La calpastatina prevé la lesió dels podòcits mediada per l'angiotensina II mitjançant el manteniment de l'autofàgia
Mar 17, 2022
per a més informació:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joelle Pérez2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, Marine Camus1, Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1, He´le`ne Latzaret1, Emmanuel Letavernier2, Carole Hénique1,Pierre-Louis Tharaux1i Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, París, França; i2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, París, França
El fort valor predictiu de la proteinúria en les patologies glomerulars cròniques està fermament establert, així com el paper patogènic de l'angiotensina II que promou la progressió de la malaltia glomerular amb una barrera de filtració glomerular alterada, lesió dels podòcits i cicatrització dels glomèruls. Aquí vam trobar que la hipertensió crònica induïda per l'angiotensina II s'inhibeixautofàgiaeixida als glomèruls del ratolí. La supressió d'Atg5 (un gen que codifica una proteïna implicada en l'autofàgia) específicament al podòcit va donar lloc a una podocitopatia accelerada induïda per dangio tensina II, albuminúria accentuada i glomeruloesclerosi. Això indica que l'autofàgia és un mecanisme protector clau en el podòcit en aquesta condició. L'activitat de la calpaïna induïda per l'angiotensina II en els podòcits inhibeixautofàgiaefluència. Podòcits de ratolins amb expressió transgènica de l'inhibidor endògen de la calpaïnacalpastatinamostra un podòcit més altautofàgiainicial que era resistent a la inhibició dependent de l'angiotensina II. També, autofàgia sostinguda ambcalpastatinadany limitat als podòcits i albuminúria. Aquestes troballes suggereixen que la hipertensió té efectes patògens sobre l'estructura i la funció glomerular, en part a través de l'activació de calpains que condueix al bloqueig de l'autofàgia dels podòcits. Aquestes troballes descobreixen un mecanisme original pel qual la hipertensió mediada per l'angiotensina II inhibeix l'autofàgia mitjançant el reclutament de calpaina induït pel calci amb conseqüències patògenes en cas de desequilibri percalpastatinaactivitat. Així, evitant una disminució mediada per la calpainaautofàgiapot ser una nova estratègia terapèutica prometedora per a les nefropaties associades a una alta activitat del sistema renina-angiotensina.
PARAULES CLAU: angiotensina II;autofàgia; calpastatina; hipertensió; podòcit
Declaració translacional
Donat el paper crucial de l'autofàgia en el desenvolupament deronyómalalties, modulació farmacològica deautofàgiapodria ser una estratègia prometedora per a la prevenció i el tractament de diversosronyómalalties. Paral·lelament, es va trobar que la sobreactivació de l'activitat de la calpaïna en els podòcits té efectes perjudicials en la funció dels podòcits, mentre que no es van identificar els seus mecanismes d'acció nocius. Aquí, proporcionem proves que la calpaina vincula l'acció perjudicial de l'angiotensina II amb el bloqueig perjudicial deautofàgiaen podòcits i suggereixen que la inhibició de la calpaïna podria ser un objectiu terapèutic prometedor per a les malalties dels podòcits parcialment mitjançant el manteniment de l'autofàgia dels podòcits.
Feu clic aCistanche deserticola ma per a la malaltia renal crònica
La hipertensió és la segona causa principal de la crònica progressiva després de la diabetisronyóLa malaltia1–3 i fins i tot una elevació modesta de la pressió arterial és un factor de risc independent per a la malaltia renal en fase terminal.4 Un nombre creixent d'estudis experimentals han posat de manifest la importància dels podòcits en el desenvolupament deronyólesió. La pèrdua progressiva de podòcits i les alteracions microvasculars apareixen precoçment amb la disminució funcional del ronyó en la nefropatia hipertensiva experimental5. En pacients, l'excreció urinària de podòcits viables va ser un marcador sensible i específic de la preeclàmpsia6,7 i els pacients amb nefroesclerosi tenien menor densitat de podòcits glomerulars que no pasronyóA més, el paper patogènic de l'angiotensina II (AngII) promotor de la progressió de la malaltia glomerular està ben establert, no només en condicions hipertensives sinó també en diverses malalties glomerulars.10–21.
