Atenuació de la uveïtis autoimmune experimental en rates de Lewis per betaïna

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

La uveïtis autoimmune experimental (EAU) és un model animal d'uveïtis autoimmune humana que es caracteritza per la infiltració de cèl·lules T autoimmunes amb augments concurrents de citocines proinflamatòries i espècies reactives d'oxigen. Aquest estudi tenia com a objectiu avaluar si la betaïna regula la progressió de l'EAU en rates Lewis. L'EAU es va induir mitjançant la immunització amb la proteïna d'unió a retinoides interfotoreceptors (IRBP) i l'administració oral d'un vehicle o betaïna (100 mg/kg) durant 9 dies consecutius. Es van prendre mostres de melsa, sang i retines de les rates experimentals en el moment del sacrifici i es van utilitzar per a l'assaig de proliferació de cèl·lules T, anàlisi serològica, reacció en cadena de la polimerasa en temps real i immunohistoquímica. L'assaig de proliferació de cèl·lules T va revelar que la betaïna tenia poc efecte sobre la proliferació de cèl·lules T esplèniques contra l'antigen IRBP en un assaig in vitro el dia 9 després de la immunització. L'anàlisi serològica va mostrar que el nivell de superòxid dismutasa sèrica va augmentar en el grup tractat amb betaïna en comparació amb el del grup tractat amb vehicle.extracte de cistanche tubulosaL'efecte antiinflamatori de la betaïna es va confirmar per la baixada de molècules relacionades amb la inflamació, inclosa la molècula d'adhesió de cèl·lules vasculars I i la interleucina -1 a les retines de rates amb EAU. Les troballes histopatològiques van coincidir amb les de la immunohistoquímica de la molècula adaptadora d'unió de calci ionitzat, verificant a més que la inflamació a la retina i els cossos ciliars es va suprimir significativament en el grup tractat amb betaïna en comparació amb el grup tractat amb vehicle. Els resultats del present estudi suggereixen que la betaïna està implicada en la mitigació de l'EAU mitjançant activitats anti-oxidació i antiinflamatòries.

Feu clic aquí per saber-ne més

Paraules clau:Antiinflamació, Antioxidació, Betaïna, Uveïtis autoimmune experimental, Retina

Introducció

La localització de cèl·lules T autoreactives i la infiltració de cèl·lules inflamatòries, com els monòcits, desencadenen uveïtis i retinitis a l'EAU [6]. La retina està danyada per la inflamació amb l'activació de cèl·lules glials que pateixen estrès oxidatiu[7].

La betaïna, també anomenada trimetilglicina (CH: NO:), és una substància natural alcaloide i no tòxica de Fructus Lycia i una substància antioxidant representativa [8]. La betaïna millora la inflamació relacionada amb l'edat a les rates mitjançant la implicació del factor nuclear kB mitjançant la cinasa inductora del factor nuclear / I kappa B quinasa i proteïnes cinases activades per mitògens [9], malaltia cardiovascular humana suprimint les citocines inflamatòries, inclosa la interleucina (IL) {{ 6}} i el factor de necrosi tumoral-a (TNF-a) [10] i la tumorigènesi del còlon induïda per sulfat de dextrano de sodi [11].ressenyes de cistanche tubulosa,A més, la betaïna va prevenir l'angiogènesi/neovascularització patològica en rates amb retinitis diabètica [12] i va protegir les cèl·lules ganglionars de la retina per augmentar l'agudesa visual en un model animal de glaucoma [13]. Tanmateix, es coneix poc sobre els mecanismes precisos subjacents als efectes de la betaïna en la uveïtis.

En aquest estudi, es va avaluar l'eficàcia de la betaïna per alleujar l'EAU. Es va investigar l'efecte antiinflamatori de la betaïna a l'EAU a partir de l'examen histopatològic i les mesures de citocines. A més, es va avaluar el mecanisme específic de la betaïna com a antioxidant en rates amb EAU.

MATERIALS I MÈTODES

Animals

Els dos sexes de rates Lewis (de 7 a 9 setmanes; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Corea) es van allotjar a les nostres instal·lacions en condicions de laboratori (cicle de llum/foscor 12- h, temperatura de 23 ± 2 graus). Tots els procediments experimentals es van realitzar seguint les directrius per a la cura i l'ús d'animals de laboratori de la Universitat Nacional de Jeju (número de permís: 2020-0012). Tots els protocols d'animals s'ajustaven a les lleis internacionals i a les polítiques dels NIH, inclosa la cura i l'ús d'animals de laboratori (publicació NIH núm. 85-23, 1985, revisada el 1996).

