Resum.L'arbutina és un compost natural extret de diverses plantes, incloses les fulles d'ussa, que exerceix múltiples efectes com el blanqueig de la pell i propietats antiinflamatòries i protectores de l'estrès oxidatiu. Tanmateix, els efectes de l'arbutina sobre els osteoblasts segueixen sent desconeguts. El present estudi pretenia investigar la funció i els mecanismes de l'arbutina en la proliferació i diferenciació de cèl·lules precursores d'osteoblast de ratolí MC3T3-E1 in vitro. La proliferació de cèl·lules MC3T3-E1 tractades amb arbutina es va avaluar mitjançant un assaig de Cell Counting Kit-8 i un assaig d'etiquetatge d'5-etinil{-2'-desoxiuridina. A més, es va examinar el cicle cel·lular i l'apoptosi mitjançant l'anàlisi de citometria de flux. Els efectes de l'arbutina sobre la diferenciació dels osteoblasts es van investigar mitjançant la tinció de fosfatasa alcalina (ALP) i examinant els nivells d'expressió d'ARNm de la cadena de col·lagen tipus I 1 (COL1A1), la proteïna carboxiglutamat òssia (BGLAP) i el factor de transcripció Sp7 (SP7). Per investigar més el mecanisme molecular subjacent a la funció de l'arbutina en la promoció de l'osteogènesi, es van analitzar els nivells d'ARNm i d'expressió de proteïnes del factor de transcripció 2 relacionat amb runt (RUNX2) i -catenina mitjançant una reacció en cadena de la polimerasa quantitativa de transcripció inversa i western blotting. L'arbutina va promoure significativament la proliferació cel·lular MC3T3-E1 i va augmentar la proporció de cèl·lules en la fase S. El tractament amb arbutina va augmentar l'activitat ALP i els nivells d'expressió d'ARNm de COL1A1, BGLAP i SP7 a les cèl·lules MC3T3-E1. A més, els nivells d'expressió de proteïnes i ARNm de RUNX2 i -catenina van augmentar significativament després del tractament amb arbutina. Col·lectivament, les troballes actuals van suggerir que l'arbutina va ser capaç de promoure la proliferació i diferenciació de cèl·lules MC3T3-E1 mitjançant la via de senyalització Wnt/-catenina.
Segons estudis rellevants,cistancheés una herba comuna que es coneix com "l'herba miracle que allarga la vida". El seu component principal éscistanòsid, que té diversos efectes com araantioxidant, antiinflamatori, i promoció de la funció immune. El mecanisme entre cistanche iblanqueig de la pellrau en l'efecte antioxidant dels glucòsids de cistanche. La melanina a la pell humana es produeix per l'oxidació de la tirosina catalitzada pertirosinasa, i la reacció d'oxidació requereix la participació d'oxigen, de manera que els radicals lliures d'oxigen del cos esdevenen un factor important que afecta la producció de melanina. Cistanche conté cistanòsid, que és un antioxidant i pot reduir la generació de radicals lliures al cos, per tantinhibint la producció de melanina.
Per a més informació:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Introducció
L'osteoporosi és un problema de salut i socioeconòmic caracteritzat per una massa òssia baixa i una microarquitectura òssia deteriorada, que augmenta el risc de fractures per fragilitat (1,2). A la Unió Europea (UE), la taxa de prevalença d'osteoporosi en individus de 50 anys o més es va estimar en el 6,6 i el 22,1% per a homes i dones el 2010, respectivament. Econòmicament, el cost total de l'osteoporosi per a la UE va ser d'aproximadament 37.400 milions d'euros el 2010 (3). A causa de l'augment de l'esperança de vida i de l'envelliment de la població, un nombre creixent de persones poden patir fractures osteoporòtiques en el futur (4). L'osteoporosi és causada per un desequilibri entre la formació òssia, mediada pels osteoblasts, i la reabsorció, mediada pels osteoclasts (5). Els tractaments disponibles per a l'osteoporosi inclouen fàrmacs anti-resorció (com ara bifosfonats i denosumab), calcitonina i estrògens. Tanmateix, aquests compostos presenten certes limitacions; en particular, disminueixen la taxa de recanvi osteogènic i, en disminuir el procés de remodelació òssia, provoquen una disminució de la formació òssia (6). La teràpia amb estrògens no és ideal per a la teràpia de l'osteoporosi a llarg termini, ja que nivells elevats d'estrògens poden induir sagnat uterí, càncer de mama i malalties cardiovasculars (7). A més, els fàrmacs anti-resorció no són capaços de restaurar l'estructura òssia perduda. Tanmateix, els agents anabòlics poden estimular la formació òssia i augmentar la massa òssia (8). Per tant, és important identificar nous fàrmacs segurs i efectius capaços de promoure la formació òssia.