La hipertensió glomerular provoca un estirament capil·lar glomerular, dany endotelial i una filtració elevada de proteïnes glomerulars que provoca col·lapse glomerular i glomeruloesclerosi. També exerceix una acció directa sobre les estructures glomerulars, provocant respostes reguladores de senyalització destinades a compensar. Un sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) sistèmic i local activat fomenta la hiperplàsia mesangial i la síntesi de factors de permeabilitat vascular. Simultàniament, els podòcits mostren senyals de calci22,23 i modifiquen la seva forma amb l'estimulació dependent del receptor AngII tipus 1 (AT1).24–28 Aquests mecanismes adaptatius es tornen desadaptatius a llarg termini, i finalment condueixen a la glomeruloesclerosi. AT1 media la implicació destacada del RAAS per a la pressió arterial i l'homeòstasi de l'aigua i la sal. Els inhibidors de l'enzim convertidor d'angiotensina i els bloquejadors AT1 s'utilitzen clínicament per al tractament de la hipertensió i la insuficiència cardíaca en pacients. Curiosament, ambdós bloquejadors també mostren un efecte protectorronyófunció.
Es va demostrar que l'autofàgia és essencial per al manteniment de l'homeòstasi cel·lular, especialment en cèl·lules postmitòtiques29,30 i sobretot en podòcits.31–34.Autofàgiaés un sistema de degradació associat a lisosomals per a proteïnes citoplasmàtiques de llarga vida i orgànuls disfuncionals35,36 i implica el segrest de proteïnes i orgànuls en autofagosomes. La formació d'autofagosomes depèn de la inducció de diversos gens, inclosos Map1lc3a/b, Beclin 1 i Tags. 37 Hi ha una creixent evidència que la desregulació de la via autofàgica està implicada en la patogènesi de l'envelliment renal i en diversesronyómalalties com la lesió renal aguda, la malaltia renal poliquística, l'envelliment i la nefropatia diabètica.31,32,38–41.
Regulació deautofàgiaen podòcits, fisiològic i, sobretot, en un context patològic, no és ben conegut. Recentment hem demostrat que l'autofàgia dels podòcits és independent de l'objectiu mecanicista de la regulació de la rapamicina (mTOR) en condicions fisiològiques, fent d'aquest tipus de cèl·lules una excepció.42 L'activació d'AT1 estimula la síntesi de proteïnes i el recanvi de proteïnes a les cèl·lules. Així, vam raonar que l'activació del RAAS també pot influir en l'estimulació de la rotació de proteïnes i la proteòstasi.
En el present estudi, ens hem centrat en el paper de la senyalització AngII en el podòcitautofàgiaregulació. Hem identificat les proteases calpaïnes activades per calci que mediaven un efecte de bloqueig crònic de l'AngII en el podòcit.autofàgia. A més, vam trobar que l'inhibidor endògen de la calpaïnacalpastatinava poder prevenir la inhibició de l'autofàgia depenent de l'AngII i la lesió dels podòcits durant la hipertensió.
Aquestes troballes descobreixen un mecanisme original pel qual la hipertensió mediada per AngII inhibeixautofàgiamitjançant el reclutament de calpaïna induït pel calci amb conseqüències patògenes en cas de desequilibri per l'activitat de la calpastatina.
