Efectes beneficiosos de la fracció de glicòsid feniletanoide total aïllada de Cistanche Deserticola sobre la microestructura òssia en rates ovariectomitzades
Mar 08, 2022
Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang i Xueqin Ma
1 Departament d'Anàlisi Farmacèutica, Escola de Farmàcia, Universitat Mèdica de Ningxia, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Xina
2 Escola de Medicina Clínica, Universitat Mèdica de Ningxia, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, Xina
3 Laboratori clau de modernització de la medicina ètnica Hui, Ministeri d'Educació, Universitat Mèdica de Ningxia, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Xina
Aquest és un article d'accés obert distribuït sota la llicència d'atribució de Creative Commons, que permet l'ús, la distribució i la reproducció sense restriccions en qualsevol mitjà sempre que l'obra original sigui degudament citada.
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Resum
El present estudi va ser dissenyat per estimar l'activitat antiosteoporòtica de la fracció total de glicòsids feniletanoides aïllades deCistanchedeserticola(CDP) en rates induïdes per ovariectomia (OVX), així com els mecanismes relacionats. Després de 3 mesos d'administració oral, es va recuperar la disminució de la densitat mineral òssia, sèrum Ca i P en rates OVX i la microarquitectura òssia trabecular deteriorada es va millorar en part per la intervenció de Cistanche deserticola (60, 120 i 240 mg/kg), les activitats. dels marcadors de reabsorció òssia es va regular a la baixa i el bioactiu de l'índex de formació òssia es va regular a l'alça; mentrestant, el contingut de MDA es va reduir i el GSH es va augmentar amb el tractament amb CDP. Composicionalment, es van identificar 8 compostos de glicòsids feniletanoidesCistanchedeserticola(CDP), amb el contingut total quantificat en un 50,3 per cent mitjançant el mètode HPLC. Mecànicament,Cistanchedeserticola(CDP) va disminuir els nivells de TRAF6, RANKL i RANK, suprimint així l'activació induïda per RANKL/RANK/TRAF6-de les vies de senyalització NF-κB i PI3K/AKT aigües avall i, finalment, va prevenir les activitats de les proteïnes osteoclastogèniques clau de NFAT2 i c. -Fos. Totes les dades anteriors van implicar que CDP va mostrar efectes beneficiosos sobre la microestructura òssia en rates ovariectomitzades, i aquests efectes poden estar relacionats amb les vies de senyalització NF-κB i PI3K/AKT que es van desencadenar per la unió de RANKL, RANK i TRAF6.
Cistanche tubulosaté molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més
1. Introducció
L'osteoporosi postmenopàusica, on patirà 1 de cada 3 dones de més de 50 anys, s'està convertint en el principal perill per a la salut que afecta més de 200 milions de dones a tot el món [1]. A la menopausa, el fort descens del nivell d'estrògens sol conduir a una reabsorció òssia superada provocada per l'augment de l'osteoclastogènesi; aleshores, l'equilibri entre la formació òssia induïda per osteoblasts i la reabsorció òssia induïda per osteoclasts es va interrompre, i la reabsorció òssia accelerada finalment va provocar osteoporosi i fins i tot fractura de maluc o columna vertebral [2]. Es creia que la diferenciació de l'osteoclast es va desencadenar quan l'activador del receptor del factor nuclear kappa B (RANK) estava unit a RANKL, el lligand de RANK. Tanmateix, la combinació de RANK a RANKL no es pot activar tret que s'hi uneixi el factor 6 associat al receptor del factor de necrosi tumoral de proteïnes (TRAF6) [3], seguit de l'estimulació de vies de senyalització aigües avall incloent PI3K/AKT i NF-κB. I finalment, es van regular les expressions del factor nuclear de les cèl·lules T activades c2 (NFAT2) i c-Fos [4] per modular la diferenciació de l'osteoclast així com la reabsorció òssia. Així, els factors i reguladors que estan directament o indirectament relacionats amb l'activació i la diferenciació dels osteoclasts es creien com a objectius crucials per prevenir la pèrdua òssia.
De fet, hi ha alguns fàrmacs clínics i sintètics de teràpia substitutiva d'hormones com el valerat d'estradiol que són efectius en el tractament de l'osteoporosi postmenopàusica. Malauradament, alguns d'aquests van augmentar el risc de càncers greus, inclosos els de mama i d'endometri [5], la qual cosa va limitar les seves aplicacions clíniques. Per tant, cal seleccionar altres alternatives amb eficàcia i efectes secundaris mínims. Les medicines tradicionals xineses (TCM), així com els compostos i fraccions bioactius aïllats [6–9], es van demostrar eficaços en diverses malalties, inclosa l'osteoporosi postmenopàusica. Entre aquests components i fraccions bioactives, es creia que els compostos de glicòsids feniletanoides (PhG) amb una eficàcia potencial eren agents prometedors per al tractament de l'osteoporosi [10–12]. Les estructures dels PhG consisteixen en aglicona d'àcid cinàmic, un grup hidroxil fenil etil que es combina amb -glucopiranosa, apiosa, galactosa, ramnosa o xilosa mitjançant un enllaç glicosídic. Existeixen àmpliament en espècies medicinals del gènereCistanche[13]. CistanchedeserticolaYC Ma és un MTC oficial que es registra a la farmacopea xinesa i, a més de ser un MTC important [14], C deserticola també és una herba tònica antienvelliment amb pocs efectes secundaris que s'ha convertit en licor medicinal i líquid nutricional aprovat per l'Estat Food. i Administració de Medicaments. Segons el registre de la farmacopea xinesa, els nadius havien utilitzat tradicionalment C. deserticola per tractar problemes de deficiència d'essència renal com la debilitat muscular i la debilitat lumbar, i els compostos de glicòsids feniletanoides, inclosos l'echinacòsid i l'acteòsid, són els principals constituents bioactius d'aquesta herba. Segons la teoria TCM de "ronyó-govern-os", el sistema ossi es regeix per l'essència del ronyó [15], i els problemes relacionats amb els ossos com l'osteoporosi es podrien recuperar amb herbes o compostos que posseeixen l'activitat de nodrir l'essència del ronyó. Per tant, vam plantejar la hipòtesi que la fracció total de glicòsids feniletanoides aïllades de C. deserticola, almenys en part, era beneficiosa en el tractament de l'osteoporosi. Per tant, l'experiment actual es va idear per validar la nostra hipòtesi mitjançant un model de rata ovariectomitzada (OVX); a més dels marcadors de reabsorció i formació òssia que s'han d'estimar, l'índex d'antioxidació així com les vies de senyalització PI3K/AKT i NF-κB induïdes per RANKL/RANK/TRAF6- també es van emprar per investigar els principals mecanismes de la bioactivitat antiosteoporòtica. .
