Activitat de xantina oxidoreductasa en plasma pobre i ric en plaquetes com a indicador d'estrès oxidatiu en pacients que requereixen teràpia de substitució renal

Antecedents abstractes: Xantina oxidoreductasa(XOR) és un enzim hidroxilasa implicat en el metabolisme de les purines. L'activitat XOR pot variar: la proteïna homodímer es pot convertir en dues isoformes diferents XD (antioxidant) i XO (prooxidant). Estrès oxidatiu i infamació que l'acompanyenmalaltia renal crònica(CKD), la diàlisi i el trasplantament de ronyó, van donar lloc a l'activació de plaquetes. El present estudi pretenia determinar la influència de la teràpia de substitució renal aplicada sobre la xantina oxidoreductasa i la seva activitat isoforme.

Materials i mètodes: el grup d'estudi estava format per 117 pacients, dividits en 4 grups: pacients amb hemodiàlisi - 30, pacients amb diàlisi peritoneal - 30, pacients amb trasplantament renal - 27 i tractament conservador {{5} } pacients. El grup control estava format per 30 voluntaris sans. Resultats: es van trobar diferències significatives en l'activitat XOR en plasma pobre en plaquetes (PPP) dins dels grups estudiats (p=0.001). Hi va haver una relació entre el tipus de teràpia de substitució renal de totes les isoformes d'oxidoreductasa en PPP (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thecausa de la malaltia renal crònicatambé es va reflectir en les diferències en l'activitat XD i XO en PPP.

Conclusions: El tipus de teràpia substitutiva renal utilitzada en pacients amb ERC, l'edat dels pacients, la durada de la diàlisi, les causes de la ERC i l'etapa de progressió afecten significativament l'activitat de XOR i les seves isoformes.

Paraules clau: Xantina oxidoreductasa, plaquetes, teràpia de substitució renal,Malaltia renal crònica, Enzims antioxidants

QUANT TEMPS TREGA A FUNCIONAR CISTANCHE?

Fons

La xantina oxidoreductasa (XOR) és un enzim hidroxilasa implicat en el metabolisme de les purines. Catalitza l'oxidació de la hipoxantina a xantina i la xantina a àcid úric (UA). L'activitat XOR pot variar: la proteïna homodímera es pot convertir en dues isoformes diferents. La xantina deshidrogenasa (XD) s'expressa predominantment en el teixit sa, i la xantina oxidasa (XO) es genera per modificacions XD post-traduccionals, residus de cisteïna d'oxidació i proteòlisi limitada, jugant un paper dominant a les cèl·lules i teixits durant les lesions [1–3] ]. Les activitats de les isoformes esmentades s'oposen entre elles [4]. XOR actua en presència de NAD+ com a deshidrogenasa, i amb oxigen molecular com a oxidasa. La capacitat de XOR de convertir-se ràpidament d'antioxidant a oxidant, en diversos tipus de dany tissular, és un element essencial per a una resposta immune innata ràpida, beneficiosa, per exemple, en infeccions bacterianes o fúngiques [5].

Una reacció intermèdia de la xantina deshidrogenasa (XDO) i l'oxigen poden reaccionar tant amb NAD+ com amb O2, però presenten una afinitat més alta per NAD+ [6]. Aquesta isoforma intermèdia no ha estat aïllada, però la determinació de la seva activitat facilita el seguiment de la transformació de XD a XO [7].

S'ha investigat àmpliament l'activitat XOR sèrica en diverses malalties. El motiu de l'interès per aquest enzim és el dualisme de la seva acció: la capacitat de produir antioxidants i, d'altra banda, la creació d'espècies reactives d'oxigen. Es produeix un augment de l'activitat XOR en condicions patològiques com l'hepatitis viral, la mononucleosi infecciosa, les malalties autoimmunes, la pneumònia, l'esquizofrènia i la diabetis tipus II. L'augment de l'activitat XOR també s'observa en el sèrum dels pacients després d'un trasplantament renal o hepàtic [8]. S'ha demostrat que el gen que codifica XOR pot ser responsable de la maduració renal i de l'adipogènesi als ronyons, i pot prevenir la transformació de les cèl·lules epitelials en teixit mesenquimal [9]. Tanmateix, a causa del nostre millor coneixement, no hi ha informes publicats que investiguin l'activitat XOR en plasma pobre en plaquetes (PPP) i plasma ric en plaquetes (PRP) en pacients sotmesos a teràpia de substitució renal. La importància de l'activitat XOR en aquest grup de pacients està relacionada amb l'augment de l'activació plaquetària, que és causada per l'estrès oxidatiu i la infamació que acompanyen la malaltia renal crònica (ERC), la diàlisi i el trasplantament de ronyó. A més, durant la diàlisi i el trasplantament d'òrgans, els teixits i els vasos sanguinis es danyen, i les plaquetes són les primeres cèl·lules que arriben al lloc del dany tissular, participant activament en les etapes inicials del procés inflamatori i de la curació [10].