Inducció d'EAU

Les rates es van immunitzar amb 200 ul d'una emulsió mixta composta per un volum igual de proteïna d'unió a retinoides interfotoreceptors bovins (IRBP) (I mg/ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Komabiotech, Seül, República de Corea) i l'adjuvant complet de Freund (CFA). )complementat amb mi mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, EUA) a les coixinets dels peus de les extremitats posteriors.

Grups experimentals

Per avaluar els efectes de la betaïna (Fig. 1A) sobre l'EAU, es van designar quatre grups experimentals de la següent manera: control normal (n=8); Control CFA (n=8);EAU més Vehicle (n=8);i EAU més Betaïna (n{=8). La dosi en el tractament per provar l'efecte terapèutic de la betaïna (1 Es va seleccionar 0 mg/kg de pes corporal/dia, B2629, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a partir d'un estudi anterior [14]. Les rates van ser tractades oralment 9 amb betaïna des del dia 0 després de la immunització fins al dia 9 després de la immunització.

Preparació de teixits

Les rates es van sacrificar sota anestèsia profunda mitjançant inhalació de gas CO2 el dia 9 després de la immunització.cistanche Regne UnitEls teixits per a l'examen histopatològic es van incrustar en cera de parafina i es van seccionar

amb un micròtom (RM 2135; Leica, Nussloch, Alemanya) fins a un gruix de 5 um i tenyit amb hematoxilina i eosina. La sang i les retines es van emmagatzemar a -80 graus per a l'anàlisi del sèrum i l'anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real.

Assaig de proliferació de cèl·lules T

Les cèl·lules mononuclears de melsa dels animals de cada grup es van dissociar i es van suspendre tal com es va descriure al nostre estudi anterior [15]. A continuació, es va afegir 10 ug/ml IRBP (concentració final) als pous. Després de 48 h d'estimulació amb IRBP, les cèl·lules es van incubar en 1 μCi de 'H-metil timidina (activitat específica 42 Ci/mmol); Amersham, Arlington Heights, IL, EUA) durant 18 h. A continuació, es van recollir les cèl·lules per mesurar la incorporació de timidina.

Cistanche pot anti-envelliment

Anàlisi serològica

Les rates es van sacrificar en la data del mostreig i es va recollir sang a través del cor. Les mostres de sang sencera es van separar en sèrum i cèl·lules sanguínies mitjançant una centrífuga (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, República de Corea). L'activitat de la superòxid dismutasa (SOD) al sèrum es va avaluar mitjançant un kit SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, Regne Unit).

Immunohistoquímica

La immunohistoquímica es va realitzar utilitzant el mateix protocol que el descrit en el nostre estudi anterior [16]. Els anticossos primaris inclouen la molècula adaptadora d'unió de calci ionitzada (Ibal) (1:1, 000;019-19741, Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Osaka, Japó), CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,Regne Unit) i glutamina sintetasa (GS)(1:5,000;MAB302,Chemicon In -ternational, Temecula, CA, EUA) es van utilitzar com a marcador per a microg-lia, macròfag i cèl·lula de Müller, respectivament.

PCR en temps real

L'ARN total dels globus oculars de tots els grups (n =5 per grup) es va aïllar amb el reactiu d'aïllament d'ARN TRIzol (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EUA) i l'ADNc es va preparar mitjançant CellScript M All-in -Una mescla mestra de síntesi d'ADNc estàndard 5X (CellSafe, Gyeonggi-do, República de Corea). La informació del primer es mostra a la taula 1. La PCR es va realitzar amb un ciclador MIC (BMS, Queensland, Austràlia) utilitzant 2x SYBR Green (PhileKorea, Seül, República de Corea) i el programa següent: 55 cicles de desnaturalització (5 s, 95). grau), recuit (20 s, 60 graus) i extensió (10 s, 72 graus).

Anàlisi Western blot

L'anàlisi de Western blot es va realitzar mitjançant el mateix protocol que el descrit al nostre estudi anterior [16].cistanche wirkungEls anticossos primaris inclouen la proteïna 1 associada a ECH similar a Kelch (Keap1) (1:1, 000; abl19403, abcam, MA, EUA) i el factor eritroide-2- relacionat amb el factor nuclear 2 (Nrf2 )(1:1,000;sc-722,Santa Cruz,CA,EUA).

