables. En segon lloc, el mecanisme molecular exacte de l'efecte d'inhibició de la teràpia combinada sobre la caspasa-1 no està bé explorat. Finalment, però no menys important, observem la relació de les cèl·lules dobles positives de caspasa-1/PI a la sang perifèrica amb LES-DAI i el canvi abans i després del tractament de la teràpia combinada en un LN retrospectiu (lupusnefritis) cohort de pacients. El valor predictiu clínic de les cèl·lules dobles positives de la caspasa-1/PI per a l'activitat de les malalties i la resposta al tractament s'ha d'investigar més en una cohort prospectiva més gran.

En general, vam identificar que la teràpia combinada va conferir els seus efectes beneficiosos en suprimir la caspasa-1/GSDMD induïdapiroptosien LN (lupusnefritis), que va proporcionar una nova visió dels mecanismes cel·lulars implicats. De fet, la teràpia combinada va suprimir l'expressió de caspasa-1 de manera específica i única. La inhibició farmacològica o genètica de NLRP3 i caspasa-1 va millorar la funció renal i va suprimir l'autoimmunitat a la LN (lupusnefritis). El paper fisiopatològic de la caspasa-1 a la LN (lupusnefritis) és digne de més estudi, i les teràpies dirigides a GSDMD en pacients amb LN (lupusnefritis) s'han d'avaluar amb molta cura.

Mètode de tractament perpiroptosi

REFERÈNCIES

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LupusNefritis: Actualització actual.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Individualizing Therapy inLupusNefritis. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. Tractament amb èxit de la classe V més IVLupusNefritisAmb Teràpia Multitarget. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al.Multitarget Therapy for Induction Treatment ofLupusNefritis: A Randomized Trial, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al.Multitarget Therapy for Maintenance Treatment ofLupusNefritis. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. L'anàlisi transcriptòmica descobreix nous mecanismes sinèrgics en la teràpia combinada per aLupusNefritis. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LupusNefritis: NLRP3 L'inflamasoma encén la disfunció dels podòcits. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9