2. Materials i mètode
2.1. Materials vegetals i preparació.
Un total de 30 kg de tiges deCistanchedeserticolaY.C. Ma es va recollir al comtat de Yongning el setembre del 2015 amb les coordenades 106.026597 i 38.262816, província de Ningxia, Xina. L'herba va ser identificada pel Dr. Lin Dong (Departament de Farmacognòsia, Universitat Mèdica de Ningxia) i un exemplar corresponent (núm. 201509{{40}}1) es va conservar al Departament d'Anàlisi Farmacèutica. En primer lloc, es van extreure 30,0 kg de C. deserticola en pols mitjançant el mètode de reflux amb etanol al 70 per cent com a dissolvent; la proporció de material a dissolvent es va establir en 1: 10 i el temps de reflux va ser de 2 h durant 3 vegades. A continuació, es van combinar tots els filtrats i es van condensar a pressió reduïda a 60 graus C. En segon lloc, es van utilitzar columnes de resina macroporosa AB-8 per a la separació preliminar i diferents proporcions d'etanol en aigua (0 per cent, 20 per cent, El 30 per cent, el 40 per cent, el 50 per cent i el 60 per cent, cada 60 L) es van emprar per a l'elució. En tercer lloc, els eluents del 40 per cent i el 50 per cent es van combinar i es van purificar encara més utilitzant columnes repetides de resina macroporosa AB-8 amb els eluents del 0 per cent, el 20 per cent, el 30 per cent, el 40 per cent i el 50 per cent d'etanol a l'aigua, i cada eluent era de 12 L. Finalment, es va recollir la fracció del 40 per cent i es va condensar a pressió reduïda per obtenir 150 g de fracció de glucòsid feniletanoide de sediment groc pàl·lid de C. deserticola (CDP, el rendiment va ser del 0,5 per cent). Per a experiments in vivo, es va utilitzar un 0,5 per cent de dissolvent CMC-Na per dissoldre CDP; l'administració oral als animals es va establir en 1 ml/100 g de pes corporal; per a l'anàlisi Western blot in vitro, CDP es va dissoldre amb DMSO i després es va diluir amb DMEM per obtenir les concentracions finals de 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml i 0,001 mg/ml.
2.2. Productes químics i dissolvents.
El valerat d'estradiol (EV) era de Delpharm Lille SAS, França; Kits d'ELISA de reticulació de fosfatasa alcalina (ALP), gla-proteïna òssia (BGP), fosfatasa àcida resistent al tartrat (TRAP) i desoxipiridinolina (DPD) de Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Xangai, Xina, 201605; kits de reactius de malondialdehid (MDA, 20181221), superòxid dismutasa (SOD, 20121218) i glutatió (GSH, 20181221) de l'Institut d'Enginyeria Biològica de Nanjing Jiancheng, Nanjing, Xina; Kits d'ELISA de parathormona intacta (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonina (2L9ISN7AIU) i receptors relacionats amb estrògens alfa (ERR , Y3AY8QEWB3) d'Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Xina; kit de reactius ELISA de catepsina K de BioVision, Amèrica, 1l300141; anticossos primaris de RANKL (GR{3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 alfa quinasa (AC2) p8652 , AKT 1 (AF05173234), -actina (17AV0411) i anticossos secundaris de IgG anti conill de cabra conjugada amb peroxidasa de rave picant de ZSGB-BIO, Xina, 136080; kit d'assaig de proteïnes BCA total i el kit comercial per a la detecció de formació d'oste oclasts i sèrum boví fetal i medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) de HyClone, Logan, UT, EUA; membrana de fluorur de polivinilidè (PVDF) de Millipore Life Sciences, Billerica, MA, EUA; penicil·lina i estreptomicina de Gibco, Rockville, MD, EUA. Tots els altres agents químics utilitzats eren de grau AR.
2.3. Quantificació HPLC de Cistanche Deserticola P.
Es va utilitzar un instrument HPLC Agilent 1220 per identificar i quantificar la composició de CDP. Les condicions de cromatografia eren les següents: columna C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); l'elució en gradient contenia dissolvents A (acetonitril) i B (aigua que conté un 0,5 per cent d'àcid acètic) (0-10 min: 17-20 per cent A; 10-30 min: 20-25 per cent A; i 30-40 min: 25-30 per cent A); la longitud d'ona de detecció era de 333 nm; temperatura ambient; el flux va ser d'1,0 ml/min; el volum d'injecció de la mostra era de 5 μL. Es van identificar vuit compostos de PhG, és a dir, cistàsid F, equinacòsid, 6′-acetilacteòsid, cistàsid C, cistanòsid A, acteòsid, 2′-acetilacteòsid i isoacteòsid; utilitzant les substàncies de referència corresponents i un mètode estàndard extern, els continguts dels 8 PhG anteriors es van quantificar mitjançant anàlisi HPLC (figura 1).