MÈTODES
Animals
CalpastatinaEls ratolins transgènics (CSTTg) van ser amablement proporcionats pel Dr. E. Letavernier.43 Els ratolins amb una interrupció específica del podòcit del gen Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) es van generar tal com es va descriure anteriorment31 encreuant ratolins Nphs2.cre44 amb Atg5lox/lox. mice45 al fons C57BL6/J. En aquest estudi es van utilitzar ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox i mascles de camada control, d'entre 10 i 12 setmanes. El model hipertensiu es va induir mitjançant la infusió sc d'AngII (Sigma-Aldrich, A9525) a una dosi d'1 mg/kg/min durant 4 a 6 setmanes mitjançant minibombes osmòtiques (Alzet Corp, model 2006). Es van implantar bombes sc a la part posterior entre els omòplats i els malucs. Els ratolins van rebre suplements de sal (3 per cent de NaCl) als aliments. Es van utilitzar ratolins Atg5lox/lox (de tipus salvatge [WT]) com a controls en tots els estudis. Per a la sal d'acetat de desoxicorticosterona (DOCA) amb el model de reducció de nefrona, els ratolins mascles adults es van sotmetre a una nefrectomia esquerra unilateral. Dues setmanes després de la nefrectomia, van rebre pastilles DOC amb el 21-dia de llançament (Innovative Research of America) implantat sc. Es va implantar un segon pellet 3 setmanes després del primer implant. Tots els ratolins van rebre un 0,9 per cent de NaCl a l'aigua potable ad libitum i van ser assassinats després de 6 setmanes d'administració de DOC.46 Els experiments es van dur a terme d'acord amb les directrius veterinàries franceses i les formulades per la Comunitat Europea per a l'ús d'animals d'experimentació (L358-86/ 609EEC) i van ser aprovats pel Ministeri de Recerca francès i el comitè d'ètica de la recerca de la universitat local (APAFIS-7646 i -22373).
Experiment de cultiu primari de podòcits
Es van cultivar podòcits primaris diferenciats tal com es va descriure anteriorment.47,48 Breument, l'escorça renal acabada d'aïllar es va barrejar i digerir per col·lagenasa I (Gibco, 17100-017) al Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). A continuació, els teixits es van passar a través de filtres cel·lulars de 70 mm i 40 mm (BD Falcon, 352340 i 352350). Els glomèruls, que s'adhereixen al colador de cèl·lules de 40 mm, es van eliminar amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS; Life Technologies, 10010023) + 0,5 per cent d'albúmina sèrica bovina (Eurobio, HALALB07-65) injectada a pressió i després es van rentar dues vegades. en PBS. Els glomèruls acabats d'aïllar es van placar en 6-plats de pou al Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) complementats amb un 10% de sèrum fetal de vedella i un 1% de penicil·lina/estreptomicina (Life Technologies, 15140122) per permetre que els podòcits surtin dels glomèruls. i créixer. L'enriquiment dels podòcits es va verificar mitjançant l'anàlisi Western blot tal com es va descriure anteriorment31,48,49 (figura suplementària S1). Els podòcits es van cultivar en absència o presència de bafilomicina A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) durant 4 hores. Per als experiments d'immunofluorescència, els podòcits primaris es van xapar en etiquetes de 4 plats (Dutcher, 055071). Els podòcits es van fixar en paraformaldehid al 4% durant 10 minuts i es van processar per a la immunofluorescència.
Assaig d'activitat de Calpain
L'activitat intracel·lular de la calpaïna es va determinar en podòcits primaris, tal com s'ha descrit anteriorment50–52. Es van cultivar un total de 100,000 cèl·lules en 24-plats de cultiu de teixits al Roswell Park Memorial Institute 1640 complementades amb un 10 per cent fetal. sèrum de vedella i 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina. Després del període de cultiu indicat, el medi es va substituir per una solució de bicarbonat HEPES (KRH) de Krebs-Ringer (pH 7,4) que contenia CaCl2 4 mM, amb o sense inhibidor de calpaïna 10 mM-1, i es va incubar durant 10 minuts abans de l'addició. de substrat de calpaïna 50 mM N-succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metil cumarina (Sigma-Aldrich, S6510). Després d'un 90-període d'incubació de minut, es va determinar l'activitat de la calpaïna com la diferència entre la fluorescència FL (mesurada a 360 nm d'excitació i 430 nm d'emissió) amb i sense inhibidor de calpaïna-1.
