Part 2: L'equinacòsid augmenta la quantitat d'esperma a les rates dirigint-se al receptor d'andrògens hipotalàmics

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 i Xiaoying Zhang1,2

Si us plau, feu clic aquí per a la part 1

Experimenta tractament.

Experimenta 1. Els ratolins es van dividir aleatòriament en sis grups, set ratolins a cada grup (n=7).ECH(Echinacoside de cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Xina) es va administrar mitjançant una sonda intragàstrica i es va administrar propionat de testosterona (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Xina) per injecció intramuscular un cop al dia durant 14 dies segons el disseny experimental següent: Grup control: solució salina normal (10 ml/kg), ECH_(L)grup (5 mg/kg), ECH_(M)grup (20 mg/kg), ECH_(H)grup (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) i enzalutamida (inhibidor de la AR, un cop al dia cada dos dies durant 14 dies; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Xangai, Xina).

Després de 2 setmanes de tractaments, els ratolins van ser anestesiats amb èter dietílic per recollir mostres de sang per analitzar els nivells hormonals. A continuació, es van disseccionar els ratolins per separar l'hipotàlem, l'encèfal més la hipòfisi, els testicles i la cauda epidídim. Es van posar mostres de cauda epidídimis en solució salina normal amb un 5% de BSA per a l'avaluació de la qualitat de l'esperma, i l'hipotàlem, l'encèfal més la pituïtària i els testicles es van congelar en nitrogen líquid i es van emmagatzemar a -80 graus per a investigacions posteriors.

Experimenta 2. Els ratolins es van dividir aleatòriament en 10 grups, cinc animals per grup. Es va administrar ECH (20 mg/kg) per via oral i els ratolins de cada grup van ser anestesiats amb èter dietílic en els moments 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h i 12 h després de l'administració per a la recollida de mostres.

Es va recollir plasma i es va exposar el cor. La perfusió de solució salina normal als ventricles esquerres es va dur a terme mitjançant un aparell d'infusió fins que el fetge i els pulmons es van blanquejar. A continuació, es van recollir l'hipotàlem i els testicles per determinar les concentracions d'ECH en els teixits(Echinacoside de cistanche).

Experimenta 3. Els ratolins es van dividir aleatòriament en 4 grups, set a cada grup. ECH(Echinacoside de cistanche)i el BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Xangai, Xina) es van administrar mitjançant una sonda intragàstrica una vegada al dia durant 6 setmanes segons el disseny experimental següent: grup normal (oli de blat de moro, 10 ml/kg, bw/ d), grup model: grup BPA (BPA 200 mg/kg, bw/d, oli de blat de moro) i grup experimental: grup BPA més ECH (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).

Després de 42 dies de tractament, els ratolins van ser anestesiats amb èter dietílic i es van recollir mostres de sang per a anàlisis de nivell hormonal. Es van separar i recol·lectar els testicles i la cauda epidídim. La cauda epidídim es va utilitzar per a l'avaluació de la qualitat de l'esperma i el testicle es va congelar en nitrogen líquid i es va emmagatzemar a -80 graus per a una investigació posterior.

Figura 7. Vies regulades per hormones i proteïnes relacionades amb l'eix HPG seleccionades en la reproducció masculina tal com prediuen la Pathway Ontology Database i la KEGG Pathway Database.

Notes: els processos regulats es representen amb fons de diferents colors i formes, i els esdeveniments reguladors es mostren amb fletxes i línies.

Les referències enllaçades a cada proteïna es van basar en la base de dades d'ontologia de la ruta i la base de dades de la ruta KEGG i no s'enumeren.

Determinació de la qualitat dels espermatozoides. Preparació de la suspensió d'esperma. Les epidídimides de Cauda es van picar en 5 ml de solució salina normal amb un 5% de BSA i es van incubar durant 5 minuts a 37 graus per permetre que el seu contingut s'estengués al medi.

Nombre d'espermatozoides: segons el mètode descrit per Yokoi (2003), la suspensió d'esperma diluïda (1:10; v/v; suspensió d'esperma/10 per cent de metanol) es va transferir a cada cambra de recompte d'un hemocitòmetre i es va deixar reposar durant 5 min i després es va comptar amb un microscopi de llum (Nikon, Instruments Inc., Japó) amb un augment de X200.