PRP i PPP són fraccions de plasma sanguini amb diferents concentracions de plaquetes. El contingut de plaquetes de PRP i PPP és de plaquetes/ml i plaquetes/ml, respectivament. El PPP i el PRP s'obtenen centrifugant i rentant repetidament la sang sencera dels humans a diferents velocitats de centrifugació [11, 12].

El PPP, com a subproducte de centrifugació de la sang anticoagulada, té una concentració de plaquetes més baixa que la sang normal. Els components principals del PPP són el fibrinogen, la fibronectina i la trombina. Els efectes biològics de la PPP participen en l'hemostàsia i la coagulació, actuant com a vector d'adhesió cel·lular i promovent la mitosi de fibroblasts i cèl·lules epitelials [13]. Tot i que el PPP no està tan concentrat a les plaquetes com el PRP, s'ha demostrat que el PPP també pot mantenir el creixement i la supervivència cel·lular. El PPP promou les funcions cel·lulars associades a la cicatrització de ferides i accelera la migració cel·lular i la proliferació de fibroblasts [14, 15]. El plasma ric en plaquetes té plaquetes més concentrades que el plasma normal (aproximadament 150–400 × 103 cèl·lules/dL). És una de les definicions més comunes de PRP a la literatura [16]. Fins ara, estudis limitats van caracteritzar XOR i la seva activitat isoforme en plasma ric o pobre en plaquetes en pacients amb malaltia renal crònica. Tan et al. van mostrar cèl·lules danyades per espècies reactives d'oxigen (ROS) (en el cas de la teràpia de substitució renal crònica) "fuites" isoformes XOR, donant lloc a l'augment del nivell d'enzim al plasma [17]. Aquest mecanisme explica la menor activitat de XOR i les seves isoformes en plaquetes en comparació amb PPP. Per tant, l'activitat de les oxidoreductases en PPP i PRP són de gran interès, ja que podrien ajudar a descobrir els processos cel·lulars que es produeixen diàriament, sis. Aquestes investigacions també podrien destacar indirectament la gravetat de l'estrès oxidatiu en aquest grup de pacients.

Berry et al. descriure també que la xantina oxidoreductasa es distribueix al fetge, l'intestí prim, la glàndula mamària i les cèl·lules endotelials. Els mètodes de localització subcel·lular han demostrat la presència de xantina oxidoreductasa tant al citoplasma com a les membranes cel·lulars. També indiquen que la xantina oxidasereductasa plasmàtica pot ser deguda a l'ombra de la xantina oxidoreductasa de les membranes cel·lulars o a les fuites del citoplasma. Aquesta és una de les raons per les quals provem l'activitat de XOR en PPP i PRP per distingir l'activitat enzimàtica en plaquetes i altres cèl·lules sanguínies contingudes al plasma [18]. A partir de l'activitat dels enzims antioxidants, també podem determinar quin tipus de teràpia de reemplaçament renal té menys probabilitats d'exposar el pacient a l'estrès oxidatiu. A causa de la naturalesa dual de XOR, la comprensió de la relació entre el tipus de teràpies de substitució renal i l'activitat de les isoformes XOR pot ser molt interessant i útil en la selecció del tipus de teràpia de substitució renal.

Materials i mètodes

Aprovació i consentiment ètic

La Comissió de Bioètica de la Universitat de Medicina de Pomerània a Szczecin va aprovar la investigació realitzada (no KB−0012/36/11). Tots els participants, inclosos els voluntaris sans del grup control, van ser informats sobre el propòsit i l'abast de l'estudi i van donar el seu consentiment per donar mostres i publicar les dades resultants.

Grup d'estudi

Hi va haver 147 participants: un grup de control de 30 voluntaris sans (NK) i 117 pacients amb malaltia renal crònica (ERC) que assistien a la Clínica de Nefrologia, Transplanetologia i Malalties Internes de la Universitat Mèdica de Pomerània a Szczecin. Els pacients es van dividir en 4 grups segons el tractament que van rebre: 30 pacients abans i després de l'hemodiàlisi (HD A i HD B): 30 pacients van rebre diàlisi peritoneal (DP); 27 pacients abans i després dels trasplantaments de ronyó (5-7 dies després de la cirurgia) (TE, TE A); 30 pacients van rebre tractament conservador (TC) (estadi CKD 2-5). El gènere, l'edat, la durada de la diàlisi, la causa i l'estadi de la malaltia renal crònica i la concentració de creatinina en els grups de prova i control es mostren a les taules 1 i 2.

