Efectes antial·lèrgics i antiinflamatoris de la neferina sobre les cèl·lules RBL-2H3 Plus

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

3. Discussió

La patogènesi de la dermatitis atòpica (AD) no s'entén completament, però la malaltia està mediada per una resposta immune anormal de la immunoglobulina E (IgE) en la disfunció de la barrera cutània. Entre ells, els mastòcits (MC) poden causar malalties al·lèrgiques mediades per IgE, inclosa la MA. Quan s'activen els mastòcits, alliberen les seves partícules citoplasmàtiques unides a la membrana, donant lloc a l'alliberament de diverses molècules. Aquestes molècules tenen un paper important en la patogènesi de la MA i la defensa de l'hoste [27]. Com que la inhibició de l'activació o degranulació dels mastocits ajuda a regular diverses reaccions d'hipersensibilitat mediades per IgE, els mastocits són un dels objectius ideals per explorar fàrmacs antial·lèrgics. En el nostre estudi, els mastòcits es degranulen en resposta al compost 48/80 i al ionòfor de calci A23187, i anti-DNP/IgE més DNP/HSA. Vam trobar que la referència inhibia eficaçment l'efecte de desgranulació dels mastòcits, mostrant la seva reacció antial·lèrgica. A més, es va inhibir per referència l'augment del calci intracel·lular i l'activació de MAPK. A més, també es va reduir la infiltració de mastòcits de la pell causada per DNCB i el comportament de rascat causat pel compost 48/80. Per tant, el mecanisme de la dermatitis antiatòpica de la neferina té un efecte multiplicador sobre els queratinòcits i els mastòcits.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ells, els mastocitos (MC) poden causar malalties alèrgiques mediades per IgE, inclosa la EA. Quan els mastocitos s'activen, alliberen les seves partícules citoplàsmiques unides a la membrana, el que porta a l'alliberament d'una varietat de molècules. Aquestes moléculas juegan un paper important en la patogénesis de la EA i la defensa del huésped [27]. Debido a la inhibició de l'activació o desgranulació dels mastocits ajuda a regular diverses reaccions d'hipersensibilitat mitjanes per IgE, els mastocitos són un dels objectius ideals per explorar fármacos antialèrgics. En nuestro estudio, los mastocitos es desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Trobem que la referència va inhibir efectivament l'efecte de desgranulació dels mastocitos, mostrant la seva reacció antialèrgica. A més, l'augment de calcio intracelular i l'activació de MAPK van ser inhibits per referència. A més, també es va reduir la infiltració de mastocitos en la pell causada per DNCB i el comportament de rascat causat pel compost 48/80. Per lo tanto, el mecanisme de la dermatitis antiatòpica de la neferina té un efecte multiplicador sobre els queratinòcits i els mastocitos.

Feu clic aquí per saber-ne més

El citoplasma dels mastòcits que es troben als teixits està ple de partícules grans i denses de mediadors inflamatoris preformats [28]. El procés d'alliberament d'aquests mediadors dels grànuls secretors dels mastòcits s'anomena desgranulació. Com que la inhibició de la desgranulació dels mastòcits pot regular diverses reaccions d'hipersensibilitat mediades per IgE, els mastòcits són un dels objectius ideals per explorar fàrmacs antial·lèrgics [29,30]. Els nostres resultats mostren que la referència té un efecte molt bo sobre la desgranulació dels mastòcits independentment de l'ús d'antigen, estimulador del receptor o ionòfor. Això demostra que la referència és un potencial agent antial·lèrgic (figura 2).