Viabilitat de l'esperma: es van barrejar un total de 20 μL de suspensió d'esperma amb un volum igual de tinció d'eosina-nigrosina durant 2 min; els espermatozoides no tacats es van comptar amb un microscopi de llum amb un augment de 200x.

Motilitat dels espermatozoides: es van col·locar un total de 10 μL de suspensió d'espermatozoides en un portaobjectes de vidre i es van registrar com a mòbils o immòbils sota un microscopi de llum amb un augment de 200x.

Determinació dels nivells hormonals. Els nivells de testosterona (T) i LH es van quantificar en sèrum, encèfal més homogeneïtat de la hipòfisi i testicular mitjançant kits de radioimmunoassaig (RIA) (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Beijing, Xina). Breument, es van afegir anticossos anti-testosterona o anti-LH IgG (100 μL) i anticossos anti-ratolí conjugats 125-I a les mostres o a l'estàndard (100 μL) i es van barrejar en un balancí durant la nit a 4 graus. Després de rentar tres vegades amb PBS-Tween 20 (500 μL), les mescles es van centrifugar (3500 rpm/min) a 4 graus durant 15 min. Els valors de CPM dels precipitats es van avaluar mitjançant un instrument de radioimmunoassaig (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Beijing, Xina) i es van calcular les concentracions de T i LH segons la fórmula d'un estàndard. corba. El coeficient de variació T i LH és del 2,8% i del 3,2% en els grups de mostra, i del 2,1% i del 2,8% en els grups estàndard, respectivament.

Determinació de les expressions gèniques mitjançant PCR quantitativa en temps real. L'ARN total es va aïllar de teixits testiculars i encèfals congelats i hipòfisis mitjançant un kit d'ARN simple total d'ARN (Tiangen, Beijing, Xina). Es va realitzar una PCR quantitativa en temps real (q RT-PCR) per a l'amplificació d'ADNc mitjançant 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Xina). El procediment de PCR va consistir en 95 graus durant 30 segons seguits de 35 cicles de 95 graus durant 15 segons, 58 graus durant 30 segons i 72 graus durant 30 segons. L'anàlisi de la corba de fusió es va realitzar als productes de PCR per verificar l'especificitat del primer i la puresa del producte. Es va realitzar una corba de dissociació per a cada placa per confirmar la producció d'un sol producte. Es va calcular l'abundància relativa de cada ARNm. Els primers de PCR utilitzats per a l'estudi es mostren a la taula 2.

Western blot. Per a l'anàlisi de l'expressió AR, l'extracció i l'aïllament de proteïnes citoplasmàtiques i nuclears es van realitzar mitjançant un kit d'extracció de proteïnes citoplasmàtiques i nuclears (Beyotime, Nanjing, Xina) segons les instruccions del fabricant. Les concentracions de proteïnes citoplasmàtiques i nuclears es van avaluar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes Bradford (Beyotime, Jiangsu, Xina). Les mostres de proteïnes (80 ug) es van executar amb un gel SDS-PAGE del 12% i el 5% i es van transferir a membranes de PVDF. Després del bloqueig, les membranes es van incubar amb anticossos anti-AR IgG (1:1, 000; Bioss; Beijing Xina) i anticossos policlonals anti-GAPDH de ratolí (1:1,{000; Wuhan Boster). BiològicTechnology, Wuhan, Xina) o anticossos policlonals anti-Lamin b1 de ratolí durant 2 h. La membrana es va rentar tres vegades amb TBST i es va incubar amb un anticòs IgG anti-ratolí de conill conjugat amb HRP (1:5, 000; Bioss; Beijing Xina). El senyal es va visualitzar mitjançant el sistema d'imatge ChemiDoc (Tanon-3,500, Xangai, Xina).

Assaig de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC). La sang es va recollir en tubs de vidre heparinitzat. El plasma es va separar per centrifugació immediata a 6,000 rpm durant 10 min i es va emmagatzemar a -20 graus per a més experiments. Les mostres d'hipotàlem i testicles de cada moment es van agrupar i homogeneïtzar amb metanol. Després de la centrifugació a 10,000 rpm a 4 graus durant 10 min, el sobrenedant es va concentrar amb N2 i el residu es va dissoldre en 50 μL de metanol i es va filtrar a través d'un filtre de 0, 45 μm. Es van injectar deu μL del líquid filtrat de la mostra al sistema HPLC per a l'anàlisi.

