El tubulósido B de Cistanche Salsa rescata les cèl·lules neuronals PC12 de l'apoptosi i l'estrès oxidatiu induïts per ions de 1-metil-4-fenilpiridini

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Resum:

El neuroprotectorefectes del tubulòsid B de cistanche, un dels feniletanoides aïllats dels xinesosherbes medicinals Salsa de Cistanche, es va investigar l'apoptosi i l'estrès oxidatiu induïts per l'ió 1-metil-4-fenilpiridini (MPP plus ) a les cèl·lules neuronals PC12. Les cèl·lules PC12 tractades amb MPP ＋ van patir la mort apoptòtica tal com es determina mitjançant l'assaig MTF, citometria de flux i electroforesi en gel d'agarosa d'ADN; L'acumulació intracel·lular d'espècies reactives d'oxigen (ROS) es va mesurar mitjançant la tinció de DCFH-DA amb microscòpia confocal d'exploració làser (LSCM). El tractament simultani amb tuhulòside B va atenuar notablement la citotoxicitat induïda per la MPP, la fragmentació de l'ADN i l'acumulació intracel·lular de ROS. Aquests resultats indiquen fortament que el tubulòsid B prevé l'apoptosi induïda per MPP i l'estrès oxidatiu. El tubulósido B es pot aplicar com aanti-malaltia de Parkinsonagents.

Introducció

Patològicament, la malaltia de Parkinson (MP) esporàdica es caracteritza típicament per una pèrdua de neurones catecolaminèrgiques, especialment neurones dopaminèrgiques de la substància negra pars compacta (SNc), i la presència d'una intraneurona característica| inclusions anomenades cossos de Lewy a les regions cerebrals afectades. Tot i que hi ha diversos factors implicats en la patogènesi de la MP, els mecanismes implicats en l'inici i la progressió de la MP segueixen sent incerts, tot i que la causa de la MP encara es respon, diverses línies d'evidència suggereixen fortament la implicació de l'estrès oxidatiu, que finalment van conduir. a la mort neuronal o a l'apoptosi per la generació excessiva de radicals lliures [1], [2], [3]. El fet que el sistema dopaminèrgic nigral pugui produir alts nivells de radicals lliures i que tingui nivells relativament baixos de sistema de defensa antioxidant recolza encara més aquesta hipòtesi. Tant els estudis in vivo com els in vitro van mostrar la neurotoxicitat mediada per l'estrès oxidatiu de MPP＋, un metabòlit actiu de l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) a les neurones dopaminèrgiques [4]. ], [5]. La implicació de radicals lliures produïts excessivament per l'estrès oxidatiu com a causa propera de trastorns neurodegeneratius com la PD suggereix un paper fonamental per als antioxidants. El tubulósid B (Fig. l) va ser un dels compostos feniletanoides aïllats de les tiges deSalsa de Cistanche. Estudis anteriors havien trobat que molts feniletanoides, inclòs el tubulòsid B, mostraven una forta activitat d'eliminació de radicals lliures [6], [7].

Tenint en compte aquestes troballes, en el present estudi hem investigat l'efecte del tubunside B sobre la neurotoxicitat induïda per MPP més in vitro, utilitzant la línia cel·lular de feocromocitoma del nervi simpàtic PC12 que s'ha utilitzat amb èxit al llarg dels anys per estudiar la funció neuronal [8], [9].

anti-malaltia de Parkinson:cistanche

Materials i mètodes

Materials

Tubulòsid B deSalsa de Cistancheva ser amablement subministrat pel Dr. Li Lei (Departament de Productes Naturals, Escola de Ciències Farmacèutiques, Universitat de Pequín, Pequín, Xina). La puresa del compost va ser superior al 98 per cent per anàlisi HPLC. El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum de cavall i el sèrum fetal de vedella es van comprar a GIBCO BRL, 1-ió metil~-fenilpiridini (MPP plus ), poli-L-lisina, 3-(4, 5 -dimetiltiazol-2 -il)-2,5- bromur de difeniltetrazoli (MTT), iodur de propidi (PI), RNasa A, proteinasa K i diacetat de 2;7'-diclorofluoresceïna (DCFH-DA) es van comprar a Sigma.

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules PCI2 es van mantenir en DMEM complementat amb un 10 per cent de sèrum de cavall, un 5 per cent de sèrum fetal de vedella, 100 U/ml de penicil·lina i 100 ug/ml d'estreptomicina. Les cèl·lules es van cultivar en una incubadora humidificada airejada amb un 95 per cent d'aire i un 5 per cent de CO2 a 37 graus. Tots els experiments es van dur a terme 24-48 hores després de sembrar les cèl·lules. Les cèl·lules es van collir rutinàriament per tripsinització al 0, 25 per cent quan les cèl·lules es van apropar a l'etapa subconfluent i es van placar en matràs de cultiu de 25 cm dividits a 1: 8.

