Efectes antienvelliment de Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Extracte de cultiu de Callus a través del perfilat del transcriptoma Part 2
May 06, 2022
Feu clic aoscar.xiao@wecistanche.comPer a més informació
2.9. Mesura de l'elasticitat de la pell
L'elasticitat de la pell es va analitzar utilitzant un Cutometer MPA 580 (Courage & Khazaka, Köln, Alemanya). En aquest equip es va muntar una sonda amb un diàmetre de 2 mm per a la prova. El mode 1 o el mode de tensió de temps es va utilitzar com a condició de mesura. A temps 2.0s i off-time 2.0s es van aplicar a la pressió negativa especificada de la condició de mode 1 (450 bar), i les mesures es van prendre tres vegades consecutives. Es van mesurar tres valors de paràmetres diferents, R2 (elasticitat bruta), R5 (elasticitat de la xarxa) i R7 (elasticitat biològica).
2.10. Mesura de la densitat dèrmica i el gruix de la pell
La densitat dèrmica i el gruix de la pell a la galta es van analitzar utilitzant Dermascan-C (Cortex Technology, Hadsund, Dinamarca), una màquina d'imatges d'alta resolució que utilitza ones supersòniques de 20 MHz, que és molt útil per observar de manera no invasiva els canvis en les capes internes de la pell. En el nostre estudi, es va utilitzar la imatge d'escaneig B.cistanche nzEn primer lloc, establim la velocitat de les ones supersòniques a 20 MHz, estenem la gelea de contacte per a la prova, col·loquem la sonda en un angle recte a la pell i la premem lleugerament per mesurar l'àrea de la galta. El gruix de la pell i la densitat dèrmica van ser calculats pel sistema de programari Dermascan-C.
Cistanche podria anti-envelliment
Les imatges de la cara van ser fotografiades amb idèntices condicions fotogràfiques, com la mateixa llum, càmera digital d'alta resolució i fotògraf. Després d'això, l'elevació facial a la cantonada de la boca es va examinar utilitzant l'anàlisi de Moire basat en les imatges de la cara. Seleccionem la cantonada de la boca, on destaca la flacciditat de la pell, com la zona de prova. Utilitzant les imatges, l'angle (R) entre la línia horitzontal i la línia de contorn dibuixada a la cantonada de la boca es va calcular mitjançant programari d'anàlisi d'imatges (ImagePro Plus, Rockville, MD, EUA).
2.11.Prova estadística
Vam realitzar una prova ANOVA unireccional per a la comparació entre les mostres de control i prova. Els resultats es van mostrar amb desviació mitjana i estàndard (Mitjana ± SEM). Els valors p p<0.05 (*),=""><0.01(*), and=""><0.001 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" declared="" statistically="" significant="" at="" the="" 0.05="" level.="" we="" used="" ibm="" spss="" statistics="" version="" 21.0="" (spss,="" chicago,="" il,="" usa)="" for="" the="" statistical="">
2.12. Preparació de biblioteques per a seqüenciació d'ARN-Seq i Next-Generation
Per a l'anàlisi del transcriptoma, les cèl·lules HaCaT a una densitat d'1×10° cèl·lules per pou es van incubar en una placa de sis pous durant 24 h. Després d'això, les cèl·lules queratinòcits humans (tractament) van ser tractades amb una concentració final de 1% d'extracte LACCE durant 24 h mentre que la condició simulada (control) es va tractar amb aigua estèril. Per a cada afecció es van recollir tres mostres biològiques diferents. L'ARN total es va extreure utilitzant un RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanya) d'acord amb les instruccions del fabricant. Després de l'extracció de RNAs totals de cada mostra, sis biblioteques diferents per a RNA-Seq van ser preparades pel TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit d'acord amb les instruccions del fabricant. Les sis biblioteques diferents van ser seqüenciades per l'il·luminació NovaSeq 6000 (Macrogen, Seül, Corea). Les dades obtingudes de la seqüència raw es van dipositar a la base de dades del National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (SRA) amb els següents números d'adhesió respectius: SRR9127735, SRR9127736, SRR9127737, SRR9127738, SRR9127733 i SRR9127734.
2.13. Mapatge, normalització i identificació de gens expressats diferencialment
Hem mapejat les lectures de seqüències raw de cada biblioteca a les transcripcions de referència humana versió GRCh38 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)utilitzant l'alineador BBMap amb paràmetres predeterminats(https://sourceforge.net/projects/bbmap/). Utilitzant el bbmap. sh, hem calculat fragments per kilobase million(FPKM) valors per a cada transcripció. Els valors FPKM obtinguts de cada condició van ser sotmesos a DEBrowser per a la normalització i anàlisi de gens expressats diferencialment(DEG)[19].cistanche mida del penisS'han suprimit els valors FPKM de menys d'1. Utilitzant EdgeR amb el mètode TMMnormalization i el tipus més exacte, vam identificar gens expressats diferencialment d'acord amb valors p ajustats de menys de 0,001 i log2 convertits en canvis de plec de més d'un.
2.14. Ontologia gènica (GO)Anàlisi d'enriquiment de termes
Per a l'anàlisi d'enriquiment de termes GO, hem identificat DEGs basats en valors p ajustats de menys de 0,05 i log2 convertits en canvis de plec de més de 0,5. Com a resultat, es van identificar 22 gens regulats i 13 down-regulats. Cada conjunt de gens va ser sotmès a anàlisis d'enriquiment utilitzant el programa GORILLA amb paràmetres predeterminats (http:/cbl-gorilla.cs.Technion.ac.il/)[20]. Hem seleccionat dues llistes no classificades de gens com el mode d'execució utilitzant 11.290 gens expressats com el conjunt de fons.
3. Resultats
3.1. Preparació del LACCE d'Edeluweiss
LACCE s'ha obtingut tal com es mostra a la figura 1. En resum, les llavors d'edelweiss van ser esterilitzades i germinades per primera vegada (Figura 1A). Callus va ser induït a partir de les fulles de llavors germinades (Figura 1B) i sotmès al cultiu cel·lular de suspensió (Figura 1C). Les cèl·lules de suspensió es van cultivar en bioreactors per a la producció a gran escala de LACCE (Figura 1D).cistanche en polsLes cèl·lules cultivades van ser recol·lectades i liofilitzades per a un estudi posterior (Figura 1E). LACCE es va preparar mitjançant extracció de calor. Les diferents concentracions de LACCE es van utilitzar per a múltiples atacs in vitro (0,1%,0,5%, i 1%), anàlisi in vivo(1%)i transcriptoma (1%)
Figura 1. Procediment experimental per obtenir l'extracte de cultiu Leontopodium Alpinum callus (LACCE) d'edelweiss callus mitjançant un bioreactor. Les llavors d'Edelweiss van ser esterilitzades i germinades. b) Callus va ser induït pel teixit de la fulla d'edelweiss. c) El callus induït era de cultiu de suspensió. (D) Les cèl·lules obtingudes es van cultivar en un bioreactor. Les cèl·lules de Call es van collir i liofilitzar en gran quantitat.
3.2. Avaluació in vitro de LACCE com a agent antienvelliment
Vam realitzar un assaig de 3-(4,5-dimetiltiltiltil-2-yl)-2,5-difenil de bromur de difenil (MTT) per observar la viabilitat cel·lular després del tractament amb LACCE. En aquest estudi, vam utilitzar cèl·lules immortalitzades en lloc de cèl·lules primàries de la pell humana per les següents raons. Les línies cel·lulars immortals tenen molts avantatges, incloent-hi ser fàcil de treballar, barat i un subministrament il·limitat de material.extracte de salsa cistancheA més, podem saltar-nos molts problemes ètics relacionats amb l'ús de teixits humans. A més, les línies cel·lulars immortalitzades s'utilitzen preferentment per a l'estudi de processos biològics bàsics com la seqüenciació d'ARN (ARN-Seq). Dues línies cel·lulars diferents, HaCaT i Detroit551, van ser tractades amb tres concentracions diferents de LACCE (0,1%,0,5%, i 1%). La viabilitat cel·lular tant de les cèl·lules HaCaT com detroit551 després del tractament amb LACCE va ser comparable a la del control (Figura 2). En detall, la viabilitat cel·lular de les cèl·lules HaCaT es va reduir lleugerament del 98,61% (0,1% LACCE) al 94,72% (1% LACCE) a mesura que s'incrementava la concentració de LACCE (Figura 2A). Per contra, la viabilitat cel·lular de les cèl·lules Detroit551 es va incrementar lleugerament del 95,99% (0,1% LACCE) al 99,95%(1% LACCE) a mesura que s'incrementava la concentració de LACCE (Figura 2B).