L'arbutina (4-hidroxifenil--D-glucopiranòsid; Fig. 1) és un derivat natural de la hidroquinona (massa molecular 272 Da) present en diversos tipus de plantes. Es van identificar alts nivells d'arbutina en plantes com ara marduix (Origanum majorana, Lamiaceae) i peres (Pyrus communis, Rosaceae) i, en particular, la família de les Ericaceae, com ara les fulles de la uva (Arctostaphylos uva-ursi) (9). L'arbutina presenta diverses activitats biològiques. Per exemple, es pot utilitzar l'arbutina
com a agent per blanquejar la pell; mitjançant la inhibició de l'activitat de la tirosinasa en els melanosomes, es va identificar l'arbutina per promoure la despigmentació (10,11). Un estudi anterior va demostrar que l'arbutina pot tenir un paper protector de l'apoptosi induïda per la irradiació X en disminuir els nivells intracel·lulars de radicals hidroxil (12). A més, l'arbutina pot inhibir la diferenciació dels osteoclasts disminuint els nivells intracel·lulars de superòxid i regulant el factor nuclear de les cèl·lules T activades 1 (13). Tanmateix, els efectes de l'arbutina sobre la funció dels osteoblasts segueixen sent desconeguts. Per tant, el present estudi tenia com a objectiu investigar els efectes i els mecanismes de l'arbutina sobre la proliferació i diferenciació de cèl·lules precursores dels osteoblasts de ratolí MC3T3-E1.
La via de senyalització Wnt pot afectar els osteoblasts i osteoclasts, directament i indirectament, augmentant la formació òssia i disminuint la reabsorció òssia (14). La senyalització canònica de Wnt pot regular la proliferació, la diferenciació i la funció de l'osteoblàstica a múltiples nivells (15). En models animals, disminució de l'activitat dels inhibidors de la via de senyalització Wnt/-catenina mitjançant l'ús d'anticossos contra la proteïna 1 relacionada amb la proteïna frizzled secretada, l'esclerostina i l'inhibidor 1 de la via de senyalització WNT dickkopf (DKK1) i inhibidors de molècules petites de la glucogen sintasa. la cinasa 3 (GSK-3) pot augmentar la massa òssia i disminuir el risc de fractures(16). Per tant, la via de senyalització Wnt representa un objectiu terapèutic potencial per al desenvolupament de nous fàrmacs per tractar l'osteoporosi (17). En el present estudi, es van investigar els efectes de l'arbutina sobre la proliferació i diferenciació cel·lular MC3T3-E1. A més, es va examinar el mecanisme molecular subjacent a la funció de l'arbutina per induir la diferenciació cel·lular MC3T3-E1.
Materials i mètodes
Productes químics. L'arbutina (puresa, superior o igual al 98 per cent) es va comprar a Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, Xina), es va dissoldre en sulfòxid de dimetil (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya) i es va emmagatzemar en un concentració de 0,5 M. DKK1 humà recombinant es va comprar a PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ, EUA; núm. cat. 120-30).
Cultiu cel·lular. Els pre-osteoblasts calvarials del ratolí MC3T3‑E1 es van comprar al Centre de recursos cel·lulars dels Instituts de Ciències Biològiques de Xangai de l'Acadèmia Xinesa de Ciències (Xangai, Xina) i es van cultivar en un mitjà essencial mínim (-MEM; HyClone; GE Healthcare). Life Sciences, Logan, UT, EUA) complementat amb un 10 per cent de sèrum boví fetal (FBS; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), 100 µg/ml estreptomicina i 100 U/ml penicil·lina (HyClone; GE Healthcare Life Sciences). Les cèl·lules es van mantenir en una incubadora de cultiu cel·lular amb un 5% de CO2 a 37 °C. El mitjà es va substituir cada dos dies. Les cèl·lules al 80 per cent de confluència es van tornar a sembrar en matràs de cultiu de teixits després del tractament amb un 0,25 per cent de tripsina (HyClone; GE Healthcare Life Sciences) durant 1-2 min a 37 °C. Per als experiments de diferenciació osteoblàstica, les cèl·lules es van tractar amb un suplement osteogènic que contenia 50 µg/ml d'àcid L-ascòrbic (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) i 10 mM de glicerofosfat hidrat de sal disòdica (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durant 9 dies a 37 anys. ˚C. Per a estudis mecànics, les cèl·lules MC3T3-E1 es van tractar prèviament amb DKK1 (0, 5 µg/ml) durant 6 h a 37 °C i després es van tractar amb arbutina (100 µM) durant 3 dies a 37 °C.
Proliferació cel·lular. Es va utilitzar un assaig del kit de recompte de cèl·lules{{0}} (CCK{-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japó) per avaluar els efectes de l'arbutina sobre la proliferació cel·lular. Les cèl·lules es van sembrar en plaques de 96-pou a una densitat de 5x103 cèl·lules/pou durant 24 h a 37 °C. Posteriorment, les cèl·lules es van tractar amb arbutina a diverses concentracions (0, 10, 50 i 100 µM). Després de 24, 48 o 72 h, les cèl·lules es van tractar amb una solució de CCK-8 al 9,1 per cent que contenia 10 µl de CCK-8 i 100 µl de -MEM durant 1-2 h a 37 °C. El valor de la densitat òptica de cada pou es va mesurar mitjançant un lector de microplaques (ELx808; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EUA) a una longitud d'ona de 450 nm. La viabilitat cel·lular relativa es va calcular com la relació entre l'absorbància mitjana de la mostra i el control.