Anàlisi de la viabilitat cel·lular

La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant un assaig MTT modificat tal com es va descriure anteriorment [10], en resum, les cèl·lules PC12 es van sembrar en plaques de 96-pous a una densitat de I × 104 sostres per pou. Els cultius es van fer créixer durant 48 h, i després es va canviar el medi pel que contenia diverses concentracions de tubulnside B o MPP＋. Després d'una incubació de fins a 48 h i 72 h, es va afegir una solució de MTr (5 mg/ml en DMEM) a les plaques de pous 96- i es va deixar que les cèl·lules s'incubin durant 4 h a 37 graus. Després d'haver eliminat el medi, es van solubilitzar els cristalls cel·lulars i de colorant afegint 200 μL de DMSO i es va mesurar l'absorció a 570 nm (540 nm com a referència) amb un lector de microplaques model 550 (Bio-Rad). També es va analitzar la viabilitat cel·lular mitjançant el mètode d'exclusió del blau tripà. Les cèl·lules es van recollir, es van sedimentar suaument i es van tacar amb una solució al 0, 6 per cent de blau tripà durant 3 pluja. El percentatge de cèl·lules no acolorides es va avaluar posteriorment en deu camps de microscopi seleccionats aleatòriament. Com a fàrmac positiu, es va utilitzar 100 ng／ml de factor de creixement epidèrmic (EGF).

Detecció d'apoptosi per citometria de flux

Les cèl·lules apoptòtiques es van detectar mitjançant citometria de flux mitjançant iodur de propidi (PI) [11]. Breument, aproximadament 1 × 106 cèl·lules incubades amb substàncies de prova es van recollir per centrifugació i es van rentar una vegada amb PBS. Les cèl·lules es van fixar amb etanol al 70 per cent durant 24 h a - 20 graus i es van rentar una vegada amb PBS. Les cèl·lules es van tornar a suspendre en 300 μL de PBS que contenien 0, 5 mg/ml de RNasa i 0, 5 mg/ml de PI. Després d'una incubació addicional durant 30 minuts a la foscor, es va realitzar una citometria de flux amb un FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanya).

Vam aplicar el protocol de Moore [12] que aïllava només ADN fragmentat i els experiments es van normalitzar utilitzant un nombre igual de cultius de cada grup de prova. Breument, es van rentar 3 × 106 neurones de cadascuna de les mostres tractades en la solució de sal equilibrada de Hank (1{000g durant 10 min) i es van homogeneïtzar els pellets formats a la part inferior del tub. amb 1 ml de tampó de lisi (10 mM de Tris a pH 7,4, 5 mM d'EDTA, 1 per cent de Tritó X-100) durant 20 min sobre gel. Després de la centrifugació a 11,000 g durant 20 de pluja a 4 graus, es van eliminar els sobrenedants que contenien ADN fragmentat i es van digerir amb 20 mg/ml de RNasa A a 37 graus durant 1 h i 0,1 mg/ml de proteïnasa K a 56 graus. durant 1 h addicional. L'ADN fragmentat es va extreure amb fenol i cloroform i es va centrifugar a 1O,000g durant 1 pluja a 4 C. La fase aquosa es va transferir a un nou tub Eppendorf, es va barrejar amb 2 volums d'etanol fred i després col·locat a -20 graus durant almenys 1 h per precipitar l'ADN. Després de la centrifugació a 15,000g durant 20 min a 4 graus, es van eliminar els sobrenedants i es van rentar els pellets d'ADN amb etanol al 80% una vegada (15.000 g durant 15 min a 4 graus), es van assecar a l'aire i es van dissoldre en 20μL TE tampó a pH 7,6. A continuació, es va electroforitzar tota la mostra en un gel d'agarosa a l'1,5 per cent durant 1 h a 85 V. El gel va ser examinat i fotografiat per un sistema de documentació de gel de productes ultraviolats (GELDOC-2000, Bio-Rad, EUA).