Anàlisi estadística

Totes les mesures es presenten com la mitjana de tres experiments independents. Tots els valors es presenten com a error estàndard mitjà de la mitjana (SEM). Els resultats es van analitzar mitjançant una anàlisi unidireccional de la variància seguida de la prova posthoc Student-Newman-Keuls per a comparacions múltiples. Un valor p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

RESULTATS

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0,05 vs. EAU més vehicle). Aquestes dades indiquen que la betaïna no estava implicada amb les cèl·lules T específiques d'IRBP ni amb la seva autorreactivitat.

La betaïna va augmentar els nivells sèrics de SOD a l'EAU

Es va avaluar el dany oxidatiu al sèrum, utilitzant SOD com a marcador de modificació oxidativa. No es va observar cap diferència significativa entre els grups normal i CFA. L'activitat SOD va disminuir significativament al grup EAU més Vehicle, en comparació amb els nivells dels grups de control normal i CFA. El tractament amb betaïna va restablir significativament el nivell d'activitat SOD al dels grups control i CFA normals (Fig. 2). Aquest resultat indica que el tractament amb betaïna va suprimir l'estrès oxidatiu en rates amb EAU.

La betaïna va reduir la infiltració de cèl·lules positives Ibal als cossos ciliars i a les retines de rates induïdes per EAU.

El cos ciliar és el principal lloc d'infiltració de cèl·lules inflamatòries a causa de l'abundància de vasos sanguinis[18]. Només es van detectar algunes cèl·lules de tipus rodó als cossos ciliars en els grups normal i CFA (Fig. 3A, 3B), mentre que la infiltració d'algunes cèl·lules de tipus rodó es va confirmar en els grups induïts per EAU (fletxes a la Fig. 3C). ,3D). Els grups normals (Fig.3E) i CFA (Fig.3F) van mostrar constantment resultats similars als observats per a la immunoreactivitat d'Ibal. La immunoreactivitat positiva per Ibal va augmentar als grups EAU més vehicle i EAU més betaïna (punts de fletxa a la figura 3G, 3H). Tanmateix, el nombre de cèl·lules positives per Ibal va disminuir significativament al grup EAU més betaïna en comparació amb el grup EAU més vehicle (Fig. 3I). També vam analitzar la localització de l'EDI com un enfocament addicional per avaluar la ubicació precisa de la infiltració de cèl·lules inflamatòries al cos ciliar. Les cèl·lules positives ED1-poques vegades es van detectar a la normal (Fig. 3G) i CFA (Fig. 3K). ) grups. Per contra, es van detectar nombroses cèl·lules positives ED1- als grups EAU més vehicle i EAU més betaïna (punts de fletxa dobles a la figura 3L, 3M).bioflavonoides cítricsUna anàlisi semicuantitativa del nombre de cèl·lules ED1-positives va confirmar que el tractament amb betaïna va suprimir la infiltració de cèl·lules inflamatòries als cossos ciliars de rates induïdes per EAU.

A continuació, vam investigar els canvis histopatològics a la retina (Fig. 4). Es van detectar algunes cèl·lules inflamatòries a les retines amb EAU, però no a les retines de rata normals i CFA (Fig. 4A ~ 4D). Les lesions es van puntuar histopatològicament segons la gravetat de l'EAU [17], revelant un alleujament de la inflamació de la retina (Fig. 4E). Es va confirmar l'activació de cèl·lules microglials i de Müller que indica inflamació de la retina en funció de la immunoreactivitat global (Fig. 4F ~ 4I) i GS (Fig. 4K ~ 4N), respectivament. La localització d'Ibal a la microglia era molt rara en els grups normal i CFA (puntes de fletxa a la figura 4F, 4G, respectivament). L'activació de la microglia es va inhibir en rates EAU (puntes de fletxa a la Fig. 4H) pel tractament amb betaïna (Fig. 4I, 4J). El resultat d'immunoreactivitat GS-positiu va ser similar al de global a la retina (Fig. 4K ~ 4N). Les cèl·lules de Müller activades del grup EAU plus Vehicle tenien nivells d'immunoreactivitat GS més baixos (Fig. 40).