Assaig d'etiquetatge de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). L'efecte de l'arbutina sobre la proliferació cel·lular es va mesurar mitjançant un kit d'imatges in vitro EdU Apollo®567 (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, Xina). Les cèl·lules es van inocular en una placa de 96-pous a una densitat de 1x103 cèl·lules/pou i es van incubar en -MEM que contenia un 10 per cent de FBS amb 0, 10, 50 o 100 µM arbutina. Després d'una incubació de 72- h, es va afegir EdU a cada pou a una concentració de 50 µM abans d'una incubació addicional durant 2 h a 37 °C. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS i es van fixar amb PBS que contenia un 4% de paraformaldehid durant 30 min a temperatura ambient (RT). Després del rentat amb glicina (2 mg/ml) i PBS, les cèl·lules es van permeabilitzar amb Triton X-100 (0,5 per cent) durant 10 min a RT. Les cèl·lules es van incubar amb un líquid de reacció de tinció d'Apollo 1X a RT durant 30 min a la foscor. Els nuclis cel·lulars es van tacar amb 1X Hoechst 33342 durant 30 min a RT. Les cèl·lules positives EdU es van visualitzar mitjançant microscòpia de fluorescència (ampliació, x200; Eclipse Ti; Nikon Corporation, Tòquio, Japó) en cinc camps seleccionats aleatòriament.
Anàlisi del cicle cel·lular i apoptosi. Les cèl·lules MC3T3-E1 es van sembrar en plaques de sis pous a una densitat de 2x105 cèl·lules/pou. Després d'una incubació de 24- h, les cèl·lules es van tractar amb arbutina a concentracions de 0, 10, 50 i 100 µM. Les cèl·lules es van recollir després de 3 dies a temperatura ambiente i es van fixar amb etanol al 70 per cent durant 12 h a 4 °C. Les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS i es van tacar amb una solució de tinció de iodur de propidi (PI) (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Xina) durant 30 minuts a 37 °C a la foscor. El contingut d'ADN es va mesurar mitjançant un citòmetre de flux FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) amb el programari CellQuest Pro (versió 5.2; BD Biosciences) i el programari ModFit LT (versió 3.0; Verity Software House, Inc., Topsham, ME, EUA). Per a l'anàlisi de l'apoptosi, es van recollir cèl·lules tractades amb arbutina i es van tacar amb Annexin-V i P I marcats amb isotiocianat de fluoresceïna (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) a la foscor durant 15 min a temperatura ambiente. La taxa d'apoptòtica cel·lular es va avaluar mitjançant un citòmetre de flux FACSCalibur (BD Biosciences) amb el programari CellQuest Pro (versió 5.2; BD Biosciences).
Assaig de tinció de fosfatasa alcalina (ALP). Els osteoblasts es van sembrar en plaques de {{{0}}pous a una densitat de 5x104 cèl·lules/pou incubat en -MEM que contenia suplement osteogènic i es van tractar amb 0 (control), 10, 50 o 100 µM d'arbutina. Després de 9 dies a 37 °C, les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS i es van fixar en un 4% de paraformaldehid a RT durant 10 min. Les cèl·lules es van esbandir tres vegades amb aigua destil·lada i posteriorment es van tenyir amb el kit de desenvolupament de color ALP de 5-bromo-4-cloro{-3-indolil fosfat/nitro blau tetrazoli (Beyotime Institute of Biotechnology) durant 2 hores a RT. Les cèl·lules tacades es van capturar amb un microscopi de llum (ampliació, x40; Eclipse Ti; Nikon Corporation).
Reacció en cadena de la polimerasa quantitativa de transcripció inversa (RT-qPCR). Les cèl·lules es van sembrar en plaques de 6-pou a una densitat de 2x105 cèl·lules/pou. Després del tractament amb arbutina a diverses concentracions durant 3 dies a 37 °C, es va extreure l'ARN total de les cèl·lules MC3T3-E1 mitjançant el reactiu RNAiso Plus (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Xina). En total, 1 µg d'ARN es va transcriure inversament a cDNA mitjançant un kit de reactius PrimeScript RT amb gDNA Eraser (Takara Biotechnology Co., Ltd.), segons les instruccions del fabricant. Les condicions de reacció van ser les següents: 42 °C durant 2 min, 37 °C durant 15 min i 85 °C durant 5 segons. La qPCR es va realitzar utilitzant quantitats iguals d'ADNc de cada mostra en un volum total de 20 µl amb un sistema de PCR en temps real ràpid ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA) mitjançant la premescla SYBR Ex Taq II (Takara). Biotecnologia Co., Ltd.). Es van utilitzar les següents condicions de termociclatge: desnaturalització inicial a 95 °C durant 30 segons, seguida de 40 cicles de 95 °C durant 5 segons i 60 °C durant 34 segons. L'especificitat de l'amplificació es va avaluar mitjançant l'anàlisi de la corba de fusió i l'actina va servir com a control intern. Els nivells d'expressió gènica relatius es van analitzar mitjançant el mètode 2-ΔΔCq (18). Les seqüències dels primers utilitzats van ser les següents: factor de transcripció relacionat amb runt 2 (RUNX2), 5'-CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3', 5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG inversa-3'; cadena de col·lagen tipus I 1 (COL1A1), endavant 5'-GCCTCCCAGAACATC ACCTA-3', revers 5'-GCAGGGACTTCTTGAGGTTG-3';os -proteïna carboxiglutamat (BGLAP), cap endavant 5'-CGCTACCTTGGAGCCTCAGT-3', revers 5'-AGGCGTCTTCAAGCCATAC-3'; Factor de transcripció Sp7 (SP7), endavant5'-AAGGTGTACGGCAAGGCTTC-3', revers 5'-CGTCAGAGCGAGTGAACCTC-3'; -catenina, davanter 5'-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3', revers 5'-CTTGCCACTCAGGGAAGGA-3'; -actina, endavant 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', revers 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