Mesura de la formació intracel·lular de ROS

La formació de peròxids intracel·lulars es va detectar amb un microscopi làser d'exploració confocal utilitzant un compost no fluorescent, 2"7"-diacetat de diclorofluoresceïna (DCFH-DA) [13], que s'esterifica dins de les cèl·lules per esterases endògenes a l'àcid lliure ionitzat, 2. ;7"-diclorofluoresceïna. 2",7-La diclorofiuorescina és capaç d'oxidar-se a 2"7"-diclorofluoresceïna fluorescent (DCF) mitjançant hidroantioxidants. Les cèl·lules es van incubar amb 10 μM de DCFH-DA durant 30 min a 37 graus. Els cultius es van rentar dues vegades amb la solució de sal equilibrada de Hank i es van fer imatges en el mateix medi. La imatge es va fer mitjançant un microscopi làser d'exploració confocal, el DCF es va excitar a 488 nm i el filtre d'emissió era un filtre de barrera de 510 nm. Per proporcionar una comparació vàlida, es van utilitzar els mateixos paràmetres d'adquisició per a totes les observacions. Es va establir la posició vertical òptima al centre de les cel·les i després es va escanejar el camp ràpidament. Com que la il·luminació a la longitud d'ona d'excitació de 488 nm va provocar un augment de la fluorescència a causa de l'oxidació d'aquest colorant, cada camp es va exposar a la llum exactament al mateix temps. Els valors de referència de cèl·lules no estimulades es van utilitzar com a valors de control per comparar amb cèl·lules tractades amb MPP en presència o absència de tubulòsid B. Després de l'exploració, es va quantificar la intensitat mitjana relativa de fluorescència en 15-20 cossos de cèl·lules neuronals per camp de microscopi en quatre cultius separats per condició de tractament.

cistanche

Anàlisi estadística

Tots els valors obtinguts es van expressar com a mitjanes ± SD. La significació estadística de les diferències entre grups es va determinar mitjançant la prova t de Student; Els valors de p calculats inferiors a 0,05 es van considerar estadísticament significatius.

Resultats

Com es mostra a la figura 2, MPP plus va produir una disminució depenent de la dosi en la viabilitat de les cèl·lules PCI2. En canvi, l'EGF, un factor neurotròfic conegut, va produir una protecció significativa de la viabilitat cel·lular a 100 ng/mL de MPP, els efectes citotòxics induïts per també es van atenuar en presència de tubulòsid B (5, 10, 50 o 100 ug-ml-1 ), encara que amb menys potència que el fàrmac de referència (Fig. 3). El tubulósido B a aquestes concentracions va mostrar efectes citoprotectors de manera dependent de la dosi i el compost per si sol no va causar cap citotoxicitat aparent (dades no mostrades). L'electroforesi en gel de l'extracte d'ADN de cèl·lules PCI 2 tractades amb 200 µM MPP més durant 48 h va mostrar una escala d'ADN. un segell clàssic de l'apoptosi, el tubulòsid B, a dosis de 10 i 100 μ g·ml-1formació induïda de l'escala d'ADN (Fig. 4) La figura 5 mostra histogrames típics de l'anàlisi citomètrica de flux de la mort de cèl·lules apoptòtiques induïda per cèl·lules MPP＋ a PC12. en presència o absència de tubulòsid B. La quantificació del perfil del cicle cel·lular amb PI va revelar el nombre de cels amb característiques subdiploides (regió M1) indicatives de fragmentació apoptòtica de l'ADN. A les cèl·lules no tractades, la fracció subdiploide apoptòtica va ser mínima fins al 5．94% del total de 10.000 cèl·lules (Fig. 5 A). Després de 48 h d'exposició a MPP＋, el percentatge d'apoptosi va augmentar fins a 43．02;j;(Fig．5B)． Quan s'afegeix al cultiu cel·lular, el tubulòsid B va inhibir la MPP i va induir l'apoptosi d'una manera dependent de la dosi. A una concentració de 10 ug·ml-1la protecció per tubulòsid B no va ser estadísticament significativa, però a 50 i 1 00ug·ml{-1, una disminució del 45% i del 63%, respectivament, es va observar un augment del percentatge de cèl·lules de supervivència (Fig. 5D, E).

L'acumulació de ROS intracel·lular es pot detectar mitjançant l'ús de DCFH-DA．Les cèl·lules PC12 tractades amb 200 uM MPP＋ durant 48 h van mostrar una intensa fluorescència a l'interior de la cèl·lula després de la tinció amb colorant DCFH-DA (Fig. 6). El tractament simultani amb tubulòsid B (a dosis de 10 i 100 ug·ml) va inhibir la producció de ROS (el percentatge reduït va ser de 24,52 i 55,63, respectivament).

Discussió

La patogènesi de la MP implica un fort estrès oxidatiu, nivells d'antioxidants reduïts i defectes mitocondrials. tots coneguts per induir apoptosi en diversos sistemes cel·lulars. En particular, s'ha demostrat que els radicals lliures desencadenen la mort cel·lular activa a les neurones[14]. MPTP produeix una síndrome semblant al parkinsonian greu i irreversible que provoca la degeneració selectiva de les neurones dopaminèrgiques nigroestriatal en humans. Aquesta neurotoxina s'ha utilitzat per crear models animals de PD[15]．MPTP es converteix per la monoaminooxidasa B en MPP＋, que s'acumula als mitocondris. on inhibeix el complex mitocondrial I i aquells dies mitocondrials. La funció causa apoptosi[16]．Per tant, la neurotoxicitat induïda per MPP més 一 a les neurones dopaminèrgiques s'ha utilitzat àmpliament com a model etiològic de PD per a la detecció d'agents neuroprotectors.