Western blot
Els podòcits primaris es van ratllar amb 8 0 ml de tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació que contenia fosfatasa i inhibidor de proteasa. La concentració de proteïnes es va mesurar amb el kit d'assaig de proteïnes BCA (Merck Biochemistry, 71285). Es van electroforitzar vint micrograms de proteïnes en gel prefabricat Criterion XT (12 per cent de Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Les proteïnes es van transferir a la membrana de difluorur de polivinilidè (Thermo Fischer Scientific, 88518). Després de bloquejar el 5% de llet en Tris Buffer Saline 0,1% Tween (TBS-T), les membranes es van incubar amb anti-LC3 policlonal de conill (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), anti-ATG5 policlonal de conill. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), conillet d'Índies policlonal anti-Sequestososome 1 (SQSTM1)/P62 (1:10.000, PROGEN, GP62), domini policlonal de conill anticalpaïna 1 IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), conill policlonal anti-calpaina 2 amino-terminal extrem del domini I (1:1000, Abcam, ab39165), ratolí monoclonal IgG1 anti-calpaina 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), conill antipodocina (1:1000, Abcam, ab50339), anticossos antinefrina de conillet d'índies (1:500, PROGEN, GP-N2) i anticòs monoclonal antitubulina de rata (1:5000, Abcam, ab6160). Després del rentat, les membranes es van incubar amb anticossos lligats a la peroxidasa de rave picant (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). La detecció de senyals específics es va realitzar mitjançant el kit quimioluminiscent ECL (Bio-Rad, 170-5070) al dispositiu LAS 4000 (Fuji). Per a la quantificació es va utilitzar l'anàlisi de densitometria amb el programari ImageJ (Instituts Nacionals de Salut).
Mesures de pressió arterial i valoracions fisiològiques
La pressió arterial sistòlica dels ratolins es va registrar mitjançant el mètode del puny de la cua (Visitech Systems Inc., BP-2000). Es van prendre deu mesures de cada ratolí i després es va determinar un valor mitjà. La pressió arterial sistòlica es va mesurar al principi (12 setmanes d'edat) i després setmanalment fins al final del període de tractament. Tots els ratolins es van col·locar en gàbies metabòliques amb accés lliure a l'aigua durant una recollida d'orina de 6-hores. Les concentracions de creatinina urinària i urea plasmàtica es van analitzar espectrofotomètricament mitjançant un mètode colorimètric (Olympus, AU400). L'excreció d'albúmina urinària es va mesurar mitjançant un assaig immunosorbent específic lligat a enzims per a la determinació quantitativa de l'albúmina a l'orina del ratolí (Crystal Chem, 80630).
Histologia
Ronyonses van collir i es van fixar en formalina tamponada amb PBS al 4%. Les seccions incrustades en parafina (3- mm de gruix) es van tacar amb l'stricrom de Masson per avaluar la morfologia del ronyó. Les anomalies als ronyons es van classificar en funció de la presència i la gravetat de les anomalies dels components, com ara la glomeruloesclerosi, l'expansió mesangial, l'atròfia o els guisos tubulars i la fibrosi. La proporció de glomèruls escleròtics es va avaluar mitjançant un examen cec d'almenys 50 glomèruls perronyósecció.
Tinció d'immunofluorescència de seccions de ronyó i podòcits primaris
Els podòcits primaris fixos es van bloquejar en TBS-T al 3 per cent d'albúmina sèrica bovina i es van incubar durant la nit a 4 graus amb anticossos primaris de conillet d'índies anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) i anti conill. -proteïna fluorescent FL verda (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Després dels esbandits de TBS-T, anticossos secundaris conjugats amb fluoròfor FL d'ase anti-conill d'Índies IgG AF594-anticòs conjugat (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) i anticossos conjugats de ruc anti-conill IgG AF{488-( Es va aplicar Invitrogen, A21206). Les imatges es van prendre amb un microscopi fluorescent Zeiss de 2 peus, una càmera AxioCam HRccamera i el programari Axiovision 4.3.
Per a parafina fixada en formalina (FFPE)ronyons, es van desparafinar i hidratar seccions (3 mm) i es va realitzar la recuperació d'antigen en tampó de citrat escalfat (pH 6). A continuació, es van permeabilitzar les seccions amb Tritó 0, 1% (Euromedex) i es van bloquejar en TBS-T al 3% d'albúmina sèrica bovina abans de la incubació d'anticossos durant la nit a 4ºC. Hem utilitzat anti-nefrina de cabra (1:100, PROGEN, GP). -N2), conillet d'índies anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), conill anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), cabra anti-podocalyxin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) i anticòs anti-Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) de conill. Els anticossos secundaris eren anticossos conjugats Alexa488– i Alexa 568– d'Invitrogen. Els nuclis es van tenyir de blau amb Hoechst. Les diapositives es van muntar amb un medi de muntatge fluorescent (Dako, S3023). Les microfotografies es van fer amb un fotomicroscopi Zeiss Axiophot i el programari Axiovision. Es van utilitzar quantificacions semiautomàtiques a Fiji per quantificar àrees positives per a la nefrina i PODXL per secció glomerular en almenys 30 glomèruls per ratolí. El podocytenumber es va comptar com el nombre de nuclis WT1+ per secció glomerular en almenys 30 glomèruls per ratolí.