Anàlisi Western blot. Les cèl·lules MC3T3-E1 es van sembrar en plaques de 6-pous a una densitat de 2x105 cèl·lules/pou. Les cèl·lules es van tractar amb arbutina a diverses concentracions durant 3 dies i es van esbandir tres vegades amb PBS gelat. La proteïna cel·lular total es va extreure de cèl·lules MC3T3-E1 mitjançant un tampó de lisi d'assaig de radioimmunoprecipitació (Beyotime Institute of Biotechnology) que contenia 1 mM de fluorur de fenilmetilsulfonil. Les proteïnes es van aïllar després de la centrifugació a 13.800 xg durant 15 min a 4 °C. La concentració de proteïnes es va quantificar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes d'àcid bicinconínic (Beyotime Institute of Biotechnology). Es van separar quantitats iguals de proteïna (20-30 µg) a cada mostra amb un 10% de SDS-PAGE durant 2 h a una tensió constant (110 V) i es van transferir a una membrana de fluorur de polivinilidè (PVDF) (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA). Les membranes es van bloquejar en TBS més Tween-20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5 i 0,1% Tween-20) que contenia un 5% de llet sense greix a temperatura ambient durant 2 h i després es van incubar durant la nit a 4˚C amb anticossos primaris adequats. Els anticossos utilitzats van ser els següents: anti- -catenina monoclonal de conill (1:5,000; núm. cat. ab32572; Abcam, Cambridge, MA, EUA), anti-RUNX2 policlonal de conill (1: 1,000; cat. núm. ab23981; Abcam) i anti- -actina policlonal de ratolí (1:1,{000; cat. núm. AF{0003; Beyotime Institut de Biotecnologia). Posteriorment, les membranes es van rentar tres vegades amb TBST i les membranes de PVDF es van incubar amb immunoglobulina G de cabra anti-conill conjugada amb peroxidasa de rave picant (HRP) (IgG; 1:10, 000; cat. núm. ZB{{{ 52}}; OriGene Technologies, Inc., Pequín, Xina) o IgG antiratolí de cabra conjugada amb HRP (1:10.000; núm. cat. ZB-2305; OriGene Technologies, Inc.) a RT durant 2 h . Les proteïnes es van visualitzar mitjançant reactius de quimioluminescència millorada (Thermo Fisher Scientific, Inc.) i es van detectar amb un sistema de detecció de quimioluminiscència (Amersham Imager 600; GE Healthcare Life). Les proteïnes es van quantificar mitjançant el programari ImageJ (versió 1.52; National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Després de la normalització, es van calcular els nivells relatius d'expressió de proteïnes amb -actina com a control intern.
Anàlisi estadística. Tots els experiments es van repetir de manera independent almenys tres vegades. Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA). Les dades es presenten com a mitjana ± desviació estàndard, i les diferències significatives es van analitzar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància juntament amb la prova post hoc de Dunnett. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
Resultats
L'arbutina promou la proliferació cel·lular MC3T3-E1. Els efectes de l'arbutina sobre la proliferació de cèl·lules MC3T3-E1 es van examinar mitjançant un assaig CCK-8. L'arbutina es va administrar a diverses concentracions (0, 10, 50 i 100 µM) durant 24, 48 i 72 h, i es va realitzar un assaig de CCK-8 (Fig. 2A). Després de 24 h, no es van identificar diferències estadístiques en la proliferació d'osteoblasts en comparació amb les cèl·lules de control no tractades. Tanmateix, la proliferació de cèl·lules MC3T3-E1 va augmentar significativament després del tractament amb arbutina a 100 µM després de 48 i 72 h. El test d'etiquetatge EdU es va realitzar després de 72 h i els resultats van demostrar que el percentatge de cèl·lules MC3T3-E1 EdU positives tractades amb arbutina a una concentració de 50 i 100 µM va augmentar significativament en comparació amb el control no tractat (Fig. 2B i C). .
L'arbutina accelera la progressió del cicle cel·lular. Els efectes de l'arbutina en la progressió del cicle cel·lular es van avaluar mitjançant l'anàlisi del cicle cel·lular (Fig. 3). El tractament amb arbutina a 50 i 100 µM va provocar un augment del percentatge de cèl·lules en fase S (Fig. 3A i C) i 100 µM d'arbutina va provocar una disminució del percentatge de cèl·lules en fase G1- ( Fig. 3D). No es van identificar diferències estadísticament significatives en el grup de 10 µM en comparació amb el grup control. Els efectes de l'arbutina sobre l'apoptosi MC3T3-E1 també es van avaluar mitjançant citometria de flux (Fig. 3B i E). La taxa d'apoptosi no es va alterar significativament després del tractament amb arbutina a 10, 50 i 100 µM en comparació amb el control.
Efectes de l'arbutina sobre l'activitat de l'ALP. Els efectes de l'arbutina sobre la diferenciació dels osteoblasts es van analitzar mitjançant la tinció d'ALP. Després de 9 dies, el tractament amb diverses concentracions d'arbutina (0, 10, 50 o 100 µM) va augmentar notablement l'activitat ALP en comparació amb el grup control (Fig. 4A). Les troballes actuals suggereixen que l'arbutina pot augmentar l'activitat de l'ALP a les cèl·lules MC3T3-E1.