Tots els grànuls preemmagatzemats, els mediadors recentment sintetitzats i fins i tot els grànuls i els seus components es poden utilitzar com a indicadors d'activació de MC [31]. A més, el mètode estàndard és la mesura de la concentració intracel·lular de Ca4t. La majoria dels secretagogs de MC (per exemple, antigen, compost 48/80) que s'han utilitzat generalment al laboratori van provocar un augment de la concentració intracel·lular de Ca2 més. De fet, l'augment de la concentració intracel·lular de Ca2 més també pot desencadenar la desgranulació de MC. Normalment, l'augment de Ca4t intracel·lular s'indueix activant la MC amb compostos, com ara la thapsigargina (específicament bloqueja Sarco/endoplasmic Ca2 més ATPasa, SERCA) i ionòfors (és a dir, ionomicina i A23187) [32,33]. Per tant, en l'activació de MC depenent de Ca2t, la mesura de l'afluència de Ca2t també es considera un mètode per determinar les condicions d'activació de MC. En la investigació de MC, Fura-2 s'utilitza àmpliament per a la determinació de Ca2 intracel·lular més canvis. En els nostres experiments, vam trobar que la intensitat de fluorescència dels mastòcits activats es va suprimir significativament després de ser tractats amb referència (figura 3). Informes anteriors van indicar que l'augment de la concentració intracel·lular de Ca4t estava d'acord amb l'alliberament d'histamina [34]. Per tant, deduïm que l'alliberament d'histamina també serà inhibit pel tractament de referència. Es requereixen més experiments per verificar aquesta hipòtesi.

Els mastòcits tenen sortides funcionals significativament diferents.dosificació de cistanche redditAquests inclouen la desgranulació, la formació de precursors d'àcid araquidònic, la quimiotaxi i la producció de citocines, i tots depenen dels senyals de calci fins a cert punt, independentment dels estimulants [32] La MC activada allibera citocines, que són els principals mediadors d'al·lèrgies i malalties inflamatòries [32] 35]. La producció de citocines pels mastòcits activats és el resultat de la inducció de la transcripció del gen de citocines en aquestes cèl·lules. L'estimulació dels mastòcits condueix a l'activació de NF-kB i AP-1 i a la producció de moltes citocines [36].Les vies de senyalització en cascada de MAPK tenen un paper essencial en la regulació de l'expressió de citocines. L'activació d'aquestes vies mitjançant l'activació de PKC per PI dóna lloc a l'activació de diversos gens, inclosos els gens de citocines inflamatòries com IL-1, IL-6 i TNF [37]. Els nostres estudis recents han demostrat que la referència pot inhibir les citocines alliberades per l'activació dels queratinòcits. Al mateix temps, també vam trobar que l'activació de la via de MAPK també serà inhibida pel tractament de referència [18]. En el nostre estudi actual, vam demostrar que la referència també pot reduir l'expressió de citocines mitjançant la inhibició de l'activació de MAPK als mastòcits (figures 4 i 5). L'activació de NFkB també es redueix a causa de la inhibició de l'activació de MAPK (figura 6).

Cistanche pot anti-envelliment

Diversos estudis han informat que una varietat de citocines en pacients amb MA estan elevades, donant lloc a una disfunció de la barrera cutània, incloses les citocines secretades pels queratinòcits i les citocines derivades de Th2-[38,39]. A més, s'informa que aquestes citocines secretades també poden regular a la baixa les expressions de proteïnes d'unió estreta (T]) i gens de diferenciació terminal, incloent la filagrina (FLG), la loricrina (LOR) i la involucrina (IVL) [39,40] ] L'expressió de (pro)filagrina disminueix a l'AD i s'associa inversament amb la triptasa MC i la IL-6[41]. IL-1 media la inflamació crònica en ratolins amb una barrera cutània deteriorada [35]. En un estudi anterior, es va informar que les expressions de FLG, IVL i LOR es van reduir després de l'aplicació de DNCB a la pell dorsal dels ratolins NC / Nga [42,43]. En el present estudi, les expressions de FLG, IVL i LOR es van reduir considerablement a la pell dorsal del grup control, la qual cosa va indicar que la barrera epidèrmica estava deteriorada. L'administració de referència va recuperar significativament les expressions disminuïdes de FLG, IVL i LOR després del tractament de DNCB, mentre que l'administració de referència va augmentar lleugerament les expressions de IVL i LOR en comparació amb el grup control (figura 8). Se sap que el compost 48/80 és un activador eficaç dels mastòcits de la pell. La resposta de la pell estimulada pel compost 48/80 pot induir un comportament de rascat alliberant histamina dels mastòcits [44]. La histamina alliberada dels mastòcits activats té un paper important en l'augment de la permeabilitat vascular causada pel compost 48/80. Durant la pruïja humana, també es considera la histamina alliberada dels mastòcits a través de diversos estímuls. s'ha convertit en un important mediador. Per tant, inhibir la desgranulació dels mastòcits és un pas important per regular l'alliberament d'histamina durant el comportament del rascat. En aquest compost d'estudi, 48/80 va provocar l'activació efectiva dels mastòcits de la pell. Tanmateix, el pretractament amb referència va reduir significativament el nivell de desgranulació dels mastòcits (figura 2).Beneficis de l'extracte de cistancheAquests resultats indiquen que l'efecte comportamental anti-rascada de referència pot ser degut a la reducció de la permeabilitat vascular mitjançant la regulació de la desgranulació dels mastòcits (figura 9).