Mostres

Es van extreure mostres de sang (K2EDTA (8 ml), citrat trisòdic al 3,8% (9: 1; v / v) i sèrum (8 ml)) de tots els participants de l'estudi. Es va extreure sang dels pacients hemodializats de la seva fístula arteriovenosa; es va utilitzar la venopunció perifèrica per a la resta de participants. Les mostres es van prendre de pacients en hemodiàlisi abans (HD A) i uns 10 minuts després d'aturar la bomba (HD B). La sang del pacient trasplantat es va recollir abans del trasplantament (TE) i 5-7 dies després de la cirurgia (TE A). Els pacients reclutats per al grup TE no pertanyien al grup de pacients amb hemodiàlisi o diàlisi peritoneal en aquest estudi. Eren pacients qualificats per al trasplantament d'arreu de Polònia. La gran majoria dels pacients amb trasplantament de ronyó tenien una anàlisi prèvia. Les mostres de K2EDTA i de sang coagulada es van centrifugar a 2600 rpm durant 10 min a 20 graus per obtenir plasma i sèrum, respectivament. Per obtenir plasma ric en plaquetes (PRP) i plasma pobre en plaquetes (PPP), la sang recollida amb citrat es va centrifugar en les condicions a 1100 rpm durant 10 min a 20 graus. El PRP resultant es va transferir a un tub nou i es va centrifugar a 6000 rpm durant 10 min a 20 graus: el plasma pobre en plaquetes (PPP) es va transferir a un tub separat; el pellet de plaquetes es va esbandir dues vegades i es va suspendre en tampó Tyroda (pH7, 4). El plasma, el sèrum, el PPP i el PRP es van congelar a -80 graus fins que es van realitzar els assajos. En pacients amb hemodiàlisi, es va recollir sang abans de l'administració d'heparina i després de la diàlisi que va durar de mitjana entre 4 i 5 hores (vida mitjana de l'heparina - 4 h) per eliminar qualsevol possible influència de l'heparina en l'activitat XOR.

Activitat de la xantina oxidoreductasa en plasma pobre en plaquetes i plaquetes

Les determinacions es van dur a terme amb un espectrofotòmetre Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Els canvis d'extinció es van registrar a 340 nm (XD) i 302 nm (XDO, XO) durant 5 minuts a 30 graus. L'activitat enzimàtica es va mesurar com la formació d'àcid úric i NADH (augments en A340 i A302) i es va expressar en mU × mL-1 (miliunitats per mil·lilitre). Es va calcular l'activitat enzimàtica tenint en compte les velocitats inicials de reacció. La formació d'àcid úric es va mesurar a 302 nm (isoformes XDO i XO) perquè la seva absorbància encara és alta, mentre que els canvis en la concentració de NAD+ no hi contribueixen. El coeficient d'extinció del NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1] es va utilitzar per calcular l'activitat de les isoformes de la xantina oxidoreductasa NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Taula 1 Característiques generals dels pacients en hemodiàlisi (HD), diàlisi peritoneal (DP) tractats de manera conservadora (CKD), trasplantament renal (TE) i grup control (C) que participen en l'estudi (mitjana ± DE)

P * - significació estadística per a les diferències entre els grups HD, PD i CKD, test de Fisher exacte TE i C per a variables qualitatives; per a variables quantitatives: ANOVA unidireccional i; P ** - significació estadística per a les diferències entre els grups HD, PD i CKD i test de Fisher exacte TE per a variables qualitatives per a variables quantitatives ANOVA unidireccional o; DM - nefropatia diabètica; HA - hipertensió; GIK - ronyó infamació glomerular; ADPKD - malaltia renal poliquística hereditària autosòmica dominant; NS: no hi ha diferències estadísticament significatives.

Taula 2 Característiques generals dels pacients en hemodiàlisi (B - abans de HD, A - després), de diàlisi peritoneal (DP) tractats de manera conservadora (CKD) abans i després del trasplantament renal (TE B i TE A) i del grup control (NK) que participen en el estudi (mitjana ± SD)

P * - significació estadística per a les diferències entre els grups HD A, HD B, PD i CKD, TE i C per a variables quantitatives - Kruskal Wallis ANOVA, ANOVA unidireccional o test t de Student P ** - significació estadística per a diferències entre HD A , HD B, PD i grups CKD i TE per a variables quantitatives ANOVA de Kruskal Wallis o anàlisi unidireccional d'ANOVA Kt / V - índex de diàlisi (fracció de volum V purificada per clearance K en el temps t) NS no es van trobar relacions estadísticament significatives

Anàlisi estadística Per avaluar les distribucions es va utilitzar el test KS (Kolmogorov-Smirnov), que en el cas d'algunes variables (l'activitat de les isoformes XD i XDO en PRP) mostrava una distribució no normal dels paràmetres. Es van utilitzar proves exactes de Fisher i Chi quadrat per analitzar dades quantitatives. Mitjançant la prova t de Student i l'anàlisi ANOVA per a sistemes univariants, es van avaluar les diferències entre variables associades (aparellades) i no relacionades (no aparellades) en el cas de variables amb una distribució normal. En el cas de variables amb distribucions no normals, es va realitzar l'anàlisi ANOVA de Kruskal-Wallis per avaluar les diferències entre els paràmetres, així com la prova no paramètrica de Mann-Whitney U per a dades no aparellades o Wilcoxon per a dades aparellades. Es va utilitzar un model de regressió múltiple lineal per determinar l'avaluació multifactorial de les relacions entre els paràmetres estudiats. L'anàlisi estadística dels resultats es va realitzar mitjançant Statistica 12 (StatSoft).