La betaïna va suprimir la molècula d'adhesió i els mediadors proinflamatoris a l'EAU

A continuació, vam examinar l'expressió de molècules d'adhesió mitjançant PCR en temps real (Fig. 5A). Es va observar una forta disminució del nivell d'ARNm de la molècula d'adhesió de cèl·lules vasculars 1 (VCAM1) al grup EAU més Betaïna (p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

La betaïna va regular els enzims antioxidants catalasa (CAT) i SODinEAU

L'estudi dels nivells de dany oxidatiu al sèrum ens va impulsar a investigar l'estat de resposta antioxidant dels enzims antioxidants, inclosos CAT, SOD1, SOD2 i SOD3 (Fig.5C). Vam observar nivells d'expressió significativament regulats de CAT, SOD1, SOD2 i SOD3 als globus oculars del grup EAU més Betaïna en comparació amb el grup EAU més Vehicle.

La betaïna va activar la via Keapl-Nrf2

Per donar suport a l'efecte antioxidant de la betaïna, es va examinar la via Keapl-Nrf2 (Fig. 6). Els nivells de proteïnes de Keapl (0,75±0,05 canvis de vegades, p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

en comparació amb el control normal. D'altra banda, Keapl i Nrf2 van mostrar canvis de plec 1,46±0.00 o 1,13±0,34 canvis de vegades als del grup EAU més Vehide (pàg.<0.01 and=""><0.001,>

DISCUSSIÓ

Aquest és el primer estudi que informa que la betaïna mitiga la progressió de la patogènesi de l'EAU mitjançant efectes antiinflamatoris i antioxidants, però no suprimint la proliferació de cèl·lules T (Il·lustració esquemàtica a la figura 7).

Es creu que l'efecte regulador de la betaïna en malalties autoimmunes, tal com s'evidencia amb EAU, un prototip de malaltia autoimmune, es deu a la reducció de l'estrès oxidatiu i als mediadors proinflamatoris, però no a la proliferació de cèl·lules T, per part de la betaïna [19]. De la mateixa manera, el present estudi va revelar que la betaïna va tenir poc efecte sobre la proliferació de cèl·lules T i el perfil de citocines en el sobrenedant de cultiu en un model d'EAU, cosa que suggereix que la betaïna no influeix en la resposta immune de la proliferació de cèl·lules T autoimmunes en EAU. L'úvea és un òrgan diana a l'EAU. L'úvea i la retina són òrgans aïllats immunològicament sense limfàtics [20]. Les cèl·lules T autoimmunes de l'EAU són envaïdes a través d'una branca de les artèries ciliar i oftàlmica [21]. L'estrès oxidatiu és un senyal crític per a la progressió de la resposta inflamatòria i l'augment de les espècies reactives d'oxigen causa disfunció endotelial i lesions tissulars [22]. Les cèl·lules endotelials alterades condueixen a la promoció del pas de cèl·lules inflamatòries i molècules inflamatòries [22]. Els mediadors inflamatoris i les cèl·lules de l'úvea es desencadenen a les cèl·lules epitelials pigmentàries de la retina, que pertorben les unions entre les cèl·lules del bastonet i del con i les cèl·lules epitelials pigmentades, donant lloc a un despreniment de la retina [23]. El cos ciliar és un lloc d'entrada per a la inflamació ocular. La inflamació típica de la retina està implicada en l'activació de la microglia resident i la infiltració de cèl·lules inflamatòries a causa de la ruptura de la barrera sang-retina [24]. Sota les condicions neuropatològiques, inclosos els tumors cerebrals [25], l'axotomia [26] i la infecció per virus [27], Ibal va distingir els macròfags i la micròglia activats. A més, la microglia resident activada està implicada en els canvis patològics que es produeixen en les malalties degeneratives de la retina i alliberen mediadors inflamatoris que agreugen el procés de la malaltia [28]. Aquests resultats suggereixen que la betaïna exerceix efectes antiinflamatoris en l'úvea i el cos ciliar, els principals objectius de l'EAU, i pot reduir l'estrès oxidatiu en el sèrum. No obstant això, el mecanisme precís encara està per estudiar.