En general, s'estableix que els pacients amb AD pateixen una disfunció de la barrera cutània, una inflamació de la pell o ambdues coses, per la qual cosa és difícil trobar un mètode de tractament adequat. Per tant, normalment es recomana la teràpia combinada. La nostra investigació recent ha demostrat que mai té funció immunomoduladora i capacitat de reparació de barreres. Per tant, una característica important de referència en el tractament de la MA en el futur és el manteniment de la funció de la pell i la millora de la hidratació de la pell i la reparació de la barrera. La referència també pot reduir el comportament de rascat induït per al·lèrgens i irritants. A més, la marxa atòpica és una malaltia relacionada amb un fenomen que es produeix i avança pas a pas. La dermatitis atòpica s'observa sovint en la infància. L'al·lèrgia alimentària sovint es produeix després dels 1-2anys d'edat. La rinitis al·lèrgica sovint pot començar abans i després de l'escola. Els símptomes de l'asma apareixen en diferents moments, però la majoria són després de la rinitis al·lèrgica. Després de la infància, la dermatitis atòpica i certes al·lèrgies alimentàries poden millorar o desaparèixer. La rinitis al·lèrgica i l'asma no són fàcils de curar[45,46]. Per tant, són fenòmens comòrbids en malalties. Els productes naturals que inclouen referències tenen el potencial terapèutic de la comorbilitat, i la seva eficàcia en malalties relacionades val la pena estudiar-la en el futur.

4. Materials i Mètodes

4.1.Cèl·lules de leucèmia basòfila de rata

Les cèl·lules de leucèmia basòfila de rata (RBL-2H3) van ser un regal de TLHwang, Universitat Chang Gung, Taoyuan, Taiwan. Les cèl·lules RBL-2H3 són mastòcits de la mucosa que s'utilitzen per estudiar la desgranulació induïda per l'antigen o els ionòfors de calci, el Ca4t intracel·lular i la transducció del senyal [29]. Les cèl·lules es van cultivar en EMEM que contenia un 10 per cent de FBS, amb penicil·lina i estreptomicina a 37 graus, 5 per cent de CO2. El medi de Dulbecco modificat (IM) d'Iscove i el sèrum boví fetal (FBS) es van comprar a Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, Nova York, NY, EUA).

4.2.Assaig MTT

Per mesurar s'utilitza l'anàlisi de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2bromur H-tetrazoli (MTT) l'activitat metabòlica de les cèl·lules. Les cèl·lules RBL-2H3 es van sembrar en una placa de cultiu 24-pou a 5 × 10 més / pou. Després de 24 h de tractament amb fàrmacs, es van afegir 30 μL de MTI per pou i es van col·locar en una incubadora cel·lular de 37 graus durant 2-4 h, després es van dissoldre els cristalls de formazan morats amb DMSO. Es va utilitzar un lector ELISA per mesurar la intensitat de l'absorbància a una longitud d'ona de 550 nm com a prova de viabilitat cel·lular.