La corba estàndard constava de mostres que contenien 50, 100, 250, 500 i 750 ng/mL d'ECH(Echinacoside de cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Xina). En conseqüència, es van preparar mostres de control de qualitat de plasma amb 75 ng/mL (baix), 150 ng/mL (mitjana) i 300 ng/mL (alta) de l'ECH per mesurar la precisió i la precisió del mètode.

La cromatografia es va realitzar amb un sistema HPLC (D2{{10}}00 Elite series, Hitachi, Japó) acoblat a un detector UV (L{-2400, Hitachi, Japó). La separació es va realitzar en una columna Thermo-C18 (250 mm × 4,6 mm id, partícules de 4,6 μm) mantinguda a 25 graus. La fase mòbil era un gradient preparat a partir d'àcid fosfòric al 0,1 per cent que contenia un 0,04 per cent de trimetilamina (component A) i metanol (component B). El gradient lineal va ser el següent: 70-90 per cent A durant 0-2 min, 60-70 per cent A durant 2-6 min, 55-60 per cent B durant 6-8 min i després va tornar al 90 per cent A a 8 min. min immediatament. El cabal era de 0,8 ml/min. El detector UV funcionava a 332 nm. L'àrea del pic es va avaluar com a mesura analítica.

Estudis farmacocinètics en ratolins. La penetració d'ECH(Echinacoside de cistanche)a l'hipotàlem i el testicle es va sotmetre a una anàlisi farmacocinètica amb el programari Drug and Statistics (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). Els paràmetres farmacocinètics es van determinar mitjançant el mètode no compartimental basat en la teoria del moment estadístic. Els paràmetres farmacocinètics preliminars inclouen el temps fins a la constant màxima (Tmax), la concentració màxima (Cmax), la constant de velocitat d'eliminació (Ke), la semivida d'eliminació (T0,5), l'àrea sota la corba (AUC{ {4}}–12), el volum de distribució aparent (Vc) i l'aclaració (CL) es van obtenir per a una anàlisi posterior. Les proporcions cervell/plasma es van calcular a partir dels valors AUC0-t per al plasma i el cervell.

Síntesi i identificació d'ECH-Ovoalbumina (ECH-OVA). Un total de 9,8 mg d'ECH(Echinacoside de cistanche)i 1.0 mg d'anhídrid de butandiol es van dissoldre en 2 ml de piridina, es van barrejar durant 12 h amb agitació a temperatura ambient. La mescla es va concentrar amb N2 i el residu es va combinar amb 10,8 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) i 19,3 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC) i es va dissoldre en 4 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) durant 12 h amb agitació a temperatura ambient. . Després de la centrifugació a 2, 000 g durant 5 min a 4 graus, el sobrenedant es va afegir a 5 ml de PBS en què es van dissoldre 14,4 mg d'ovalbúmina (OVA). La nova mescla es va agitar durant 24 h a 4 graus. A continuació, es va dialitzar la solució de reacció contra PBS durant tres dies. La presència d'ECH-OVA es va confirmar mitjançant espectres UV (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) a una longitud d'ona que oscil·lava entre 190 i 400 nm, així com desnaturalitzant PAGE.

ELISA indirecte (iELISA). Es va recobrir una placa de microtitulació amb l'ECH-OVA (2 ug/100 μL) i es va incubar durant la nit a 4 graus. La placa es va rentar tres vegades amb PBST i dues vegades amb PBS; i es va afegir un 5% de PBSM (PBS que conté un 5% de llet desnatada) per bloquejar els llocs no units a 37 graus durant 2 h. Després de rentar les plaques amb PBST i PBS, els pous es van dividir en 4 grups; grup experimental, 1 ug de proteïna total AR/100 μL; grup positiu, anticossos anti-OVA de conill (1:1,000); grup negatiu, 1 ug d'albúmina sèrica bovina; i un grup en blanc que conté PBS. Després d'incubació durant 1,5 h, es van rentar les plaques i es van afegir 100 μL/pou d'IgG conjugada amb HRP de conill (1:1,000) al grup positiu, es van afegir 100 μL/pou d'anti-AR (1:1,000) als altres grups. Després d'incubació durant 1,5 h, es va afegir a les plaques la dilució d'IgG conjugada amb HRP de conill (1:5,000). Després de la incubació a 37 graus durant 1 h, les plaques es van rentar tres vegades amb PBST i dues vegades amb PBS. A continuació, es va afegir TMB i es va incubar durant 10 min a la foscor a temperatura ambient i es va afegir H2SO4 2 M per aturar la reacció. L'absorbància es va llegir a una longitud d'ona de 450 nm.

Acoblament molecular. Es va realitzar un estudi d'acoblament molecular per investigar el mode d'unió del compost ECH(Echinacoside de cistanche)al receptor d'andrògens humans (AR) mitjançant Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). L'estructura tridimensional (3D) d'AR (PDB ID: 2YHD) es va descarregar del Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). L'estructura 3D d'ECH es va obtenir mitjançant el programari ChemBioDraw Ultra 14.0 i ChemBio 3D Ultra 14.0. Es va utilitzar el paquet AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) per generar els fitxers d'entrada d'acoblament. La quadrícula de cerca d'AR es va identificar com a centre x: 36.141, centre y: 8.513 i centre z:

21.304 amb dimensions mida x: 15, mida y: 15 i mida z: 15. El valor d'exhaustivitat es va establir en 20. Per a l'acoblament Vina, s'utilitzaven els paràmetres predeterminats si no s'esmentava. La postura amb millor puntuació segons la puntuació d'acoblament de Vina es va escollir i analitzar visualment mitjançant el programari PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).

Anàlisi de dades i mètodes estadístics. Les dades es van analitzar mitjançant el programari estadístic SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Es va utilitzar un ANOVA unidireccional per a la comparació entre els grups. Es van determinar les proves de comparació de Tukey de diferències significatives entre grups. Els resultats es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (SD) mitjançant el programari Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Software, Inc, Califòrnia, EUA).

Aprovació ètica i consentiment per participar. L'aprovació ètica d'aquest estudi es va obtenir del Comitè d'Ètica de l'Institut Tecnològic d'Anyang.

Referències

1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE Exercici, entrenament i eix hipotàlem-hipofisi-gonadal en homes i dones.Front. Horm. Res. 47, 27–43 (2016).

2. Papadopoulos, V. & Miller, WL El paper dels mitocondris en l'esteroidogènesi. Millor pràctica. Res. Cl. En. 26, 771–790 (2012).

3. Rone, MB et al. Identificació d'un complex de proteïnes mitocondrials dinàmiques que impulsa la importació, el tràfic i el metabolisme del colesterol a una hormona esteroide. Mol. Endocrinol. 26, 1868–1882 (2012).

4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. Excreció i mesura de metabòlits de corticosterona i testosterona en campanyes de banc (Myodes glareolus). Gen. Comp. Endocrinol. 243, 39–50 (2017).

5. O'Hara, L. et al. La senyalització del receptor d'andrògens pituïtaris regula la prolactina però no les gonadotrofines en el ratolí mascle. PloS un. 10, e0121657 (2015).

6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Receptors testiculars de LH i nivells d'hormones circulants en tres models de ratolí per a malalties hereditàries (Tfm/y, lit/lit i hyt/hyt). Endocrinol. Exp. 20, 349–58 (1986).

7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. i Scheiner-Bobis, G. La senyalització de testosterona no clàssica mediada per ZIP9 estimula l'expressió de claudina i la formació d'unions estretes a les cèl·lules de Sertoli. Cèl·lula. Senyal. 28, 1075–85 (2016).

8. Walker, WH Senyalització de testosterona i regulació de l'espermatogènesi. Espermatogènesi. 1, 116–20 (2011).

9. Cao, C. & Kindscher, K. The Medicinal Chemistry of Echinacea Species (ed. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).

10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP i Zhang, XYEchinacòsidiCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight millora el dany testicular i espermàtic induït pel bisfenol A en rates mitjançant enzims esteroidogènics regulats per l'eix de les gònades. J. Etnofarmacol. 193, 321–328 (2016).