2.4. Protocol experimental animal.
Un total de 6 0 rates Sprague-Dawley adultes femelles de 3 mesos d'edat es van proposar des del centre de proves amb animals de la Universitat Mèdica de Ningxia, amb un pes corporal inicial mitjà d'uns 234 ± 25 g. Les rates es van allotjar en un entorn estàndard lliure de patògens específics per aclimatar-se durant 1 setmana. Aleshores, totes les rates van ser anestesiades (hidrat de cloral, 100 mg/kg, ip) només o ovariectomitzada simulada (SHAM), o es van eliminar dos ovaris i després es van dividir aleatòriament en 5 subgrups: es van tractar oralment amb vehicle (0, 5 per cent de CMC-). Na) es va establir com a grup model (OVX), valerat d'estradiol (1 mg/kg/dia) com a grup positiu (EV) i 60, 120 i 240 mg/kg/dia de CDP com a baix (CDPL), grups de dosificació moderada (CDPM) i alta (CDPH), respectivament. Totes les rates es van administrar per via oral diàriament i van durar 3 mesos amb la dosi ajustada cada 2 setmanes que depenia del canvi de pes corporal sencer. L'últim dia de l'experiment amb animals, es va obtenir orina 24-hora utilitzant gàbies metabòliques; es va recollir sèrum de l'artèria femoral de rates anestesiades; es van disseccionar els fèmurs, la tíbia i tots els òrgans drets i es van emmagatzemar a -80 grau C per a una anàlisi posterior. Els experiments amb animals que vam realitzar van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat Mèdica de Ningxia.
2.5. Determinació de la densitat mineral òssia i anàlisi micro-TC.
En primer lloc, es va utilitzar una màquina d'absorciometria de raigs X de doble energia (Lunar, EUA) per estimar la densitat mineral òssia total del fèmur dret de cada rata; en segon lloc, es va utilitzar el mateix fèmur per estimar la imatge 3D de la microarquitectura de l'os trabecular mitjançant l'ús d'un aparell d'escàner micro-TC (GE, Amèrica). La resolució isòtropa es va establir en 14 μm per obtenir una imatge 3D ideal; la regió d'interès (ROI) es va escollir establint les mateixes coordenades a la placa de creixement del fèmur de cada mostra; i els paràmetres morfomètrics ossis, incloent la separació trabecular (Tb. Sp), el nombre trabecular (Tb. N), el gruix trabecular (Tb. Th), el contingut mineral ossi (BMC), la densitat mineral dels teixits (TMD) i el contingut mineral dels teixits (TMC). ) es van obtenir mitjançant l'anàlisi del ROI.
2.6. Assaig bioquímic de sèrum i orina.
Les activitats de la catepsina sèrica K, TRAP, SOD i GSH, així com els continguts de sèrum PTH, calcitonina, ERR, MDA, BGP i DPD d'orina, es van determinar utilitzant els kits de reactius corresponents segons les instruccions del fabricant i el El nivell de fosfatasa alcalina (ALP) i els continguts de calci (Ca) i fòsfor (P) en sèrum i orina es van estimar mitjançant una màquina automàtica (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, EUA).
2.7. Anàlisi Western Blot.
Els osteoclasts es van induir utilitzant cèl·lules RAW 264.7 afegides amb factor estimulant de colònies de macròfags (MCSF) i RANKL. Breument, es van cultivar 1 × 107 cèl·lules RAW 264,7 en una placa de 6-pou en presència de 30 ng/mL de MCSF i 25 ng/mL de RANKL. Després de 6 dies d'inducció, les cèl·lules d'osteoclasts madures es van identificar mitjançant el mètode tenyit amb TRAP amb el kit corresponent, després es van tractar amb CDP (0.1, 0.01 i 0.001 mg/mL). , respectivament) durant 24 h; després, les cèl·lules es van lisar amb un tampó de lisi que contenia 0,5 mmol de fluorur de fenilmetilsulfonil, proteasa i inhibidors de la fosfatasa. A continuació, es va separar el lisat utilitzant un 10 per cent de SDS-PAGE i es va transferir a una membrana PVDF, que es va sondar amb AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos i -actina. (1: 400) després de bloquejar amb un 5% de llet sense greix durant 2 h. Les mateixes membranes es van retirar i es van sondar de nou amb els 9 anticossos corresponents anteriors, respectivament, i després van ser detectades pel programari Image Lab al final. Els experiments es van repetir tres vegades.
2.8. Anàlisi estadística.
Totes les dades obtingudes d'experiments in vivo i in vitro, descrites com a mitjana ± SD, es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional seguida de la prova de Dunnett (programari SPSS 22.0, SPSS, EUA); p < 0="" 05="" va="" ser="" estadísticament="">
Resultats
3.1. Composició química de Cistanche Deserticola P.
Mitjançant el mètode HPLC, vuitglucòsid feniletanoidees van trobar compostos en aquesta fracció, tal com mostra la figura 1. Mitjançant l'ús de referències estàndard i un mètode estàndard extern, els compostos i el seu contingut es van identificar i quantificar de la següent manera: (1) acteòsid F (3,6 per cent), (2) equinacòsid (8,8 per cent), (3) cistàsid A (5.{). {9}} per cent ), (4) acteòsid (13,3 per cent ), (5) isoacteòsid (3,3 per cent ), (6) acteòsid C (3,6 per cent ), (7) 2′-acetilacteòsid (9,9 per cent ) i (8) ) 6′-acetilacteòsid (3,2 per cent). El contingut total d'aquests vuit components es va quantificar en un 50,7 per cent.