En el present estudi, hem demostrat que la mort cel·lular induïda per MPP plus mitjançant l'estrès oxidatiu a les cèl·lules PC12 es va reduir pel tubulòsid B. A més, vam demostrar que el tubulòsid B també es protegia de manera dependent de la dosi contra l'escala d'ADN induïda per MPP plus. i apoptosi, mesurada mitjançant electroforesi en gel d'ADN i anàlisi citomètrica de flux. A més, el tractament simultani amb concentracions més altes de tubulòsid B va inhibir la producció de ROS induïda per MPP. Així, el tubulòsid B ha mostrat efectes neuroprotectors multifuncionals. Diversos mecanismes, per separat o en associació, poden estar implicats en les accions del tubulòsid B. L'efecte antioxidant és un possible mecanisme per a la neuroprotecció mediada pel tubulòsid B. Xiong Q va trobar que el tubulòsid B mostrava una forta activitat d'eliminació de radicals lliures en el radical 1,1-difenil{-2-picrilhidrazil i la xantina]xantina oxidasa generava un radical anió superòxid [6].

S'ha informat recentment que diversos feniletanoides posseeixen propietats d'eliminació de radicals lliures i protegeixen les lesions tòxiques induïdes per l'estrès oxidatiu. Les ROS produïdes per MPP plus, com ara peròxid d'hidrogen, anió superòxid i radical hidroxil, danyen fàcilment les molècules biològiques, que poden provocar, en última instància, la mort cel·lular apoptòtica o necròtica. Així, el tubulòsid B pot tenir efectes d'eliminació directes contra ROS. Tot i que les nostres dades no estableixen el lloc exacte en què actua el tubulòsid B per suprimir l'acumulació de ROS, sí que suggereixen que el mecanisme neuroprotector implica l'estimulació de les vies dels antioxidants. Un estudi de l'estructura molecular del tubulòsid B també indica que posseeix una potent capacitat per eliminar els radicals lliures (comunicació personal).

Altres mecanismes també podrien ser pertinents. Per exemple, el tubulòsid B pot tenir la capacitat de contrarestar la toxicitat de MPP, inhibint l'obertura del porus de transició de la permeabilitat mitocondrial i la disfunció. A més, també s'ha de tenir en compte si el tubulòsid B té un efecte directe de promoció del creixement sobre les cèl·lules neuronals. El mecanisme exacte de l'acció neuroprotectora del tubulòsid B encara no està clar. Es necessiten estudis addicionals per dilucidar la imatge completa del seu efecte neuroprotector.

En conclusió, el tubulósid B de l'extracte de salsa Cistanche té efectes protectors evidents sobre l'apoptosi induïda per MPP i l'estrès oxidatiu. Els seus efectes neuroprotectors contra MPP + toxicitat poden ser importants i suggereixen que pot tenir potencial terapèutic en la prevenció i el tractament de la MP.

tractament de la EP: cistanche

Referències

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Inhibition of nítric oxide by phenylethanoids in activated macrophages. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Establiment d'una línia clonal noradrenèrgica de cèl·lules de feocromocitoma suprarenal que responen al factor de creixement nerviós. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Els radicals lliures i la peroxidació lipídica no medien la mort de cèl·lules neuronals induïda per amiloide. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Caracterització cinètica de la toxicitat de l'òxid nítric per a cèl·lules PC12: efecte del temps de vida mitjana de l'alliberament de NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Un mètode ràpid i senzill per mesurar l'apoptosi dels timocits mitjançant tinció de iodur de propidi i citometria de flux. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. La infecció intracel·lular per Leishmania do nova inhibeix l'apoptosi dels macròfags. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. El FGF bàsic atenua l'estrès oxidatiu induït pel pèptid amiloide, la disfunció mitocondrial i el deteriorament de l'activitat de Na+-K+-ATPasa a les neurones de l'hipocamp. Brain Research 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L El deteriorament mitocondrial com a esdeveniment primerenc en el procés d'apoptosi induït per l'esgotament del glutatió a les cèl·lules neuronals: rellevància per a la malaltia de Parkinson. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Parkinsonisme crònic en humans a causa d'un producte de la síntesi meperidina-analògica. Ciència 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Estudis sobre la toxicitat de l'ió 1-me etil-4-fenilpiridini (MPP ＋) contra els mitocondris del cervell del ratolí. J Neurol Sci 1988; 86: 97-110