Efectes de l'arbutina sobre els nivells d'expressió d'ARNm de COL1A1, -catenina, RUNX2, BGLAP i SP7. Els nivells d'expressió d'ARNm de COL1A1, -catenina, RUNX2, BGLAP i SP7 es van avaluar en cèl·lules MC3T3-E1 mitjançant RT-qPCR després del tractament amb arbutina a diverses concentracions (0, 10, 50 o 100 µM) per 3 dies. Els nivells d'expressió de COL1A1 i -catenina van augmentar en els osteoblasts tractats amb 10, 50 i 100 µM d'arbutina en comparació amb les cèl·lules no tractades (Fig. 4B i C). Els nivells d'expressió de RUNX2, BGLAP i SP7 van augmentar significativament després del tractament amb arbutina a 50 i 100 µM (Fig. 4D-F).
Efectes de l'arbutina sobre els nivells d'expressió de proteïnes de -catenina i RUNX2. Per investigar els mecanismes subjacents de la diferenciació dels osteoblasts induïts per l'arbutina, es van examinar els nivells d'expressió de proteïnes de RUNX2 i -catenina en cèl·lules MC3T3-E1 mitjançant western blotting (Fig. 5A i B). El tractament amb arbutina a 100 µM va augmentar significativament els nivells d'expressió de proteïnes de -catenina i RUNX2 als osteoblasts en comparació amb els controls (Fig. 5C i D, respectivament). Els resultats actuals suggereixen que l'arbutina pot afectar la diferenciació dels osteoblasts mitjançant la regulació dels nivells d'expressió de proteïnes de -catenina i RUNX2. Per investigar si l'arbutina estimula la diferenciació osteoblàstica mitjançant la via de senyalització Wnt/-catenina, les cèl·lules MC3T3-E1 es van tractar amb 0, 5 µg/ml DKK1 durant 6 hores abans del tractament amb 100 µM d'arbutina.
DKK1 va inhibir significativament l'expressió de proteïna RUNX2 induïda per arbutina (Fig. 5E). Els resultats actuals suggereixen que l'arbutina pot afectar la diferenciació dels osteoblasts mitjançant la via de senyalització Wnt/-catenina.
Discussió
L'osteoporosi pot provocar fractures i discapacitats greus i representa un problema associat a l'edat a tot el món (19). L'evidència acumulada va demostrar que un desequilibri entre osteoclasts i osteoblasts en la formació i reabsorció òssia pot provocar osteoporosi (20). En particular, la formació òssia depèn de la proliferació i diferenciació dels osteoblasts (21,22).
Diversos fàrmacs disponibles que s'utilitzen per tractar l'osteoporosi són els medicaments antiresortius (23); tanmateix, aquests tractaments no són capaços de revertir la pèrdua òssia (24). Els agents anabòlics que estimulen la formació òssia poden restaurar la microestructura esquelètica greument danyada i la pèrdua de massa òssia (24). La teriparatida és un agent anabòlic que es va demostrar que estimula la formació òssia, i els assaigs clínics van demostrar que el tractament amb teriparatida va reduir el risc de noves fractures vertebrals i augmentar la densitat mineral òssia al maluc, la columna lumbar i el coll femoral (25). En particular, la teriparatida és un tractament car. Per tant, és important desenvolupar nous fàrmacs que puguin promoure eficaçment la formació òssia.
L'arbutina és un agent citoprotector i no presenta efectes citotòxics significatius a concentracions elevades (26). Tot i que la concentració sanguínia d'arbutina no està clara (13), l'arbutina s'utilitza com a medicament antimicrobià urinari i es considera un agent oral segur (27,28). Estudis anteriors van demostrar que l'arbutina pot presentar múltiples activitats, inclòs el blanqueig de la pell (10, 11), antiinflamatori (29), anticancerígen (30) i la supressió de la diferenciació dels osteoclasts (13). Tanmateix, calen estudis addicionals per investigar els efectes de l'arbutina sobre els osteoblasts i el seu potencial per utilitzar-se com a compost nou per al tractament de l'osteoporosi. Per tant, el present estudi va investigar els efectes de l'arbutina sobre la proliferació i diferenciació de cèl·lules MCET3-E1 i els mecanismes subjacents a la funció de l'arbutina in vitro.
La formació òssia està relacionada amb el nombre d'osteoblasts i l'activitat dels osteoblasts individuals (31). El nombre d'osteoblasts es pot augmentar promovent la replicació o diferenciació pre-osteoblast, o reduint la mort cel·lular dels osteoblasts madurs (32). En el present estudi, l'arbutina va augmentar la proliferació de cèl·lules MC3T3-E1 sense afectar la taxa d'apoptòtica. A més, l'arbutina va augmentar la progressió del cicle cel·lular canviant les cèl·lules de la fase G1- a la fase S. Aquests resultats suggereixen que l'arbutina pot induir la proliferació osteoblàstica.
L'ALP és un marcador precoç de la diferenciació osteogènica (33). L'ALP s'associa amb la calcificació de l'esquelet durant la formació òssia (34). En el present estudi, els resultats de la tinció d'ALP van suggerir que els osteoblasts tractats amb arbutina a 10, 50 i 100 µM i amb un suplement osteogènic durant 9 dies van mostrar una major activitat d'ALP, cosa que suggereix que l'arbutina pot promoure la diferenciació primerenca dels osteoblasts.