3.2. Efectes de Cistanche Deserticola P sobre la densitat mineral òssia i la microarquitectura de Trabecula.
La densitat mineral òssia total de les rates en diferents subgrups es mostra a la figura 2. Es va observar una tendència decreixent en el contingut de la densitat mineral òssia en rates del grup model OVX, que va disminuir gairebé un 12.0 per cent després 12 setmanes de l'operació en comparació amb les rates del grup SHAM (p <0 001).="" totes="" les="" rates="" tractades="" amb="" cdp="" van="" mostrar="" una="" densitat="" mineral="" òssia="" significativament="" augmentada="" en="" un="" 11,2%,="" un="" 12,0%="" i="" un="" 10,7%="" (p=""><0 01),="" respectivament,="" en="" comparació="" amb="" les="" rates="" del="" model="" ovx.="" grup.="" a="" més,="" d'acord="" amb="" les="" dades="" de="" la="" densitat="" mineral="" òssia="" total,="" la="" reconstrucció="" micro-tc,="" així="" com="" la="" determinació="" histomorfomètrica="" del="" fèmur,="" van="" demostrar="" que="" les="" rates="" del="" grup="" ovx="" van="" mostrar="" un="" deteriorament="" evident="" de="" l'arquitectura="" trabecular="" evidenciada="" pel="" nombre="" i="" l'àrea="" de="" trabecula="" notablement="" disminuïts.="" ja="" que="" la="" tb="" augmenta="" notablement.="" sp="" en="" comparació="" amb="" les="" rates="" del="" grup="" sham.="" el="" tractament="" amb="" cdp="" va="" evitar="" el="" deteriorament="" de="" l'arquitectura="" trabecular="" induït="" per="" ovx;="" com="" mostra="" la="" figura="" 3,="" el="" bmc,="" tmc="" i="" tb.="" els="" valors="" de="" n="" van="" augmentar="" significativament="" i="" l'àrea="" de="" tb.="" sp="" va="" disminuir="" notablement,="" mentre="" que="" els="" valors="" de="" tmd="" i="" tb.="" semblava="" que="" no="" es="" van="" veure="" afectats="" significativament="" per="" l'operació="" ovx="" i="" la="" nostra="" intervenció="">
3.3. Efectes de Cistanche Deserticola P en paràmetres bioquímics d'orina i sèrum.
Com mostra la figura 4, es van detectar tendències de disminució significativa del nivell urinari de P i del contingut sèric de calcitonina en rates del grup model OVX, que va ser gairebé un 30 per cent i un 60 per cent menys que les rates SHAM (p < 0="" 001="" ),="" respectivament,="" mentre="" que="" no="" es="" van="" observar="" tendències="" òbvies="" d'augment="" o="" disminució="" dels="" nivells="" urinaris="" de="" ca="" i="" ca="" sèric,="" així="" com="" de="" p="" sèric="" i="" pth="" sèric="" entre="" els="" grups="" ovx="" i="" sham.="" el="" tractament="" amb="" cdp="" va="" prevenir="" significativament="" la="" pèrdua="" del="" sèrum="" p="" i="" ca="" a="" les="" rates="" ovx,="" evidenciada="" pels="" nivells="" sèrics="" de="" p="" i="" ca="" notablement="" regulats="" (p=""><0 05)="" en="" comparació="" amb="" les="" rates="" del="" grup="" model="" ovx.="" a="" més,="" es="" van="" observar="" tendències="" augmentades,="" però="" no="" estadísticament="" significatives,="" de="" la="" calcitonina="" tant="" en="" els="" grups="" de="" dosificació="" baixa="" com="" en="" l'alta="" de="" cdp="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" del="" model="">
3.4. Efectes de Cistanche Deserticola P sobre la formació òssia i els marcadors de reabsorció òssia.
Els efectes beneficiosos del CDP sobre l'índex de formació òssia, així com les influències d'inhibició sobre els marcadors de reabsorció òssia, es van descriure a la figura 5. Pel que fa als marcadors de formació òssia, els nivells de BGP sèric gairebé no es van veure influenciats per la cirurgia ovariectomitzada evidenciada per no es van observar canvis significatius en tots els grups tractats, mentre que es van obtenir millores estadísticament significatives de l'ALP sèrica tant en dosis baixes (60 mg/kg) com moderades (120 mg/kg) dels grups d'intervenció CDP quan en comparació amb les rates del grup SHAM (p <0 01).="" pel="" que="" fa="" a="" l'índex="" de="" reabsorció="" òssia,="" els="" nivells="" de="" catepsina="" sèrica="" k="" i="" dpd,="" així="" com="" de="" trap="" en="" rates="" del="" grup="" model="" ovx,="" es="" van="" millorar="" significativament="" en="" un="" 75,0%,="" 41,4%="" i="" 21,0%,="" respectivament,="" en="" comparació="" amb="" les="" rates="" sham.="" ,="" i="" quan="" es="" tractava="" amb="" cdp,="" especialment="" la="" dosi="" baixa="" de="" 60="" mg/kg,="" les="" propietats="" de="" la="" catepsina="" k="" i="" la="" dpd,="" així="" com="" la="" trap="" al="" grup="" del="" model="" ovx="" es="" van="" inhibir="" notablement="" en="" un="" 67,3="" per="" cent,="" 41,4="" per="" cent="" i="" 25,9="" per="" cent,="" respectivament,="" ja="" que="" en="" comparació="" amb="" les="" rates="" del="" grup="" model="">
3.5. Efectes de Cistanche Deserticola P sobre la vagina i l'úter, així com sobre els pesos corporals sencers.
Es van observar diferències no significatives en el pes corporal sencer de les rates abans del tractament en sis grups (figura 6). No obstant això, l'operació d'ovariectomització va provocar un augment significatiu del pes corporal final de les rates del grup del model OVX, que és de gairebé un 36,0 per cent, mentre que el pes humit de l'úter i la vagina es va reduir dràsticament en gairebé un 9{{4 }}.0 per cent i 60,0 per cent, respectivament, en comparació amb les rates SHAM (p <0 001).="" tot="" i="" que="" el="" contingut="" de="" l'err="" no="" va="" mostrar="" cap="" diferència="" significativa="" entre="" els="" grups="" ovx="" i="" sham,="" tots="" els="" grups="" de="" tractament,="" inclosos="" cdp="" i="" ev="" van="" augmentar="" significativament="" el="" nivell="" d'err.="" a="" més,="" quan="" es="" van="" tractar="" amb="" ev,="" els="" anteriors="" van="" guanyar="" pes="" corporal="" sencer,="" així="" com="" la="" pèrdua="" de="" pes="" vaginal="" i="" uterí="" de="" rates="" ovx,="" es="" van="" revertir="" parcialment="" (p=""><0 001),="" però="" no="" es="" van="" veure="" afectats="" per="" la="" intervenció="" de="">
3.6. Efectes de Cistanche DeserticolaP sobre els nivells de sèrum MDA, SOD i GSH.
No hi va haver cap diferència estadísticament significativa en les propietats del sèrum SOD i GSH entre els grups de models SHAM i OVX; tal com descriu la figura 7, es pot observar una tendència creixent de GSH entre els dos grups anteriors. A més, el nivell de MDA sèric es va augmentar bruscament gairebé un 50 per cent a les rates del grup model OVX en comparació amb les rates SHAM. L'activitat de la SOD no es va veure influenciada pel tractament amb CDP, mentre que la propietat de GSH es va millorar significativament per la intervenció de CDP, i CDP va disminuir notablement el nivell de MDA en un 33,9 per cent i un 42,4 per cent a les dosis de 60 i 240 mg/kg, respectivament. p <0>
3.7. Efectes de Cistanche deserticola P en els nivells d'expressió de proteïnes.
Les nostres dades, que es mostren a la figura 8, van suggerir que el tractament amb CDP va disminuir significativament els nivells de proteïnes de TRAF6, RANK i RANKL en comparació amb el control. Es van suprimir les vies de senyal aigües avall incloent NF-κB i PI3K/AKT es va estimular per la intervenció de CDP, evidenciada per l'expressió de la regulació a la baixa de NF-κB-p65, mentre que PI3K-p85 i AKT1 es van regular. En conseqüència, l'expressió de NFAT2 es va reduir significativament i el c-Fos va augmentar després del tractament amb CDP a una concentració de 0.001-0, 1 mg/mL. A la figura 9 es descriu un mecanisme suggerit, on CDP va regular a la baixa els nivells de RANKL i RANK, donant lloc a la reducció de les quantitats d'unió d'aquest lligand amb el seu receptor, i la connexió de RANKL amb RANK es va reduir encara més per la baixada de TRAF6. seguida de la supressió de les vies aigües avall, inclosa la via NF-κB, mentre que es va estimular la via del senyal PI3K/AKT, que finalment va provocar la disminució de l'expressió NFAT2 i l'augment del nivell de c-Fos.
4. Discussió
Els glucòsids feniletanoides són components naturals solubles en aigua que existeixen àmpliament al regne de les plantes medicinals [11]. Fins ara, els compostos de glicòsids feniletanoides havien atret cada cop més investigadors pel seu paper evident en el maneig de diverses malalties i anomalies humanes [13]. Es van identificar i aïllar un nombre de fraccions i compostos bioactius antiosteoporòtics, inclosos polifenols i glicòsids feniletanoides, a partir de desenes d'herbes medicinals naturals [5, 10, 12, 16, 17). C. deserticola és ben conegut com "ginseng del desert", que implicava el perfil de seguretat d'aquest TCM comestible [18, 19]. Com a herba tònica general i aliment natural per a la salut que s'ha utilitzat durant molt de temps als països asiàtics, C. deserticola va mostrar una funció beneficiosa per a la millora de la força renal. Es va trobar que la MTC, tradicionalment utilitzada per vigoritzar i mantenir l'essència renal, s'utilitzava habitualment per tractar l'osteoporosi, tant in vitro com in vivo, les dades publicades havien demostrat l'activitat antiosteoporòtica de C. deserticola [20–23] i els constituents de glicòsids feniletanoides, inclosos l'equinacòsid i l'acteòsid són els principals components bioactius que existeixen en aquesta planta medicinal comestible; tot això va suggerir que no només l'echinacòsid i l'acteòsid, sinó també altres components de glicòsid feniletanoide continguts a C. deserticola es consideraven responsables de la propietat antiosteoporòtica d'aquesta herba. En el nostre estudi actual, es va utilitzar una resina macroporosa de seguretat favorable per aïllar i enriquir la fracció de glucòsid feniletanoide de C. deserticola, i mitjançant el mètode HPLC, vuit components principals de glucòsid feniletanoide, és a dir, acteòsid F, equinacòsid, cistàsid A, acteòsid, isoacteòsid, acteòsid C, 2'-acetilacteòsid i 6'-acetilacteòsid, es van trobar a la fracció de glucòsid feniletanoide aïllat, i el contingut era del 3,6 per cent, 8,8 per cent, 5,0 per cent, 13,3 per cent, 3,3 per cent, 3,9 per cent, 3,9 per cent, 3,9 per cent. i 3,2 per cent, respectivament. L'echinacòsid, un dels compostos d'activitat principals registrats a C. deserticola [14], s'havia demostrat que posseïa activitat antiosteoporòtica; tanmateix, la dosi de 270 mg/kg era tan alta que va limitar la seva aplicació clínica posterior [24]. En els experiments actuals, es va utilitzar la fracció total de glicòsids feniletanoides amb una dosi més baixa de 60-240 mg/kg de pes corporal/dia en rates OVX, i el contingut dels components identificats eren gairebé el 50% pur en aquesta fracció mitjançant l'ús. el mètode HPLC.
Era ben sabut que l'OVX pot causar osteoporosi, i es creia que una rata OVX era un model clàssic i adequat per simular l'osteoporosi postmenopàusica humana. Al mateix temps, es va observar una disminució significativa de la densitat mineral òssia, la microarquitectura òssia trabecular, el pes humit uterí i vaginal i el nivell d'estrògens, així com la millora òbvia de la reabsorció òssia i el pes corporal, després de la cirurgia d'ovariectomia, de les quals es va observar en part a causa de la pèrdua d'estrògens [25]. Les nostres dades, fins ara, van demostrar clarament que l'OVX va induir efectivament l'osteoporosi postmenopàusica i sempre va acompanyada de la forta disminució de la qualitat òssia, la microarquitectura òssia i el pes humit de l'úter i la vagina. Com que l'EV és un agent de reemplaçament hormonal general que s'ha utilitzat en la pràctica clínica, es va utilitzar com a control positiu en el nostre experiment in vivo i el pes corporal guanyat i el pes de l'úter atròfia, així com la densitat mineral òssia deteriorada i la microarquitectura òssia trabecular. , s'esperava revertir amb la suplementació EV. A diferència del control positiu, la disminució del pes de la vagina i l'úter, així com el pes corporal sencer de les rates del grup del model OVX, no es van veure afectats pel tractament amb CDP, la qual cosa implicava que el CDP podria millorar la formació òssia sense induir els efectes secundaris. al cos i als teixits orgànics uterins. Tot i que els nivells d'ERR es van augmentar significativament pel tractament amb CDP, va ser com un efecte fitoestrògen que no es van observar efectes secundaris sobre els teixits orgànics de l'úter i la vagina. A més, el tractament de CDP va reforçar significativament la qualitat de l'os de les rates OVX que s'havien deteriorat per la cirurgia d'ovariectomia.
A més, els nivells de P i Ca a l'orina i sèrum de rates OVX també es van utilitzar per reflectir l'efecte antiosteoporòtic, i les concentracions de Ca i P inorgànic depenien generalment dels nivells de calcitonina i PTH [26]. En el present estudi, tot i que no es van obtenir tendències significatives de disminució o augment del nivell d'excreció urinària de Ca, sèric P, sèric Ca i PTH en rates del grup model OVX, els nivells urinaris significatius de P i calcitonina (p < {="" {1}})="" es="" van="" observar.="" d'acord="" amb="" les="" dades="" publicades="" que="" la="" deficiència="" d'estrògens="" causada="" per="" la="" cirurgia="" d'ovariectomia="" sempre="" va="" provocar="" una="" disminució="" del="" nivell="" de="" calcitonina="" a="" la="" sang,="" aquesta="" disminució="" de="" la="" calcitonina="" sèrica="" finalment="" va="" provocar="" un="" augment="" del="" nivell="" de="" pth,="" on="" es="" creia="" que="" el="" ca="" era="" el="" principal="" regulador="" de="" la="" secreció="" de="" pth.="" com="" que="" la="" concentració="" de="" pth="" no="" va="" mostrar="" cap="" diferència="" significativa="" entre="" els="" grups="" ovx="" i="" sham="" en="" el="" present="" estudi,="" el="" nivell="" de="" ca="" tant="" en="" sèrum="" com="" en="" orina="" tampoc="" no="" va="" mostrar="" canvis="" evidents="" entre="" els="" dos="" grups="" anteriors.="" tanmateix,="" es="" va="" obtenir="" una="" tendència="" significativament="" disminuïda="" en="" el="" nivell="" de="" calcitonina="" entre="" els="" grups="" ovx="" i="" sham="" i,="" en="" conseqüència,="" el="" contingut="" de="" p="" a="" l'orina="" d'ovx="" es="" va="" reduir="" de="" manera="" potent.="" creiem="" que="" les="" dades="" anteriors="" poden="" explicar="" el="" fenomen="" contradictori="" de="" per="" què="" l'excreció="" urinària="" del="" nivell="" de="" ca="" a="" les="" rates="" ovx="" no="" va="" mostrar="" cap="" canvi="" evident="" en="" comparació="" amb="" les="" rates="" sham,="" i="" aquest="" fenomen="" també="" pot="" estar="" relacionat="" amb="" l'augment="" de="" la="" taxa="" de="" rotació="" òssia="" [27]="" .="" després="" del="" tractament="" amb="" cdp,="" els="" nivells="" de="" p="" i="" ca="" al="" sèrum="" es="" van="" regular="" notablement,="" i="" el="" contingut="" de="" p="" a="" l'orina="" es="" va="" reduir="" a="" les="" rates="" ovx,="" cosa="" que="" reflectia="" que="" el="" cdp="" no="" només="" podria="" prevenir="" l'excreció="" d'elements="" minerals="" ossis,="" sinó="" que="" també="" podria="" millorar="" el="" contingut="" sèric="" d'aquestes.="" elements,="" suprimint="" així="" indirectament="" la="" pèrdua="">
A més, també es van utilitzar els marcadors de formació i reabsorció òssia, així com els enzims antioxidants, inclosos SOD i GSH, per explicar els mecanismes antiosteoporòtics subjacents de CDP. De manera similar a les dades publicades, el nivell d'ALP en rates del grup model OVX va mostrar una tendència creixent no estadísticament significativa que indica una taxa accelerada de renovació òssia en l'osteoporosi postmenopàusica [10]. Tanmateix, després del tractament amb CDP (60, 120 i 240 mg/kg/dia), la propietat de l'ALP es va millorar significativament. Era ben sabut que l'OVX va provocar un fort descens dels nivells d'estrògens que generalment condueix a una reabsorció òssia i estrès oxidatiu excedits [28], evidenciat pels nivells de TRAP, catepsina K i DPD, així com MDA notablement regulats a les rates del Grup de models OVX. Tanmateix, aquests deterioraments es van millorar en part amb la intervenció del CDP. A més, el tractament de rates OVX amb CDP (60 i 240 mg/kg) va demostrar un augment significatiu de l'activitat de GSH (p <{8}}). els="" resultats="" anteriors="" van="" implicar="" que="" cdp="" va="" mostrar="" un="" efecte="" terapèutic="" sobre="" l'osteoporosi="" induïda="" per="" ovx="" i="" aquests="" efectes="" van="" ser="" tant="" per="" millorar="" la="" formació="" òssia="" com="" per="" suprimir="" la="" reabsorció="" òssia,="" així="" com="" per="" millorar="" el="" sistema="" antioxidant="">
L'activació de RANK pel seu lligand RANKL va estimular les expressions de NFAT2 i c-Fos mitjançant la senyalització PI3K/AKT i NF-κB [29]. NF-κB es va demostrar que és essencial per a l'osteoclastogènesi, ja que la interrupció de NF-κB podria conduir a una alteració de la diferenciació dels osteoclasts amb un fenotip osteoporòtic, i NF-κB va augmentar la c-Fos i les expressions NFAT2 regulades a la baixa durant l'osteoclastogènesi induïda per RANKL/RANK/TRAF. Per estimar la influència beneficiosa del CDP en l'osteoclastogènesi mediada per NFAT2 i c-Fos, es van analitzar els nivells d'expressió de RANKL i RANK. S'esperava, el CDP va inhibir significativament NFAT2 i va estimular els nivells de c-Fos regulant a la baixa les expressions de RANKL i RANK. Mentrestant, el propi RANK no tenia propietats intrínseques de quinasa tret que s'unís per TRAF6 per activar la senyalització aigües avall [3]. CDP també va reduir l'expressió de TRAF6, cosa que va provocar que les quantitats d'unió de RANKL i RANK es reduïssin significativament. Un hipotetitzat mecanisme antiosteoporòtic de CDP en rates OVX cobria les vies de senyalització anteriors, i els reguladors es van descriure a la figura 9. Concisament, CDP va disminuir els nivells de TRAF6, RANKL i RANK, suprimint així les vies de senyalització aigües avall, incloent PI3K/AKT i NF-κB que són activats per RANKL/RANK i, finalment, van reduir les expressions i activitats de les proteïnes osteoclastogèniques clau NFAT2 i c-Fos. Per tant, múltiples pistes de dades van implicar l'efecte beneficiós del CDP sobre el metabolisme ossi de rates OVX principalment a través de les vies PI3K/AKT i NF-κB mediades per RANKL/RANK/TRAF6-.
5. Conclusió
En resum, els glucòsids feniletanoides totals, aïllats de C. deserticola, van mostrar efectes beneficiosos significatius sobre l'osteoporosi postmenopàusica de rates OVX, i el potencial terapèutic per suprimir la pèrdua òssia va ser principalment mitjançant l'estimulació de la formació òssia i la inhibició de la reabsorció òssia, així com la millora de l'antioxidant ossi. sistema; els mecanismes poden estar relacionats amb l'activació de NF-κB induïda per RANKL/RANK/TRAF{0}} i la inactivació de PI3K/AKT, així com l'estimulació de c-Fos i la supressió de NFAT2 i, finalment, es va inhibir la diferenciació dels osteoclasts.
Abreviatures
AKT: Proteïna quinasa B
ALP: fosfatasa alcalina
BGP: proteïna GLA òssia
BMC: Contingut mineral ossi
CDP: fracció glicòsid feniletanoide de C. deserticola
CK: Cathepsin K
TC: calcitonina
DPD: desoxipiridinolina
ERR: receptor alfa relacionat amb estrògens
EV: valerat d'estradiol
GSH: Glutatió l-PTH: parathormona intacta
MCSF: factor estimulant de colònies de macròfags
MDA: malondialdehid
NFAT2: Factor nuclear de cèl·lules T activades c2
NF-κB: factor nuclear-kappa B
OPG: Osteoprotegerina
OVX: Ovariectomitzat
PhGs: glucòsids feniletanoides
PI3K: fosfoinosítid 3-quinasa
RANG: activador del receptor del factor nuclear kappa B
RANKL: Activador del receptor del factor nuclear-kappa
Lligand B ROI: Regió d'interès
SOD: Superòxid dismutasa
Tb. N: Número trabecular
Tb.Sp: Separació trabecular
Tb.Th: Gruix trabecular
MTC: Medicina tradicional xinesa
TMC: Contingut mineral del teixit
TMD: densitat mineral dels teixits
TNF: factor de necrosi tumoral
TRAF6: factor 6 associat al receptor del factor de necrosi tumoral
TRAMP: Fosfatasa àcida resistent als tartrats.
Disponibilitat de dades
Les dades utilitzades per donar suport a les conclusions d'aquest estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició.
Conflictes d'interès
Els autors no tenien cap conflicte d'interessos.
Aportacions dels autors
XM va dissenyar i supervisar els experiments; SD i LY van realitzar la majoria dels experiments i van redactar el manuscrit; BZ i JL van realitzar l'anàlisi de Western blot i van participar en experiments amb animals; YD va analitzar les dades; QT i PY van revisar el manuscrit. Tots els autors van revisar el manuscrit. Lingling Yang i Shuqin Ding van contribuir per igual al manuscrit.
Agraïments
Aquest treball va comptar amb el suport de subvencions de la Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), la National Natural Science Foundation of China (núm. 81560684), el Key Research and Development Program de Ningxia (2018BHF2001), la Ningxia Key Research i Programa d'Invenció de Cooperació Científica i Tecnològica d'Orient i Occident (núms. 2017BY084 i 2017BY079) i la Fundació West Light de l'Acadèmia Xinesa de Ciències-Joves Científics de l'Oest 2017.
Referències
[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane i BL Riggs, "Perspectiva. Quantes dones tenen osteoporosi?", Journal of Bone and Mineral Research, vol. 7, no. 9, pàgines 1005–1010, 1992.
[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham i SL Kates, "The 1-year mortality of patients treated in a hip fracture program for ancians", Geriatric Orthopaedic Surgery & Rehabilitation, vol. 1, no. 1, pàgs. 6–14, 2010.
[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew i EL Yong, "TRAF6 media la supressió de l'osteoclastogènesi i la prevenció de la pèrdua òssia induïda per ovariectomia per un nou prenilflavonoide", Journal of Bone and Mineral Research, vol. 32, núm. 4, pàg. 846–860, 2017.