Procediment de microscòpia electrònica de transmissió
Petits trossos de l'escorça renal (1 mm3) es van fixar en un grau de glutaraldehid al 3 per cent (ciències de la microscòpia electrònica) durant 1 a 3 0 dies i es van rentar tres vegades amb PBS. Les mostres es van fixar a l'1 per cent de tetròxid d'osmi 0, 1 M (Electron Microscopy Science) en 0, 1 M PBS (pH 7, 4) i es van rentar amb aigua. Les mostres es van deshidratar en graus d'alcohol i òxid de propilè al 100% (Electron Microscopy Science). La infiltració de resina es va realitzar de la següent manera: barrejar Epikote 812 i òxid de propilè en una proporció d'1:1 durant 30 minuts, seguit de barrejar Epikote 812 i òxid de propilè en una proporció d'1:2 per a la temperatura ambient durant la nit. Les mostres es van incrustar en càpsules de gelatina de 4 mm en Epikote 812 al 100 per cent i es van polimeritzar en un forn escalfat a 60 C. Es van tallar seccions ultrafines amb un ultramicròtom UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) i es van dipositar a Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Es van tacar amb acetat d'uranil al 7% (distribució LFG) i citrat de plom de Reynold (LFG). Les mostres es van examinar al microscopi electrònic de transmissió JEM1011 (JEOL) amb la càmera CCD Orius SC1000 (Gatan), operada amb el programari Digital Micrograph (Gatan) per a l'adquisició.
Malaltia renal de Cistanche
Matriu de reacció en cadena de la polimerasa quantitativa
Els glomèruls acabats d'aïllar es van congelar en el reactiu QIAzol Lysis (Qiagen) a -80 graus. L'extracció total d'ARN mitjançant el mètode basat en fenols es va processar segons les recomanacions del fabricant. Els cDNA es van sintetitzar mitjançant el kit RT2 First Strand (Qiagen, 330401) i es va realitzar una reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real mitjançant un Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) amb RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Les plaques de PCR quantitatives es van executar en un ciclador StepOnePlus d'Applied Biosystems. Cada matriu conté control de qualitat per a l'eficiència de la transcripció inversa i la contaminació de l'ADN genòmic. L'anàlisi quantitativa de PCR es va realitzar mitjançant el mètode 2-DDCT amb l'ajuda del Centre d'anàlisi de dades GeneGlobe (www. Qiagen.com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) i es va expressar com el canvi del plec Log2 en l'expressió gènica.
Anàlisi proteòmica in silico
La predicció in silico del lloc d'escissió de la calpaina es va fer amb DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) i CaMPDB (http:// calpain.org/) eines en línia. La seqüència d'aminoàcids de la proteïna del ratolí es va obtenir d'Uniprot (https://www.uniprot.org). Els resultats es resumeixen a les taules complementàries S1 i S2.