4.3.Mesura del nivell de Ca2 més intracel·lular

[Ca2t] Em van mesurar amb fura-2 tal com es va descriure anteriorment[47]. Les cèl·lules RBL-2H3 es van tornar a suspendre en IMDM que contenia 5 uM Fura 2-AM i 1,2 mM CaClz a 37 graus per 30 min. Després de la càrrega de Fura-2, els queratinòcits es van sedimentar i es van tornar a suspendre en DMEM fresc. Es va transferir una alíquota (2 ml) a una cubeta agitada que contenia 1,2 mM de fluorescència de CaClz.Fura-2-Ca a les longituds d'ona d'excitació de 340 i 380 nm (longitud d'ona d'emissió, 505 nm) en un PerkinElmer LS{{19} }} espectrofluoròmetre (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Les dades es van registrar a intervals de 5 segons[47].

4.4. Reacció en cadena de polímers quantitatius (qPCR)

Les cèl·lules RBL{{0}}H3 es van plantar en un plat de cultiu de 3,5 cm. Després que les cèl·lules van créixer al 90 per cent, les cèl·lules es van cultivar en estat estàtic durant 24 hores. Després de tractar prèviament les cèl·lules amb referència durant 20 min, es van estimular amb TNF-a/IFN-y durant 1 o 24 h, respectivament. Les cèl·lules es van raspar, es van centrifugar (16,000×g, 10 min, 4 graus) i es va extreure el sobrenedant. L'ARN es va purificar mitjançant un kit d'aïllament d'ARN total (GeneDirex@, Vegas, NV, EUA). Segons el procediment operatiu del script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD), els reactius es van afegir en ordre i es van operar segons les condicions indicades per convertir l'ARN en cDNA. A més, es va utilitzar PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Es van afegir i barrejar uniformement un total de 7,5 uL de ddH20,2 uL d'ADNc, 0,25 μLof d'encebadors directes i inversos i 10 uL de SYBR GREEN. Les seqüències d'imprimació es mostren a les taules 1 i 2. A continuació, es va quantificar l'ARN mitjançant el sistema de PCR en temps real ABI StepOnePlusTM.

4.5. Assaig Western Blot

El Western blotting s'utilitza per analitzar els canvis de diverses proteïnes a les cèl·lules. Les cèl·lules RBL{{0}}H3 es van sembrar en un plat de cultiu de 3,5 cm. Després que les cèl·lules van créixer fins al 90 per cent i es van morir de fam durant 24 h, es van tractar prèviament amb referència durant 20 min, i després es van estimular amb TNF-a o IFN-y durant 30 min o 1 h, respectivament. Després del raspat, es van polveritzar per ultrasons i es van centrifugar (13.200 rpm, 10 min, 4 graus). Després de la centrifugació, es va prendre el sobrenedant i es va quantificar la proteïna amb un kit d'assaig de proteïnes Pierce (Pierce, Rockford, IL, EUA). Es va electroforitzar en gel de poliacrilamida SDS al 10% i després es va electroporar amb membrana de PVDF. Un cop finalitzada la transferència, la membrana de PVDF es va posar en una solució TBS-T (solució salina tamponada amb Tris / 0, 05 per cent de tween 20) que contenia un 5 per cent de llet desnatada en pols i es va sacsejar durant 1 h per evitar una unió no específica. A continuació, es va utilitzar TBS-T per rentar-se 3 vegades, 10 minuts cada vegada. A continuació, es van afegir anticossos primaris (dilució 1:1000) i es van col·locar a 4 graus durant la nit i després es van rentar 3 vegades amb TBS-T cada 10 min. Després d'afegir anticossos secundaris (diluïts 1:1000) durant 1 h, la membrana de PVDF es va rentar 3 vegades amb TBS-T durant 10 min cada vegada. Finalment, es va afegir el revelador i la membrana es va col·locar en un sistema d'extracció de luminescència química (BIOSTEP Celvin") per al rodatge.