[4] JH Kim i N. Kim, "Regulation of NFATc1 in osteoclast diferenciation", Journal of Bone Metabolism, vol. 21, núm. 4, pàgines 233–241, 2014.
[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Activitat antiosteoporòtica i constituents de Podocarpium podocarpus", Phytomedicine, vol. 22, núm. 1, pàgines 94–102, 2015.
[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, et al., "L'àcid protocatecuic attenua la pèrdua d'os trabecular en ratolins ovariectomitzats", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, ID d'article 7280342, 11 pàgines, 2018.
[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, et al., "La rutina aïllada de Chrozophora tinctoria millora els marcadors de proliferació i ossificació de cèl·lules òssies", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, ID d'article 5106469, 10 pàgines, 2018.
[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon i T. Tong-un, "L'extracte de fulla de Morindacitrifolia L. protegeix contra la isquèmia cerebral i l'osteoporosi en un model experimental in vivo. de la menopausa", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, ID d'article 1039364, 13 pàgines, 2018.
[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura i W. Thukham-mee, "Efecte antiosteoporòtic d'un extracte combinat de Morus alba i Polygonum odoratum", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2014, ID d'article 579305, 9 pàgines, 2014.
[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao i X. Ma, "La siringina prevé la pèrdua òssia en ratolins ovariectomitzats mitjançant la inhibició de NF-κB mediada per TRAF6 i l'estimulació de PI3K/AKT. , "Fitomedicina, vol. 42, pàgines 43–50, 2018.
[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin i SJ Wang, "Echinacoside, un constituent actiu d'Herba Cistanche, suprimeix l'activitat epileptiforme a les neurones piramidals CA3 de l'hipocamp", The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, vol. 22, núm. 3, pàgines 249–255, 2018.
[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao i X. Ma, "Therapeutic effect of cistanoside A on bone metabolism of ovariectomized mouses", Molecules, vol. 22, núm. 2, pàg. 197, 2017.
[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan i MI Georgiev, "Verbascoside–a review of its occurrence, (bio)synthesis and pharmacological signification", Biotechnology Advances, vol. 32, núm. 6, pàgines 1065–1076, 2014.
[14] Comitè Editorial de la Farmacopea Xinesa, Pharmacopeia of the People's Republic of China, China Medical Science and Technology Press, Beijing, Xina, 10a edició, 2015.
[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li et al., "Efectes d'una preparació herbal tradicional xinesa sobre osteoblasts i osteoclasts", Maturitas, vol. 61, núm. 4, pàgs. 334–339, 2008.
[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong i Q. Zhao, "Cynomorium songaricum evita la reabsorció òssia en rates ovariectomitzades mitjançant la supressió de PI3K/AKT i RANKL/RANK/TRAF6 mediada per Vies NF-κB", Life Sciences, vol. 209, pàgines 140–148, 2018.
[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang, et al., "Kaempferitrin prevents bone loss in ovariectomized rates", Phytomedicine, vol. 22, núm. 13, pàgines 1159–1162, 2015.
[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang i YW Cheng, "Avaluació de la seguretat del producte alimentari de salut Cistanche tubulosa Memoregain®: prova de genotoxicitat i 28-dia de toxicitat a dosis repetides", Food and Chemical Toxicology , vol. 118, pàg. 581– 588, 2018.
[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng i F. Chen, "Una enquesta sistemàtica de l'activitat antioxidant de 30 plantes medicinals xineses utilitzant l'assaig de poder antioxidant reductor de fèrric", Food Chemistry, vol. 97, núm. 4, pàgines 705–711, 2006.
[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, et al., "El polisacàrid de Cistanche deserticola attenua l'osteoclastogènesi i la reabsorció òssia mitjançant la inhibició de la senyalització RANKL i la producció d'espècies reactives d'oxigen", Journal of Cellular Physiology, vol. 233, núm. 12, pàgines 9674–9684, 2018.
[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang i W. Liang, "Extracte aquós de Cistanches Herba que afecta BGP i TRAP sèrics i ARNm Smad1 de medul·la òssia, ARNm Smad5, ARNm TGF- 1 i TIEG1. Nivells d'expressió d'ARNm en la malaltia d'osteoporosi", Molecular Biology Reports, vol. 40, no. 2, pàgines 757–763, 2013.
[22] TM Li, HC Huang, CM Su et al., "L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la formació d'os en osteoblasts", Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol. 64, núm. 6, pàgines 897–907, 2012.
[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong i Z. Huang, "Effect of Cistanches Herba aqueous extract on bone loss in ovariectomized rate", International Journal of Molecular Sciences, vol. 12, núm. 8, pàgines 5060–5069, 2011.
[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, et al., "Activitat antiosteoporòtica de l'echinacòsid en rates ovariectomitzades", Phytomedicine, vol. 20, no. 6, pàgines 549–557, 2013.
[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian i LL Xu, "Activitat antiosteoporotic of icariin in ovariectomized rates", Phytomedicine, vol. 16, núm. 4, pàgines 320–326, 2009.
[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed i M. Marzouk, "Possible mecanisme antiosteoporòtic de Cicer arietinum extract in ovariectomized rates", International Journal of Clinical and Experimental Pathology, vol. 8, no. 4, pàgines 3477– 3490, 2015.
[27] R. Swaminathan, "Biochemical markers of bone turnover", Clinica Chimica Acta, vol. 313, núm. 1-2, pàgines 95–105, 2001.
[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., "L'ovariectomia indueix estrès oxidatiu i deteriora el sistema antioxidant ossi en rates adultes", Clinica Chimica Acta, vol. 360, núm. 1-2, pàg. 81–86, 2005.
[29] WJ Boyle, WS Simonet i DL Lacey, "Osteoclast diferenciation and activation", Nature, vol. 423, núm. 6937, pàgs. 337– 342, 2003.