S'ha demostrat que l'osteogènesi està regulada per diversos factors de transcripció, inclosos RUNX2 i SP7, i múltiples proteïnes de matriu específiques de l'os, inclosa ALP,BGLAP i COL1A1 (35). RUNX2 i SP7 són importantsFactors de transcripció implicats en la diferenciació dels osteoblastsdurant la formació òssia (36). COL1A1 és extracel·lularproteïna de la matriu que afavoreix la regeneració òssia i l'osteodiferenciació de les explosions (37). BGLAP no és col·lagenproteïna de la matriu òssia que regula la renovació òssia i l'osmineralització (38). El present estudi va identificar aquesta arbutinapot induir nivells d'expressió d'ARNm importantsreguladors osteogènics, inclosos RUNX2, BGLAP, SP7 iCOL1A1. A més, el nivell d'expressió de -catenina eraaugmentat. Aquests resultats suggereixen que l'arbutina pot promourediferenciació osteoblàstica mitjançant un mecanisme que implicaWnt/ - Senyalització de catenina.
La via de senyalització Wnt influeix en la formació òssia durant el desenvolupament i la remodelació òssia durant la renovació del teixit (39). La via canònica de senyalització Wnt eraS'ha identificat que s'inicia mitjançant la senyalització del lligand Wnt a la cèl·lulasuperfície a través dels receptors de lipoproteïnes de baixa densitatproteïna 5 o 6 (Lrp5/6) i transmembrana de set passadesReceptor encrespat (40). La interacció entre lligands Wnti el seu receptor pot inhibir GSK3- al citoplasma,conduint a l'alliberament de -catenina, el medi transcripcionalator de la senyalització canònica de Wnt. Després de l'alliberament, -cateninapot entrar al nucli, controlant així l'expressiónivells dels seus gens diana (41). RUNX2 pertany a la Runtfamília de gens de domini i és un factor de transcripció implicatdiferenciació osteoblàstica (42). RUNX2 serveix per una cosa importantpaper en la coordinació de múltiples vies de senyalització durantdiferenciació d'osteoblasts (43). Un dimoni d'estudi anteriorva dir que la senyalització canònica Wnt pot regular directamentRUNX2. Concretament, el -catenina/HNF1 homeobox Acomplex pot activar el nivell d'expressió de RUNX2,afavorint així la formació òssia (44). DKK1 és un poderósinhibidor de la Wnt/ -catenina via canònica, per unióa Lrp5/6 (45,46). Els resultats del present estudi suggereixenque el tractament amb arbutina va augmentar significativament la proteïnanivells d'expressió de RUNX2 i -catenina a MC3T3‑E1cèl·lules, i DKK1 va disminuir significativament la proteïna expressanivell de sió de RUNX2. Els resultats actuals ho suggereixenL'arbutina pot promoure la diferenciació de cèl·lules MC3T3-E1 mitjançant el Wnt / canònic-via de la catenina.
Col·lectivament, segons els coneixements dels autors, el present estudi és el primer que indica que l'arbutina pot estimular la proliferació i diferenciació de cèl·lules MC3T3-E1 mitjançant la via de senyalització Wnt/-catenina. Per tant, l'arbutina pot representar un nou candidat potencial per al tractament de l'osteoporosi. Tanmateix, calen estudis addicionals per identificar el paper específic de la via de senyalització Wnt/-catenina en l'osteogènesi induïda per l'arbutina, inclosa la fosforilació de -catenina a Ser675 (47); Es pot obtenir més informació sobre el paper de la senyalització de Wnt/-catenina mitjançant agonistes de Wnt. En el futur, més estudis poden investigar la capacitat de l'arbutina per promoure la formació d'os in vivo.
Agraïments
No aplicable.
Finançament
El present treball va comptar amb el suport del programa principal de la National Nature Science Foundation de la Xina (subvenció núm. 81370981) i del Fons Científic Excepcional de l'Hospital Shengjing.
Disponibilitat de dades i materials
Els conjunts de dades utilitzats i/o analitzats durant l'estudi actual estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.
Aportacions dels autors
QF, XM i LiY van concebre i dissenyar els experiments. XM va realitzar els experiments i va escriure el manuscrit. SL, LiY, LeY i ML van analitzar les dades i van revisar críticament el manuscrit. QF va supervisar totes les investigacions i va revisar el manuscrit. Tots els autors van llegir i van aprovar el manuscrit final.
Aprovació ètica i consentiment per participar
No aplicable.
Consentiment del pacient per a la publicació
No aplicable.
Interessos competitius
Els autors declaren que no tenen interessos en competència.
Referències
1. Das S i Crockett JC: Osteoporosi: una visió actual de la prevenció i tractament farmacològic. Drug Des Devel Ther 7435-448.2013.
2.Rachner TD, Khosla S i Hofbauer LC: Osteoporosis: Now andthe future.Lancet 377: 1276-1287. 2011.
3.Hernlund E, Svedbom A, Ivergard M, Compston J, Cooper CStenmark JMcCloskey EVJOnsson B i Kanis JA: Osteoporosi a la Unió Europea: gestió mèdica, epidemiologia i càrrega econòmica. Un informe elaborat en col·laboració amb la International Osteoporosis Foundation (IOF) i la European Federation of Pharmaceutical Industry Associations (EFPIA).Arch Osteoporos 8: 136.2013.
4. Cauley JA: Impacte de l'osteoporosi en la salut pública. J Gerontol ABiol Sci Med Sci 68: 1243-1251.2013.
5. Manolagas SC i Jilka RL: medul·la òssia, citocines i remodelació òssia. Coneixements emergents sobre la fisiopatologia de l'osteoporosi. N Engl J Med 332: 305-311. 1995.