4.6.Dinitrochlorobenzene (2,4-Dinitrochloroben2ene, DNCB)Inflamació de la pell semblant a la dermatitis atòpica induïda en ratolins

En primer lloc, els ratolins es van dividir en quatre grups: grup control, grup DNCB (grup negatiu), referència (3 mg/kg i 10 mg/kg) amb el grup DNCB i dexametasona (0,2 mg/kg) amb Grup DNCB (grup positiu). La dexametasona és una hormona corticosteroide que pot reduir la inflor i les reaccions al·lèrgiques. En aquest experiment in vivo, tant la referència com la dexametasona es van dissoldre en DMSO, mentre que el DNCB es va dissoldre en un 75 per cent d'etanol per xoc ultrasònic. El primer es va administrar per injecció intraperitoneal, i per al segon es van aplicar 100 µL a la pell posterior i 20 µL a l'orella dreta. Tres dies abans de l'experiment, els ratolins van ser anestesiats i es va eliminar el pèl posterior i es va incrustar un petit imant de mesura (SCT-MAG-TF) a la part posterior dels peus posteriors del ratolí.cistanche genghis khanDesprés de descansar durant tres dies, es va confirmar que els ratolins estaven en bon estat físic i la pell de la zona de depilació dorsal era normal i es va iniciar l'experiment. Durant l'experiment es van fer fotografies per registrar els canvis d'aspecte de la pell. La primera etapa ({{0}} dies) va ser el període de dermatitis atòpica al·lèrgica. Després de mesurar els valors bàsics dels ratolins del grup DNCB, el grup experimental de referència (3 i 10 mg/kg) i DNCB, i el grup experimental de dexametasona 0,2 mg/kg i DNCB, l'1 per cent de DNCB es va aplicar uniformement a la pell posterior i orella dreta. El cinquè dia es van injectar per via intraperitoneal els fàrmacs de referència i la dexametasona. La segona etapa (del dia 5 al dia 14) va ser la reinducció de la dermatitis atòpica.prolongació de la vida del cistancheEn els 3 grups experimentals, el 0,5 per cent de DNCB es va untar uniformement a la pell posterior i a l'orella dreta dels ratolins. L'endemà es van fer i gravar els valors fisiològics de la pell i les fotografies. Després que els ratolins fossin eutanasiats amb diòxid de carboni (CO2) excessiu el dia 15, es va eliminar el teixit de la pell dorsal per a una anàlisi experimental posterior.

4.7.Compost 48/80-Comportament de rascat induït en ratolins BALB/c

Es va tallar el pèl de la pell a la part posterior del ratolí i es van injectar 20 μL de solució de compost 48/80 per via intracutània. Els ratolins de control van rebre injeccions de solució salina. Immediatament després de la injecció, l'animal es va col·locar en una gàbia d'observació (diàmetre 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tòquio, Japó) i es va detectar i avaluar automàticament i objectivament el comportament de rascat del ratolí. El comportament del rascat es va mesurar durant 60 min. MicroAct utilitza els següents paràmetres d'anàlisi per detectar ones corresponents al comportament de rascat continu dels ratolins: llindar, 0,05 V; bretxa d'esdeveniments, 0,05 s; durada mínima, 0,25 s; freqüència màxima, 30 Hz; freqüència mínima, 5 Hz. 4.8.Anàlisi estadística

Per a l'anàlisi estadística es va utilitzar el programari Sigma-Plot (versió 10.0).cistanche nzLes dades s'expressen com a mitjana ± SEM, amb (*) i (#) com a notes. La significació estadística de les dades es va analitzar mitjançant valors de Student t-tests.p no aparellats i de dues cues inferiors a 0.05 i 0,01 es van considerar significatius.

5. Conclusions

En aquest estudi, vam determinar que la referència inhibeix eficaçment la desgranulació dels mastòcits i redueix l'expressió de citocines proinflamatòries, que poden reduir els símptomes semblants a la dermatitis atòpica, restaurar la barrera cutània i reduir el rascat de la pell. A més, hem demostrat que la referència no només pot actuar sobre els queratinòcits de la pell sinó que també afecta l'activació dels mastòcits. Té més potencial d'aplicació en malalties al·lèrgiques i inflamatòries de la pell.

Aquest article està extret de Int. J. Mol. Ciència. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms