Seqüenciació del genoma sencer per al diagnòstic dels trastorns d'expansió de repetició neurològica al Regne Unit: un estudi de validació clínica prospectiva i de precisió diagnòstica retrospectiva

Per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Resum

Fons

Els trastorns d'expansió repetida afecten aproximadament 1 de cada 3000 individus i són malalties clínicament heterogènies causades per expansions de repeticions curtes d'ADN en tàndem. Les proves genètiques solen ser específiques del locus, i donen lloc a un infradiagnòstic de persones que tenen presentacions clíniques atípiques, especialment en pacients pediàtrics sense antecedents familiars positius. La seqüenciació del genoma sencer s'utilitza cada cop més com a prova de primera línia per a altres trastorns genètics rars, i el nostre objectiu és avaluar el seu rendiment en el diagnòstic de pacients ambneurològictrastorns d'expansió repetits.

Mètodes

Hem avaluat retrospectivament la precisió diagnòstica de la seqüenciació del genoma sencer per detectar els loci d'expansió repetits més comuns associats ambneurològicresultats (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT i TBP) utilitzant mostres obtingudes al Servei Nacional de Salut d'Anglaterra de pacients que se sospitava de tenirneurològictrastorns; Els resultats anteriors de les proves de PCR es van utilitzar com a estàndard de referència. La precisió clínica de la seqüenciació del genoma sencer per detectar expansions repetides es va examinar prospectivament en pacients prèviament provats genèticament i sense diagnosticar reclutats el 2013-2017 al 100 000 Projecte Genomes al Regne Unit, que se sospitava que tenien una malaltia genètica.neurològictrastorn (formes familiars o d'inici precoç d'atàxia, neuropatia, paraplegia espàstica, demència, malaltia de la neurona motora,parkinsonianamovimenttrastorns, discapacitat intel·lectual o trastorns neuromusculars). Si es va fer una crida d'expansió repetida mitjançant la seqüenciació del genoma sencer, es va utilitzar la PCR per confirmar el resultat.

Descobriments

La precisió diagnòstica de la seqüenciació del genoma sencer per detectar expansions repetides es va avaluar amb 793 proves de PCR realitzades prèviament a l'NHS de 404 pacients. La seqüenciació del genoma sencer va classificar correctament 215 de 221 al·lels expandits i 1316 de 1321 al·lels no expandits, mostrant una sensibilitat del 97,3% (IC del 95% 94,2–99,0) i una especificitat del 99,6% (99,1–99). ·9) als 13 loci associats a la malaltia en comparació amb els resultats de les proves de PCR. En mostres de 11 631 pacients del projecte 100 000 Genomes, la seqüenciació del genoma sencer va identificar 81 expansions repetides, que també es van provar per PCR: 68 es van confirmar com a expansions repetides en el rang patogènic complet, 11 no eren -expansions o permutacions intermèdies patògenes, i dues eren repeticions no expandides (taxa de descobriments falsos del 16 per cent).

Interpretació

En el nostre estudi, la seqüenciació del genoma sencer per a la detecció d'expansions repetides va mostrar una gran sensibilitat i especificitat, i va conduir a la identificació deneurològictrastorns d'expansió repetits en pacients no diagnosticats prèviament. Aquestes troballes donen suport a la implementació de la seqüenciació del genoma sencer als laboratoris clínics per al diagnòstic de pacients que tenen unneurològicPresentació consistent amb un trastorn d'expansió repetida.

Finançament

Consell d'Investigació Mèdica, Departament de Salut i Atenció Social, National Health Service England, National Institute for Health Research i Illumina.

Introducció

Malgrat els avenços recents en la nostra comprensió de la base genètica de les raresneurològicEn part, això es deu als reptes tècnics de provar variants genètiques complexes i repetitives, incloses les expansions repetides; S'estima que aquestes expansions afecten a aproximadament 1 de cada 3.000 persones (apèndix p 1) i són la principal causa de més de 40 trastorns neurogenètics,4 incloent la malaltia de Huntington i la síndrome de l'X fràgil. Els trastorns d'expansió repetida són clínicament i genèticament heterogenis, i l'expansió repetida es pot associar a diverses malalties. Per exemple, les expansions en C9orf72 poden presentar-se com a esclerosi lateral amiotròfica o com a demència frontotemporal.5 Les expansions repetides en diferents loci també poden produir característiques fenotípiques similars, cosa que dificulta la distinció clínica: expansions repetides en almenys deu gens d'atàxia espinocerebel·losa presents freqüentment en adults. - l'atàxia d'inici6, i els de C9orf72 i AR poden causar malalties de la neurona motora.7,8.

Els trastorns d'expansió repetits són causats per un augment del nombre de seqüències repetitives d'ADN en tàndem curtes i els llindars de patogenicitat per a cada trastorn són específics del locus. La mida de l'expansió varia des de menys de 30 repeticions (per exemple, a CACNA1A) a diversos milers d'unitats de repetició (per exemple, a FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN, que poden estendre's fins a 5 kb de mida). Les expansions repetides mostren inestabilitat molecular, que poden provocar canvis en la mida de repetició (generalment augmentant de longitud) a través de generacions i teixits.4 En aquestes condicions, un augment del nombre de repeticions sovint condueix a un inici més precoç i una malaltia més greu en successives generacions.4 L'inici pediàtric dels trastorns d'expansió repetida es pot presentar com a síndromes multisistèmiques sense signatures fenotípiques específiques9 i, per tant, els nens amb aquests trastorns tenen més probabilitats de ser infradiagnosticats quan no hi ha antecedents familiars de trastorns d'expansió repetida que quan hi són presents.10– 12

L'avaluació de laboratori de les expansions repetides normalment es limita a l'avaluació molecular dirigida d'un locus individual guiada pel diagnòstic clínic sospitós mitjançant mètodes basats en PCR o Southern blot,13 que poden ser costosos i consumir temps. A més, a causa de les característiques fenotípiques variades i superposades d'aquests trastorns, els loci d'expansió repetida associats a la malaltia poden romandre sense provar.14

La seqüenciació del genoma sencer està emergint com una eina de diagnòstic de primera línia en pacients amb malalties rares15, però, fins fa poc, es pensava que tenia una capacitat limitada per avaluar els loci que contenen expansions repetides.16 Els avenços en bioinformàtica, però, han fet factible la detecció de malalties. -causant expansions repetides a partir de dades de seqüenciació de la propera generació.17–22 Aquí, informem sobre l'avaluació diagnòstica d'un enfocament de seqüenciació del genoma sencer per detectar expansions repetides mitjançant dades de PCR retrospectives i la seva validació clínica en pacients del Projecte 100.000 genomes que tenia una sospita de trastorn neurològic, no diagnosticat amb proves genètiques prèvies.

Mètodes

Disseny de l'estudi i participants

Aquesta avaluació de la seqüenciació del genoma sencer per a la detecció d'expansions repetides va incloure tant avaluacions de precisió diagnòstica com de precisió clínica. La precisió del diagnòstic es va avaluar mitjançant dades de pacients que prèviament havien estat provats per PCR per a expansions repetides conegudes per causar malalties neurlògiques.4 Els pacients es van identificar a partir de dues fonts: el projecte 100 000 Genomes i el laboratori genòmic amb seu als hospitals de la Universitat de Cambridge ( Cambridge, Regne Unit). Per als dos conjunts de pacients, els laboratoris del Servei Nacional de Salut (NHS) havien realitzat proves de PCR en mostres de pacients com a part de l'avaluació clínica rutinària: per a les mostres del Projecte 100.000 Genomes, les proves de PCR es van fer abans de la contractació per part del projecte. University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (Londres, Regne Unit); es van obtenir mostres amb expansions repetides confirmades per PCR de pacients provats pel Laboratori de Genòmica amb seu a Cambridge. Es van identificar pacients amb resultats de proves PCR positius i PCR negatius per a trastorns d'expansió repetits per incloure'ls al nostre estudi mitjançant sistemes de registre de laboratori; tots els pacients havien donat el consentiment informat per escrit per utilitzar la seva mostra amb finalitats de garantia de qualitat i investigació i formació, com a part de l'optimització i validació del servei clínic.

La seqüenciació del genoma sencer de cada mostra es va fer en un dels dos laboratoris: Genomics England (Hinxton, Regne Unit) per a les mostres del projecte 100.000 Genomes (n=254) i el Laboratori de serveis clínics d'Illumina (ICSL; San Diego, CA, EUA) per a mostres obtingudes pel Laboratori Genòmic amb seu a Cambridge (n=150). En general, aquest conjunt de dades es va utilitzar per a la part de precisió diagnòstica de l'estudi i va consistir en dades de PCR i seqüenciació del genoma sencer de 404 pacients, que cobrien 13 loci que representen els trastorns d'expansió de repetició neurològica més comuns: 11 loci associats a atàxia i atàxia tardana. trastorns neurodegeneratius d'inici (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 i FXN), un locus associat a la discapacitat intel·lectual (FMR1) i un locus associat a la distròfia miotònica (DMPK). Per a cada locus, les dades de la prova de PCR estaven disponibles per a almenys un al·lel expandit (apèndix p 24).

La precisió clínica es va avaluar examinant la concordança de les expansions repetides, detectades amb la seqüenciació del genoma sencer, amb sospita de diagnòstic clínic després de la confirmació per PCR en pacients amb sospita de trastorns neurològics genètics (formes familiars o d'inici precoç d'atàxia, neuropatia, paraplegia espàstica, demència). , malaltia de la neurona motora,parkinsonianatrastorns del moviment, discapacitat intel·lectual o trastorns neuromusculars) contractats al Projecte 100.000 Genomes el 2013-17. El projecte 100000 Genomes és un programa del Regne Unit per avaluar el valor de la seqüenciació del genoma sencer en pacients amb necessitats diagnòstiques no satisfetes en malalties rares i càncer. Després de l'aprovació ètica del Projecte 100.000 Genomes pel Comitè d'Ètica de Recerca de l'Est d'Anglaterra de Cambridge South (referència 14/EE/1112), inclòs per a l'anàlisi de dades i el retorn de les troballes diagnòstiques als pacients, aquests pacients van ser reclutats per professionals de la salut i investigadors de 13 centres de medicina genòmica a Anglaterra i es van inscriure al projecte si ells o el seu tutor van donar el seu consentiment per escrit perquè les seves mostres i dades s'utilitzin en investigacions, inclòs aquest estudi. Probands i, si era factible, altres membres de la família, es van inscriure segons els criteris d'elegibilitat establerts per a condicions específiques de malalties rares (apèndix pàgs. 5-11). Els pacients van ser reclutats per al Projecte 100.000 Genomes després de proves genètiques estàndard a l'NHS, tal com s'indica als criteris d'elegibilitat. Les dades clíniques de referència estandarditzades es van registrar mitjançant Human Phenotyping Ontology (HPO)23 contra models de dades específics de la malaltia.24 També es va recollir l'estat de la malaltia dels membres de la família, en relació amb la indicació clínica de la prova de prova.

Per identificar les expansions repetides causatives en pacients amb malaltia genèticament no diagnosticada, vam provar pacients amb sospita de trastorns genètics compatibles amb una malaltia d'expansió repetida. Els pacients es van seleccionar en funció de la concordança de la seva malaltia i els termes d'HPO amb trastorns associats a l'expansió repetida. Es van interrogar les dades de seqüenciació del genoma sencer dels pacients per buscar expansions en conjunts concrets de repeticions mitjançant quatre panells d'expansió de repetició diferents segons les seves característiques clíniques (apèndix p 5). Les expansions repetides seleccionades per incloure'ls en aquests panells són els loci d'expansió repetida que causen malalties neurològiques més freqüents. Es van provar pacients amb característiques clíniques potencialment compatibles amb més d'un trastorn d'expansió repetida en diversos panells. Si es va fer una crida d'expansió repetida mitjançant la seqüenciació del genoma sencer, es van realitzar proves de confirmació per PCR.

Per a cada pacient amb una expansió repetida confirmada, es va informar al metge local del possible resultat diagnòstic i es va valorar la contribució de l'expansió repetida a les característiques clíniques del pacient. Per a les expansions repetides que explicaven totalment o parcialment les característiques clíniques del pacient, es va emetre un informe de diagnòstic segons els procediments estàndard locals.

Procediments

Per a les mostres històriques de l'NHS utilitzades a la part de precisió diagnòstica del nostre estudi, prèviament s'havien provat les expansions repetides mitjançant l'amplificació per PCR i l'anàlisi de fragments. Es va realitzar Southern blotting per a grans expansions C9orf72. A la part de precisió clínica del nostre estudi, les expansions repetides detectades mitjançant la seqüenciació del genoma sencer en pacients del projecte 100 000 Genomes es van provar mitjançant PCR en mostres emmagatzemades als laboratoris genètics de l'NHS. Els detalls addicionals, incloses les seqüències d'encebadors, es proporcionen a l'apèndix (pàgs. 2–3, 25–26).

L'ADN es va preparar per a la seqüenciació del genoma sencer mitjançant la preparació de la biblioteca TruSeq DNA PCR-Free, i es va realitzar una seqüenciació d'extrems aparellats de 150 pb o 125 pb a les plataformes HiSeq 2000 o HiSeq X a la instal·lació de genomes d'alt rendiment per a Genomics England i a l'ICSL. . Els genomes es van seqüenciar a una profunditat mitjana de 35 × (31 × a 37 ×; apèndix p 27). El genotipat de repetició en tàndem curt es va realitzar mitjançant el paquet de programari ExpansionHunter versió 3.1.2.25,26 En resum, ExpansionHunter realinea les lectures de seqüenciació en un conjunt predefinit de repeticions en tàndem curtes per estimar la mida dels dos al·lels d'un individu (apèndix p 3).