6. Baron R i Hesse E: Actualització sobre anabòlics ossis en el tractament de l'osteoporosi: justificació, estat actual i perspectives. J ClinEndocrinol Metab 97: 311-325.2012.
7.TangDZ, Hou WZhou Q, ZhangM, HolzJ, SheuTJ, LiTF ChengSDShi O. Harris SE.et al: Osthole estimula la diferenciació dels osteoblasts i la formació òssia mitjançant l'activació de la senyalització beta-catenina-BMP Bone Miner Res 25: 1234-1245 . 2010.
8. Canalis E: Actualització en noves teràpies anabòliques per a l'osteoporosi. J Clin Endocrinol Metab 95: 1496-1504.2010.
9. Lamien-Meda A, Lukas B, Schmiderer C, Franz C i Novak J: validació d'un assaig quantitatiu d'arbutina mitjançant cromatografia de gasos en Origanum majorana i Arctostaphylos uva-ursiextracts. Phytochem Anal 20: 416-420.2009 .
10.Lim YJ, Lee EH, Kang TH, Ha SK, Oh MS, Kim SM, Yoon TJ.Kang C, Park JH i Kim SY: efectes inhibidors de l'arbutina sobre la biosíntesi de melanina de la hiperpigmentació induïda per hormones estimulants dels alfa-melanòcits en teixits de pell de conillet d'índies de color marronós cultivat. Arch Pharm Res 32: 367-373.2009.
11. Maeda K i Fukuda M: Arbutina: Mecanisme de la seva acció despigmentant en cultiu de melanòcits humans. J Pharmacol ExpTher 276: 765-769.1996.
12. Wu LH Li P Zhao OL. Piao JL Jiao YF Kadowaki M i Kondo T: Arbutin. un eliminador de radicals hidroxil intracel·lular protegeix l'apoptosi induïda per la radiació a les cèl·lules del limfoma humà U937. Apoptosi 19: 1654-1663.2014
13. Omori A Yoshimura Y. Deyama Y i Suzuki K: L'àcid rosmarinic i l'arbutina suprimeixen la diferenciació dels osteoclasts mitjançant la inhibició de la regulació a la baixa del superòxid i NFATel a les cèl·lules RAW 264.7 Biomed Rep 3: 483-490.2015
14. Baron R i Kneissel M: senyalització WNT en homeòstasi i malaltia òssia: de mutacions humanes als tractaments. Nat Med l9.179-197.2013
15. Baron R i Rawadi G: Orientació a la via Wnt/beta-catenina per regular la formació òssia a l'esquelet adult. Endocrinologia 148: 2635-2643.2007.
16. Hoeppner LH Secreto FJ i Westendorf JJ: senyalització Wnt com a objectiu terapèutic per a malalties òssies. Opinió d'experts TherTargets 13: 485-496.2009.
17. Williams BO i Insogna KL: On va anar Wnts: el camp explosiu de senyalització Lrp5 i Lrp6 a l'os. J Bone Miner Res 24:171-178.2009
18. Livak KJ i Schmittgen TD: Anàlisi de dades d'expressió gènica relativa mitjançant PCR quantitativa en temps real i el mètode 2(-Delta DeltaC(T) Mètodes 25:402-408.2001.
19.Lin X. Xiong D. Peng YO. Sheng ZF. Wu XY Wu XP Wu FYuan LO i Liao EY: Epidemiologia i gestió de l'osteo. porosi a la República Popular de la Xina: perspectives actuals. Clin Interv Aging 10: 1017-1033.2015.
20. Manolagas SC: Naixement i mort de cèl·lules òssies: mecanismes reguladors bàsics i implicacions per a la patogènesi i el tractament de l'osteoporosi. Endocr Rev 21: 115-137.2000.
21.Liu S. Fang T. Yang L. Chen Z. Mu S i Fu O: Gastrodinprotects MC3T3-Els osteoblasts de la disfunció cel·lular induïda per la dexametasona i afavoreix la formació òssia mitjançant la inducció de la via de senyalització NRF2. Int J Mol Med 41: 2059-2069.2018.
22. Parc Yun HM KR. Quang TH Oh H. Hong JT. Kim YC i Kim EC: 2.4.5-Trimethox yldalbergiquinol afavoreix la diferenciació i la mineralització osteoblàstica mitjançant la via BMP i Wnt/B-catenina. Cell Death Dis 6: el819. 2015.
23. Cosman F Nieves JW i Dempster DW: Treatment sequence1718.22.matters: Teràpia anabòlica i antiresortiva per a l'osteoporosi Bone Miner Res 32: 198-202.2017
24.Uihlein AV i Leder BZ: teràpies anabòliques per a l'osteoporosi. Endocrinol Metab Clin North Am 41: 507-525.2012
25. Nakamura T Sugimoto T. Nakano T. Kishimoto H. Ito MFukunaga MHaginoH Sone T. Yoshikawa Nishizawa Y.eralTeriparatida aleatòria (hormona paratiroïdal humana (PTH1-341 Once-Weekly Efficacy Research (TOR)) assaig de reducció per examinar noves fractures vertebrals en subjectes amb osteoporosi primària i alt risc de fractura J Clin Endocrinoetab 97: 3097-3106.2012
26. Jurica K BrCic Karabonji l, Mikolic A, Milcjkowic-Opsenica DBenkovic V i Kopjar N: avaluació de la seguretat in vitro de l'extracte de fulla d'aigua de l'arboç (Arbrrfus redo L) i limfòcits de sang perifèrica humana d'arbutina. Citotecnologia 70: 1261-1278.2018
27. Schindler G. Patzak U Brinkhaus B. va guanyar Niecieck A. Wittig JKrihmer N Glockl land Veit M: Excreció urinària i Metabo. llista d'arbutina després de l'administració oral d'extracte d'Arctosfaphylos reversi com a pastilles recobertes de pel·lícula i solució aquosa en humans sans. J Clin Pharmacol 42: 920-927.2002.
28. Genowese C Davinelli S. Mangano K, Tempera G, Nicolosi D.Corsello S.Vergalito F Tartaglia E. Scapagnini G i Di Marco R: Efectes d'una nova combinació d'extractes de plantes més d-manosa per a la gestió del tracte urinari recurrent sense complicacions infeccions. J Chemother 30: 107-114. 2018
29. Lee HJ i Kim KW: efectes antiinflamatoris de l'arbutina en cèl·lules microglials BV2 estimulades per lipopolisacàrids. InfiammRes 61: 817-825.2012.
30. Jiang L. Wang D Zhang Y. Li J. Wu Z. Wang Z i Wang DInvestigació dels efectes pro-apoptòtics de l'arbutina i el seu derivat acetilat en cèl·lules de melanoma murí. Int J Mol Med 41:1048-1054.2018
31. Marie PJ i Kassem M: Osteoblasts in osteoporosis: Pastemerging, and future anabolic targets. Eur J Endocrinol 165:1-10.2017
32. Canalis E: Gestió de la malaltia endocrina: nous tractaments anabòlics per a l'osteoporosi. Eur J Endocrinol 178: R33-R44. 2018
33. Weinreb M Shinar D i Rodan GA: Patró diferent de fosfatasa alcalina, osteopontina i expressió d'osteocalcina en l'os de rata en desenvolupament visualitzat per hibridació in situ. J BoneMiner Res 5: 831-842.1990.
34. Kim YJ. Lee MH Wozney JM Cho JY i Ryoo HM: l'expressió de fosfatasa alcalina induïda per proteïna morfogenètica òssia-2- és estimulada per Dlxs i reprimida per Msx2. J BioChemm 279: 50773-50780.2004
35. An JYang H Zhang O. Liu C. Zhao J. Zhang L i Chen B Productes naturals per al tractament de l'osteoporosi: els efectes i els mecanismes en la promoció de la vida de formació òssia mediada per osteoblast Sci 147: 46-58.2016
36.Kobavashi T i K ronenbere H: Minirevisió: regulació transcripcional en el desenvolupament de l'os. Endocrinoloey 146: 1012-1017.2005.
37. Cathev i Reddy ABaltordal.oiczTrombospondina-2 faciliten el muntatge d'una matriu rica en col·lagen de tipus I en cèl·lules estromals medul·lars sotmeses a una estació osteoblàstica diferent. Connect Tissue Res 54: 275-782.2013
38. Neve A. Corrado A i Cantatore FP: Osteocalcin: Skeletal and extra-skeletal effects J Cell Physiol 228: 1149-1153.2013
39. Wang Y.Li YP Paulson C, Shao Jz, Zhang X Wu M i Chen van anar i la via de senyalització Wnt en el desenvolupament i la malaltia dels ossos. Front Biosci (Landmark Ed) 19: 379-407.2014
40.MacDonald BT. Tamai K i He X: components de senyalització Wnt/beta-catenina. mecanismes. i malalties. Cel de desenvolupador1 17: 9-26. 2009
41. Kramer l.Halleux C,Keller H, Pegurri M,Gooi JHWeber PB. Feng JO. Bonewald LF i Kneissel M: la senyalització OsteocytWnt/beta-catenina és necessària per a l'homeòstasi òssia normal. Mo Cel1 Biol 30: 3071-3085.2010
42. Ducy P Schinke T i Karsenty G: L'osteoblast: un fibroblast sofisticat sota vigilància central. Ciència 289:1501-1504.2000
43. Franceschi RI i Xiao G: Regulació del factor de transcripció específic de l'osteoblast. RUNX2: Resposta a múltiples vies de transducció de senyals. J Cell Biochem 88: 446-454.2003
44. Gaur T, Lengner Cl, Howhannisyan H, Bhat RA, Bodine PVKomm BS. Javed A. van Wijnen AJ. Stein JL. Stein GS Lian JB: La senyalització canònica WNT promou l'osteogènesi estimulant directament l'expressió del gen Runx2. J Biol Chem 280:33132-33140.2005
45. Kawano Y i Kypta R: antagonistes secretats de la via de senyalització Wnt. J Cel1 Sci 116: 2627-2634.2003
46.Daoussis D i Andonopoulos AP: El paper emergent de Dickkopf-l en la biologia òssia: és l'interruptor principal que controla la remodelació òssia i articular? Semin Artritis Rheum 41: 170-177.2011
47. Taurina S.Sandbo N. Qin Y. Browning D i Dulin NO: Fosforilació de la beta-catenina per proteïna quinasa dependent de l'AMP cíclic. J Biol Chem 281: 9971-9976.2006
Per a més informació: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