Figura 2. Avaluació in vitro de LACCE com a agent antienvelliment, incloent citotoxicitat i activitat antioxidant. Viabilitat cel·lular per a tres concentracions diferents(0,1%, 0,5%, i 1%) de LACCE en cèl·lules HaCaT(A) i Cèl·lules Detroib551(B)per assaig MTT. La barra grisa indica cèl·lules tractades amb aigua destil·lada. c) Les cèl·lules HaCaT van ser tractades amb peròxid d'hidrogen. La viabilitat cel·lular de tres concentracions diferents de LACCE es va mesurar mitjançant 3-(4,5-dimetiltiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazoli bromur (MTT)assaig. La N-acetilcisteïna (NAC) es va utilitzar com a control positiu. L'activitat antioxidant de diferents concentracions de LACCE va ser mesurada per l'assay DPPH. La vitamina C (Vit. C) es va utilitzar com a control positiu.*i** indiquen significació estadística amb valors p inferiors a 0,05 i 0,01, respectivament.tija cistancheLa morfologia cel·lular de cada mostra tractada amb peròxid d'hidrogen es va visualitzar amb tinció blava de metilè.
A més, vam dur a terme un assaig MTT induït per peròxid d'hidrogen (H2O2). En general, el peròxid d'hidrogen va causar una forta citotoxicitat (42,52% de la viabilitat cel·lular) en comparació amb el control negatiu, mentre que l'addició de cisteïna N-acetil (NAC), un antioxidant a la cèl·lula, va inhibir la citotoxicitat causada pel peròxid d'hidrogen (60,24% de la viabilitat cel·lular). A mesura que augmentava la concentració de LACCE, la viabilitat cel·lular es va incrementar del 45,54% (0,1% LACCE) al 60,37% (1% LACCE) en resposta al peròxid d'hidrogen (Figura 2C). En particular, la taxa d'inhibició de les espècies reactives d'oxigen (ROS) per a l'extracte de LACCE de l'1% era comparable a la de la NAC. A més, també es va observar morfologia cel·lular després de tacar-se amb blau metilè, mostrant un augment de la viabilitat cel·lular de LACCE (Figura 2E).
A continuació, vam realitzar un assay antioxidant utilitzant un 2,2-Difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) d'assaja de carrony radical (Figura 2D). L'activitat de carronyeig radical de DPPH es va incrementar del 2,85% (0,1% LACCE) al 20,47% (1% LACCE) a mesura que s'incrementava la concentració de l'extracte LACCE. En comparació amb la vitamina C (14,05%), tant les concentracions de LACCE del 0,1% com del 0,5% van mostrar una menor activitat de carronyeig radical, mentre que la concentració de l'1% de l'extracte LACCE va mostrar una major activitat de carronyeig radical.
3.3.In Avaluació Vitro de l'extracte lacce com a agent antiinflamatori
Per examinar l'efecte antiinflamatori de LACCE, es va quantificar l'expressió de dos gens marcadors inflamatoris que cox-2 i òxid nítric induïble (iNOS), respectivament, amb RT-PCR en temps real (Figura 3A, B). En general, la irradiació UVB regula l'expressió del gen COX-2 codificant una proteïna que indueix la inflamació (Figura 3A). En comparació amb el control negatiu, l'addició de LACCE a la cèl·lula HaCaT va suprimir significativament l'expressió del gen COX-2. No obstant això, no hi va haver diferències significatives entre les diferents concentracions de LACCE. En comparació amb el control positiu que conté dexametasona (Dex), el LACCE (0,1% a 1%) va mostrar un efecte antiinflamatori molt similar. L'expressió del gen iNOS va ser inhibida pel control positiu que contenia Dex i LACCE (Figura3B). A mesura que augmentava la concentració de l'extracte LACCE, l'expressió del gen iNOS es va reduir gradualment.
Figura 3. Avaluació in vitro de LACCE com a agents antiinflamatoris, hidratants i antiarrugues mitjançant RT-PCR en temps real. L'expressió relativa de COX2(A) i iNOS (B), dos gens marcadors inflamatoris, en diferents concentracions de LACCE en resposta a mostres tractades amb UVB es va mesurar mitjançant RT-PCR en temps real. La dexametasona (Dex) es va utilitzar com a control positiu. Les barres grises i blaves indiquen cèl·lules HaCaT sense i amb tractament UVB, respectivament. c) Expressió relativa d'AOP3, un marcador positiu per a l'efecte hidratant, en diferents concentracions de LACCE. (D) Expressió relativa de MMP-2, un marcador de creixement cel·lular, en diferents concentracions de LACCE en resposta a UVB. L'expressió de gens individuals es va normalitzar a l'expressió gènica GAPDH.* i* indiquen significació estadística amb valors p de menys de 0,05 i 0,01, respectivament.
Aquest article s'extreu de Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/gens11020230 www.mdpi.com/journal/genes