La sortida d'ExpansionHunter inclou una estimació del nombre d'elements repetits, la mida general i el límit de confiança per a cada lloc avaluat. Les directrius de l'Associació per a Patologia Mèdica i el Col·legi de Patòlegs Americans recomanen la inspecció visual de les trucades de variants durant l'avaluació rutinària de variants de seqüenciació d'alt rendiment.27

Tanmateix, les variants de repetició en tàndem curtes no es poden visualitzar adequadament amb eines de visualització comunes com ara Integrative Genomics Viewer.28 Per examinar les dades de seqüenciació del genoma sencer subjacents a cada trucada de genotip, es va utilitzar una eina de visualització de gràfics, que permet la visualització directa dels haplotips i l'acumulació de lectura corresponent. dels genotips ExpansionHunter (annex pàg. 3, 15). La inspecció visual del gràfic d'apilament es va realitzar en totes les trucades de repetició en tàndem curtes de seqüenciació del genoma sencer per confirmar que la predicció d'ExpansionHunter per als al·lels estava totalment continguda a cada lectura (és a dir, la seqüència de repetició era més petita que la longitud de lectura de la seqüenciació); per confirmar la presència d'una expansió monoal·lèlica o bial·lèlica; per detectar trucades putatives falses positives; i detectar al·lels falsos negatius en expansions repetides bial·lèliques, com ara FXN (apèndix pp 4, 16).

ExpansionHunter estima la mida de repetició a partir de les dades de seqüenciació del genoma sencer mitjançant l'anàlisi de lectures de seqüenciació que contenen total o parcialment una repetició curta en tàndem. Si un al·lel de repetició en tàndem curt és més curt que la longitud de lectura, ExpansionHunter prediu la mida exacta; si un al·lel de repetició en tàndem curt és més llarg que la longitud de lectura, ExpansionHunter estima la mida de repetició dins d'un CI, depenent de la composició de la seqüència de locus, la profunditat de la seqüenciació i la qualitat de la seqüenciació.

Anàlisi estadística

Vam classificar les repeticions com a expandides per la seqüenciació del genoma sencer si la mida prevista per ExpansionHunter estava per sobre del tall de premutació, o no ampliada si la mida prevista estava per sota del tall (apèndix p. 28).

La sensibilitat i els CI per a la detecció d'expansió repetida de la seqüenciació del genoma sencer es van calcular com a proporció d'al·lels amb repeticions expandides entre al·lels prèviament confirmats per PCR amb repeticions expandides. L'especificitat es va estimar com la proporció d'al·lels no expandits entre repeticions no expandides provades prèviament per PCR. A l'annex (p. 1) es proporciona una descripció completa de les fórmules estadístiques.

Per comparar les mides de repetició per PCR amb estimacions de mida de repetició mitjançant la seqüenciació del genoma sencer, es van comparar els al·lels quantificats per PCR amb les mides de repetició predites per ExpansionHunter per als al·lels més curts que la longitud de lectura en els 13 loci de repetició en tàndem curts. La concordança es va calcular pel percentatge de mides de repetició predites per ExpansionHunter que estaven d'acord amb la mida quantificada per PCR, tenint en compte l'error de PCR de més o menys una repetició. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant el programari estadístic R versió 3.6.3.

Paper de la font de finançament

El disseny de l'estudi, la inscripció de pacients, la recollida de dades i la seqüenciació van ser dirigits per empleats de Genomics England i investigadors acadèmics. Els empleats d'Illumina van realitzar la seqüenciació de 150 mostres de pacients com a component planificat de tot l'estudi de precisió del diagnòstic de seqüenciació del genoma i van desenvolupar ExpansionHunter. Empleats de Genomics England, investigadors acadèmics i coautors RTH, ED i MAE van realitzar l'anàlisi i la interpretació de les expansions repetides en pacients reclutats per al projecte 100 000 Genomes. Les fonts de finançament no van tenir cap paper en la interpretació de les dades o la redacció de l'informe.

Resultats

La precisió diagnòstica de la seqüenciació del genoma sencer per detectar expansions repetides es va avaluar amb 793 proves de PCR realitzades prèviament a l'NHS de 404 pacients (64 pacients van ser provats per més d'una repetició; figura 1). D'aquestes proves, 183 es ​​van classificar com a repetició expandida i 610 com a sense expansió repetida per PCR, donant un total de 221 al·lels individuals expandits i 1321 no expandits a través de 13 loci de malaltia (apèndix pàg. 24, 28). La seqüenciació del genoma sencer va classificar correctament 215 de 221 al·lels expandits i 1316 de 1321 al·lels no expandits en comparació amb els resultats de la prova de PCR (apèndix pp 27, 29), mostrant una sensibilitat inicial del 97,3 per cent (IC del 95 per cent 94,2-99). ·0) i especificitat del 99,6 per cent (99,1–99,9; taula 1). Després de la correcció visual de totes les trucades en funció de la qualitat de les lectures, la sensibilitat va augmentar fins al 99.1 per cent (96.8-99.9) i l'especificitat fins al 100 per cent (99.7-100; figura 2A, taula 1). La visualització dels al·lels expandits va permetre la detecció de resultats falsos positius i la reclassificació de tots els al·lels falsos negatius a FXN, dels quals només un al·lel es va classificar correctament com a expandit en mostres amb expansions bial·lèliques (apèndix pàgines 17, 18).

La longitud de repetició es va quantificar per PCR en 509 proves de PCR que van interrogar 945 al·lels a través de 13 loci d'expansió repetida. Les correlacions entre ExpansionHunter i PCR per a mides repetides més curtes i més grans que la longitud de lectura de la seqüenciació (és a dir, 150 bp) es mostren a l'apèndix (apèndix pàg. 19). Es va observar una alta concordança per a repeticions més curtes que la longitud de lectura, amb un acord del 92,7 per cent (836 de 902) entre PCR i ExpansionHunter. Es va observar una variabilitat de locus, amb una alta concordança entre ExpansionHunter i PCR per a ATXN2, ATXN7, CACNA1A i HTT, i baixa concordança per a DMPK o TBP (apèndix p. 30). ExpansionHunter va subestimar les longituds dels al·lels més grans que la longitud de lectura, cosa que va afectar la precisió de la trucada a DMPK, FMR1 i FXN (figura 2B, apèndix pàgines 19, 31).

Tot i que ExpansionHunter va ser capaç d'identificar correctament al·lels expandits grans a FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN (apèndix p. 29), les estimacions de mida previstes van tendir a ser inferiors a les obtingudes per PCR a mesura que la mida de repetició augmentava dins del rang patogènic, cosa que va afectar el capacitat de distingir entre expansions grans i petites a DMPK, C9orf72 i FXN, o entre expansions completes i permutacions a FMR1 (apèndix pàg. 31). Per exemple, els loci amb una longitud de repetició avaluada per PCR superior a 200 repeticions a FMR1 i classificats com a mutació completa tenien una mida de repetició mitjana estimada per ExpansionHunter de 92·6 (SD 17·8; apèndix p. 31).

Per provar la capacitat de repetir la detecció d'expansió mitjançant la seqüenciació del genoma sencer per resoldre el diagnòstic de pacients provats prèviament i no diagnosticats genèticament, vam provar 11 631 pacients amb sospita d'un trastorn neurològic genètic reclutats al Projecte 100.000 genomes (figura 1). Les dades de seqüenciació del genoma sencer es van avaluar mitjançant quatre panells d'expansió repetits diferents segons les característiques clíniques del pacient. El nombre de pacients provats amb cadascun dels quatre panells es mostra a la taula 2.

En general, vam detectar i confirmar visualment expansions repetides en mostres d'105 pacients (taula 2, apèndix pp 20, 33). D'aquestes, 81 mostres estaven disponibles per a proves de confirmació per PCR, i 68 es van confirmar que tenien una expansió repetida (0·6 per cent de rendiment): 45 (1·2 per cent) de 3692 al panell A, vuit (0} {18}}·3 per cent ) de 2743 al panell B, cinc (0,6 per cent ) de 860 al panell C i deu (0,1 per cent ) de 6731 al panell D. Tretze de 81 trucades d'expansió no es van confirmar com a expansions repetides patògenes (taxa de descobriments falsos del 16 per cent). D'aquests, dos eren al·lels no expandits en ATXN1 i ATXN2, quatre eren trucades de mida intermèdia FMR1 (apèndix p 21) i set eren permutacions FMR1.

A la taula 3 es proporcionen els detalls clínics dels 68 pacients amb expansions repetides confirmades per PCR, incloses les seves presentacions clíniques, l'expansió repetida identificada i la contribució de l'expansió repetida a les característiques clíniques del pacient; els termes de l'HPO, la mida de repetició estimada per ExpansionHunter i si s'ha emès un informe de diagnòstic es mostren a l'apèndix (pàg. 33).

Es van observar expansions en pacients que presentaven una àmplia varietat de presentacions clíniques superposades provades amb el panell A (taula 3, apèndix p. 22), inclosa una expansió repetida d'ATXN2 en un pacient amb malaltia de Parkinson d'inici precoç sensible a la levodopa i antecedents d'atàxia cerebel·losa progressiva. , i expansions AR en quatre pacients diagnosticats clínicament de malaltia de Charcot-Marie-Tooth, inclòs un amb una neuropatia desmielinizant confirmada genèticament (és a dir, malaltia de Charcot-Marie-Tooth tipus 1, pacient 42; apèndix p. 33). Es va observar una àmplia gamma de diagnòstics clínics previs en pacients amb expansions repetides patògenes.

Per exemple, en set pacients amb esclerosi lateral amiotròfica o una altra malaltia de la neurona motora, es van identificar expansions en AR (n=4) i C9orf72 (n=3). En pacients amb sospita d'atàxia hereditària, vam identificar expansions en loci que no s'havien avaluat com a part del treball diagnòstic rutinari dins del NHS en el moment del reclutament, incloent ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP i HTT ( taula 3). També vam detectar expansions repetides en pacients amb característiques clíniques consistents amb trastorns alternatius d'expansió repetida, inclosa una expansió C9orf72 en la malaltia de Parkinson d'inici precoç i familiar (pacient 24, taula 3) i expansions repetides en el rang de penetració reduït en HTT (38 repeticions) en dues germanes amb un trastorn del moviment, demència, depressió i dificultats de parla (pacients 44 i 45), subratllant el repte diagnòstic que presenten aquests trastorns d'expansió repetida.

Es va trobar que vuit nens provats amb el panell B tenien grans expansions repetides de CAG (figura 3), set dels quals explicaven completament les característiques clíniques del pacient. Sis pacients no tenien antecedents familiars informatius i no se'ls havia proposat repetir les proves d'expansió com a part de la seva avaluació clínica en el moment del reclutament (pacients 48-53; taula 3, apèndix p. 33). Dos d'aquests nens portaven grans expansions HTT (90-100 repeticions CAG). Cal destacar que un nen havia heretat la repetició d'un pare no afectat sense antecedents familiars de la malaltia de Huntington. Les proves familiars estan en curs, però s'ha identificat un al·lel de penetració reduïda a la família extensa, cosa que indica que la repetició s'havia expandit en més de 60 unitats repetides en una sola generació (pacient 52). En el moment d'escriure aquest article, ningú de la família no mostrava cap signe de la malaltia de Huntington, i s'estan realitzant proves i assessorament genètic per als pares. Dos nens menors de 5 anys van portar grans expansions repetides a ATXN7 i van presentar una malaltia multisistèmica complexa. Per a un d'aquests nens (pacient 50), els seus pares van mostrar problemes de marxa 2 anys després de la inscripció al Projecte 100.000 Genomes. De la mateixa manera, es va trobar que una nena de 10 anys amb discapacitat intel·lectual tenia una 99-expansió repetida a ATXN2, malgrat que els dos pares van ser designats com a no afectats, i es va trobar que una noia de 18 anys amb demència portava un {{ {19}}repetiu l'expansió a ATN1 (apèndix pàg. 33).

Es van detectar cinc expansions en DMPK (tauler C), inclòs en un nen i una mare amb un diagnòstic clínic de distròfia muscular, en dos germans amb sospita de miopatia distal i en un adolescent amb miopatia congènita (pacients 54-58). Es van detectar expansions FMR1 (tauler D) en nou nens i una noia, i un diagnòstic de síndrome de X fràgil va explicar totalment o parcialment les característiques clíniques que es presenten (pacients 59-68).

Discussió

El diagnòstic dels trastorns d'expansió repetida és un repte a l'assistència sanitària a causa de les característiques clíniques heterogènies i superposades i de les troballes clíniques inespecífiques, que poden augmentar en gravetat amb l'edat i en cada generació posterior. Els trastorns d'expansió repetida es troben entre les causes més freqüents de malalties neurològiques hereditàries.4 No obstant això, els pacients poden estar infradiagnosticats, ja sigui perquè no s'han realitzat proves genètiques suficients o perquè encara no s'han descobert les variants genètiques causants. Actualment, els enfocaments de prova estan fragmentats, i els pacients poden provar el locus d'expansió repetit incorrecte29 o rebre una prova molecular per a una classe diferent de variant a causa de la superposició de les característiques clíniques amb altres trastorns genètics neurològics.30

La seqüenciació del genoma sencer s'ha utilitzat en diversos entorns com a prova diagnòstica de primera línia per a trastorns neurològics rars, però anteriorment s'ha pensat que té una capacitat baixa per detectar expansions repetides.16 S'han desenvolupat diverses eines per identificar expansions repetides del genoma sencer. seqüenciació en l'àmbit de la investigació,31 però cap d'aquests enfocaments s'ha aplicat a les dades de seqüenciació del genoma sencer recollides d'un gran nombre de pacients en un únic servei sanitari. Presentem evidències que un algorisme dissenyat per detectar expansions repetides a partir de la seqüenciació del genoma sencer pot avaluar de manera fiable les expansions repetides que causen malalties més comunes i resoldre casos prèviament no diagnosticats genèticament en una gran cohort de pacients amb trastorns neurològics. Els nostres resultats indiquen que la seqüenciació del genoma sencer pot distingir entre al·lels no expandits i expandits amb una gran sensibilitat i especificitat en 13 loci d'expansió repetida (que es poden millorar encara més mitjançant una inspecció visual), pot calcular amb precisió la mida dels al·lels més petits que la longitud de lectura. , i podria subestimar la mida de les grans expansions a FMR1, DMPK, FXN i C9orf72.

Quan es va avaluar la detecció d'expansions repetides mitjançant la seqüenciació del genoma sencer amb resultats positius i negatius obtinguts prèviament als laboratoris de diagnòstic clínic de genòmica mitjançant mètodes estàndard d'or, vam trobar un mínim del 97,3 per cent de sensibilitat i un 99,6 per cent d'especificitat. A més, vam demostrar que tant l'especificitat com la sensibilitat es poden millorar mitjançant la curació manual del pileup de lectura, permetent la detecció de resultats falsos positius i la reclassificació d'al·lels falsos negatius en mostres amb expansions bial·lèliques. Dels 6.731 pacients provats per FMR1 (tauler D), es preveia que s'ampliarien 124 trucades. Vam poder excloure 97 mitjançant una inspecció visual com a possibles falsos positius. Això indica que 1 de cada 54 proves de seqüenciació del genoma sencer tindria una trucada FMR1 que caldria inspeccionar visualment per descartar una possible trucada falsa positiva. S'està treballant per millorar el mètode de genotipat ExpansionHunter per reduir el nombre de trucades falses positives per a FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 repeticions) causen una malaltia més greu i l'atàxia espinocerebel·losa tipus 36 (NOP56), per a la qual les expansions superiors a 650 repeticions es consideren patògenes i les mides de repetició de 15 a 650 es consideren intermèdies i variants de significació incerta.

S'han identificat més de 40 loci d'expansió repetida; molts d'aquests loci només s'han identificat recentment i ara s'associen a condicions que abans no s'explicaven, com ara l'atàxia cerebel·losa amb neuropatia i la síndrome d'arèflexia vestibular (RFC1) 32 i l'epilèpsia mioclònica (SAMD12). seleccionats per al nostre estudi en funció de la disponibilitat de mostres de control positives i negatives.

Les troballes que es presenten aquí suggereixen que ExpansionHunter hauria de ser capaç de classificar els al·lels no expandits i expandits amb precisió en qualsevol lloc d'expansió repetida si els al·lels no expandits són més petits que la longitud de lectura (és a dir, 150 pb). Tot i que la majoria dels loci d'expansió repetida tenen al·lels que són menors de 150 pb quan no estan expandits, alguns loci per als quals la mida de l'al·lel no expandit és propera als 150 pb (per exemple, NOTCH2NLC)34 poden ser més difícils de genotipar mitjançant aquest enfocament. Per als llocs on la repetició expandida és significativament més gran que la longitud de lectura, la seqüenciació del genoma sencer pot detectar expansions patògenes (per exemple, NOP56,35 RFC120,32). Les tecnologies emergents de seqüenciació de lectura llarga poden oferir enfocaments complementaris a l'hora de genotipar grans expansions.36

L'avaluació de les expansions repetides mitjançant la seqüenciació del genoma sencer en 11 631 pacients no diagnosticats reclutats per al projecte 100 000 Genomes va donar lloc a 68 pacients amb troballes explicatives. Els pacients van ser reclutats per al projecte 100 000 Genomes després de proves genètiques estàndard; per tant, la proporció d'expansions repetides identificades en aquesta cohort representa un augment del rendiment diagnòstic de les proves estàndard del NHS, que inclouen proves específiques del lloc per a trastorns d'expansió repetits com ara FXN o DMPK. Cal destacar que alguns diagnòstics no es van sospitar en funció de les característiques clíniques del pacient, inclosos sis pacients pediàtrics que no tenien antecedents familiars coneguts d'un trastorn d'expansió repetida. Les mides d'expansió repetides mitjanes previstes per la seqüenciació del genoma sencer en pacients pediàtrics descrites en aquest estudi són substancialment més grans que la mitjana en adults, d'acord amb l'expectativa que expansions més grans s'associen amb un inici més precoç i greu, fins i tot en nens. Cal més treball, però aquesta troballa suggereix que una avaluació de la patogenicitat depenent de l'edat i de la mida repetida podria donar suport a un diagnòstic pediàtric reduint el perill potencial d'identificar al·lels de risc d'aparició adulta, donant lloc a proves predictives no sol·licitades en nens.

Les nostres troballes permeten establir un flux de treball de diagnòstic clínic per a la seqüenciació del genoma sencer (apèndix pàg. 23). Proposem que es faci una inspecció visual per a totes les trucades classificades com a expandides per detectar falsos positius, i per a expansions bial·lèliques per a les quals només s'ha detectat un al·lel expandit (p. ex., FXN). Recomanem que els laboratoris utilitzin ExpansionHunter per avaluar la presència d'una expansió sense complir l'estimació de la mida i realitzar proves de PCR confirmatòries com a component estàndard del flux de treball de proves.

Les malalties hereditàries rares inclouen una àmplia gamma de característiques clíniques, fent que les proves genòmiques específiques del lloc siguin ineficients, àrdues i cares. Presentem evidències que la seqüenciació del genoma sencer de grau clínic amb el potencial de diagnosticar una sèrie de malalties neurològiques rares que normalment es presenten amb una única base, indel o variants de nombre de còpia ara es podria ampliar per repetir expansions. Com que la seqüenciació del genoma sencer proporciona una prova única que pot identificar les expansions repetides més comunes, a més de permetre la prova de mutacions puntuals i variants de nombre de còpies en gens associats a aquestes condicions simultàniament, ofereix l'oportunitat d'identificar la majoria de pacients amb aquests trastorns heterogenis. que no han estat diagnosticats mitjançant proves específiques del lloc. En l'era de les teràpies emergents per a aquests trastorns, la detecció precoç podria ser crucial.37 Aquests resultats donen suport a la implementació de la seqüenciació del genoma sencer per a la detecció d'expansions repetides en laboratoris de diagnòstic clínic, un enfocament que ja s'ha inclòs a l'NHS England National Genomic. Directori de proves,38 per a la investigació de malalties neurlògiques rares no diagnosticades.

Referències

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Un sostre diagnòstic per a la seqüenciació de l'exoma en l'atàxia cerebel·losa i els trastorns neurològics relacionats. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Paraplegia espàstica hereditària a Grècia: caracterització d'una població prèviament inexplorada mitjançant la seqüenciació de la propera generació. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Rendiment diagnòstic d'un panell de gens de seqüenciació de propera generació dirigit per a trastorns del moviment d'inici pediàtric: un estudi de cohort de 3-any. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Malalties d'expansió repetida. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 demència frontotemporal i/o esclerosi lateral amiotròfica. Seattle, WA: Universitat de Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Atàxia espinocerebel·losa. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Neurogenètica clínica: atàxia espinocerebel·losa autosòmica dominant. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Atròfia muscular espinal i bulbar. A: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GenReviews. Seattle, WA: Universitat de Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Forma letal d'atàxia espinocerebel·losa tipus 7 amb inici precoç a la infància. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Agregació i ubiqüitinació de l'ataxina-7 en SCA7 infantil amb 180 repeticions CAG. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Atàxia espinocerebel·losa tipus 2 que es presenta amb regressió cognitiva a la infància. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Atàxia espinocerebel·losa d'inici infantil 3: distonia de la llengua com a manifestació primerenca. Tremolor Altres moviments hipercinètics 2019; publicat en línia el 13 de setembre.

13 Ocell TD. Distròfia miotònica tipus 1. A: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GenReviews. Seattle, WA: Universitat de Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Freqüència de SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS i C9orf72 repeteixen expansions en pacients amb SCA negatives per als subtipus SCA més comuns. BMC Neurol 2018; 18: 3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Seqüenciació del genoma sencer de pacients amb malalties rares en un sistema de salut nacional. Natura 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Cap a la medicina de precisió. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Utilitat diagnòstica i clínica de la seqüenciació del genoma sencer en una cohort de famílies xineses no diagnosticades amb malalties rares. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling the genoma-wide landscape of tandem repeat expansions. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Detecció d'expansions de repeticions en tàndem en cohorts seqüenciades amb dades de seqüenciació de lectura curta. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Identificació basada en bioinformàtica de repeticions expandides: una expansió de pentàmers intrònics no de referència a RFC1 provoca CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Variants del número de còpia en la seqüenciació clínica del genoma: desplegament i interpretació per a malalties rares i no diagnosticades. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Detecció a tot el genoma de repeticions d'ADN en tàndem que s'expandeixen en l'autisme. Natura 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: una eina per anotar i analitzar la malaltia hereditària humana. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genòmica Anglaterra. Models de dades clíniques de malalties rares. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (consultat el 4 d'agost de 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Detecció d'expansions repetides llargues a partir de dades de seqüències de genoma sencer sense PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: una eina basada en gràfics de seqüències per analitzar la variació en regions curtes de repetició en tàndem. Bioinformàtica 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Estàndards i directrius per validar canonades bioinformàtiques de seqüenciació de nova generació: una recomanació conjunta de l'Associació per a la Patologia Molecular i el Col·legi de Patòlegs Americans. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Visor de genòmica integradora. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Homogeneïtat fenotípica de la presentació semblant a la malaltia de Huntington en una família SCA17. Neurologia 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. La malaltia de Huntington, la malaltia de Huntington semblants i la corea hereditària benigna: què hi ha de nou? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Avenços recents en la detecció d'expansions repetides amb seqüenciació de lectura curta de nova generació. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. L'expansió bial·lèlica d'una repetició intrònica en RFC1 és una causa comuna d'atàxia d'aparició tardana. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Expansions de repeticions intròniques de TTTCA i TTTTA en l'epilèpsia mioclònica familiar benigna d'adults. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Expansions repetides de CGG no codificants en la malaltia d'inclusió intranuclear neuronal, la miopatia oculofaringodistal i una malaltia superposada. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Diagnòstic ràpid de l'atàxia espinocerebel·losa 36 en una família de tres generacions mitjançant dades de seqüenciació del genoma sencer de lectura curta. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Seqüenciació de lectura llarga emergent en genètica mèdica. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Trastorns d'expansió repetida: mecanismes i terapèutiques. Neuroterapèutica 2019; 16: 924–27.

38 Sistema Nacional de Salut. Directori nacional de proves genòmiques: criteris de prova per a malalties rares i hereditàries. Octubre, 2021.