La microglia activada és la principal font de citocines proinflamatòries en condicions degeneratives de la retina [29]. Les citocines proinflamatòries, incloses les IL i el TNF, estan fortament associades amb la inflamació ocular [30] i la retinitis [6,29]. A més de la microglia, les cèl·lules de Müller s'activen sota tots els esdeveniments patològics que es produeixen a la retina [31]. Les cèl·lules de Müller activades estan implicades en l'efecte neuroinflamatori a la retina mitjançant la síntesi i l'alliberament de molècules relacionades amb la inflamació [31]. Postulem que la betaïna mitiga la resposta inflamatòria en rates induïdes per EAU suprimint l'activació de la microglia i les cèl·lules de Müller. La regulació a l'alça de VCAMl està molt implicada en la infiltració de cèl·lules inflamatòries [32].VCAMl s'accelera als fagòcits CD4 Tlym a través de la conversa creuada amb l'antigen tardà-4[3].A més, Serpina3n, un enzim que inicia inflamació [34], s'ha detectat en cèl·lules de Müller, astròcits i epitelis pigmentaris de la retina de retines danyades per la llum [35] i té nivells significativament variables a la retina de Nrl'mouse amb cèl·lules de con deteriorades [36]. Serpina3n augmenta a l'EAU. rates amb inflamació de la retina severa però van disminuir significativament en el grup EAU tractat amb betaïna. S'ha informat una troballa similar per a l'esquizofrènia amb neuroinflamació [34], ja que la Serpina3n murina és un ortòleg de la Serpina3 humana [37]. A més, es va observar un augment de IL-1 en lesions retinàries induïdes per alta fructosa [38]. Postulem que l'efecte antiinflamatori de la betaïna està associat amb la regulació a la baixa de VCAM1, Serpina3n i IL-1 en rates induïdes per EAU. La via Keep-Nrf2 s'utilitza per controlar l'estrès oxidatiu [39]. La betaïna s'havia conegut com una molècula antioxidant, que estava associada amb la via Keapl-Nrf2 en el model de lesió hepàtica aguda induïda per acetaminofè [40]. A més, el perfil de l'expressió gènica hepàtica es va realitzar després del tractament amb 3H-1,2-ditiol-3-tion, tenint el paper de millorar la desintoxicació dels carcinògens i protegir contra la neoplàsia [4]. El resultat d'aquest perfil va revelar que el gen inducible per tiones,2-ditiol-3-depenent de nrf2-nrf-1 regulat per Keap1-Nrf2, inclòs AF033381, com la betaïna homocisteïna metil transferasa, es va incrementar i va implicar la desintoxicació i l'antioxidació [41]. La resposta inflamatòria a l'EAU va ser induïda per la infiltració de cèl·lules inflamatòries, com les cèl·lules T i els macròfags [42], i la producció d'estrès oxidatiu, especialment en els mitocondris fotoreceptors de la fase inicial [43]. Segons aquests resultats, el tractament amb betaïna era un candidat per alleujar el dany tissular induït per EAU mitjançant la modulació de la via Keap1-Nrf2, com a via clau per a la regulació de l'estrès oxidatiu.

L'efecte antioxidant de la betaïna s'ha avaluat àmpliament en models de lesions induïdes per radicals [44]. En el cervell de dany oxidatiu induït per levodopa, la betaïna es va millorar als nivells de CAT i SOD, que són enzims antioxidants representatius [4]. SOD1, SOD2 i SOD3 s'activen per diferents mecanismes i es localitzen al citoplasma, els mitocondris i la matriu extracel·lular, respectivament [45]. La betaïna, com a molècula antioxidant, està implicada en la reducció del dany oxidatiu [46]. La reducció de l'estrès oxidatiu es va estendre per resoldre la inflamació, indicada pels macròfags/micròglia Ibal-positius en moltes malalties, inclosa la malaltia d'Alzheimer, la malaltia de Parkinson i l'esclerosi múltiple [47]. El tractament amb betaïna es va regular als nivells d'ARNm del marcador d'estrès oxidatiu, en comparació amb els del grup EAU plus Vehicle. Aquest resultat implica que el tractament amb betaïna va reduir l'estrès oxidatiu al sistema circulatori sense interferir amb la proliferació de cèl·lules T en els òrgans immunitaris del model EAU de rata.

Col·lectivament, el present estudi suggereix que la betaïna pot mitigar la inflamació a les retines i els cossos ciliars de rates induïdes per EAU, possiblement mitjançant mecanismes anti-oxidació i antiinflamació.

Aquest article està extret de https://doi.org/10.5607/en21011