Anàlisis estadístics
Tots els gràfics representen valors individuals i mitjana ± SEM. Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el programari GraphPad Prism, versió 9. La comparació entre els 2 grups es va realitzar mitjançant una prova t parametricStudent quan les mostres passaven les proves de normalitat d'Anderson-Darling i D'Agostino i la prova F d'igualtat de variància. En cas contrari, es va utilitzar una prova de Mann-Whitney no paramètrica. La comparació entre diversos grups es va realitzar mitjançant l'anàlisi de la variància 1-manera o 2-manera seguida d'una prova de comparació múltiple amb la correcció de Simak. Els valors de P <0.05 es="" van="" considerar="" significatius.*p=""><0.05, **p=""><0,01, ***p=""><>
Figura 1|La hipertensió induïda per la dieta alta en sal (HSD) de l'angiotensina II (AngII) D inhibeix glomerularautofàgia. (a–c) Immunofluorescència de Podocalyxin (PODXL; vermell) i P62 (verd) en glomèruls (a,a0) de ratolins de tipus salvatge (WT), (b,b{0) de Ratolins WT després de 6 setmanes d'AngII + HSD, i (c,c0) de ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox que mostren l'acumulació de P62 en podòcits durant la hipertensió i en ATG{{1{{12} específics de podòcits }}}}ratolins deficients. Les puntes de fletxa indiquen punts P62 + en WT a (a0). Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Les subparts de la figura amb primer indiquen un augment més elevat. Barres=50 mm. ( d ) Quantificació associada de l'àrea P62 + expressada com el percentatge de l'àrea glomerular. n=4 ratolins WT i n=5 WT amb AngII þ HSD i ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Prova de Mann-Whitney: *P=0.0159. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.ronyó-international.org.
RESULTATS
La hipertensió induïda per la dieta alta en sal AngII D va inhibir l'autofàgia dels podòcits
Els podòcits presenten un alt nivell deautofàgiain vivo, tal com mostra una forta expressió de GFP en ratolins transgènics amb fusió de GFP a LC3 (ratolins GFP-LC3), un marcador clau de l'autofàgia (figura suplementària S2A). L'autofàgia és un procés dinàmic amb formació constant d'autofagosomes i degradació d'autofagolisosomes. El bloqueig de la degradació autofagosòmica amb cloroquina va donar lloc a l'acumulació de punts GFP +, cosa que indica un alt flux autofàgic als podòcits (figures suplementàries S2A i B). La confirmació que els punts GFP+ eren autofagosomes es va demostrar mitjançant una doble fluorescència immuno-FL per a GFP i SQSTM1/P62, una proteïna de chaperona degradada perautofàgia(Figura suplementària S2C i D). De nou, el tractament amb cloroquina va induir l'acumulació de punts GFP + P62 +, demostrant un flux autofàgic important als podòcits. Finalment, es va conservar un flux autofàgic elevat in vitro, tal com es mostra amb l'expressió GFP i P62 en podòcits primaris aïllats de ratolins GFP-LC3 i una forta acumulació de punts GFP i P62 þ sota tractament amb bafilomicina A1, un altre bloquejador de la degradació autofagosòmica (figura suplementària S2E-H) .
A continuació, es va avaluar la capacitat de la hipertensió per modular les respostes autofàgiques dels podòcits en ratolins infusionats amb AngII amb una dieta alta en sal (HSD) durant 6 setmanes i en controls no hipertensos. Com es mostra a la figura 1, AngII + HSD va induir l'acumulació de P62 als glomèruls amb una forta acumulació en podòcits, cosa que suggereix que AngII + HSD era responsable del podòcit.autofàgiabloqueig (figura 1a–d). Curiosament, l'acumulació de P62 als podòcits va ser similar a la observada en ratolins amb deficiència d'autofàgia de podòcits (ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox). En un altre model d'hipertensió, el model DOC-sal, també vam observar una acumulació progressiva de P62 als podòcits al llarg del temps de la malaltia (figura suplementària S3).
La supressió d'Atg5 específicament als podòcits provoca un augment de l'albuminúria, pèrdua de podòcits i lesió glomerular en el model AngII D HSD
Després vam examinar siautofàgiael bloqueig només en podòcits (ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox) afecta la lesió glomerular en el model AngII + HSD. Primer vam confirmar que Nphs2. cre Atg5lox/lox ratolins tenien pressió arterial normal, normalronyófunció i no hi ha lesions histològiques glomerulars fins als 10 mesos d'edat, com s'ha informat anteriorment (figura suplementària S4).32 Després, Atg5lox/lox (WT) i Nphs2. Els ratolins cre Atg5lox/lox es van infondre amb AngII amb HSD durant 6 setmanes. És important destacar que la pressió arterial sistòlica va ser similar als 2 grups després de la infusió d'AngII durant el curs de l'estudi (figura 2a), tot i que el mètode del puny de la cua utilitzat per mesurar la pressió arterial podria no tenir la capacitat de resoldre petites diferències de pressió arterial. La infusió d'AngII amb HSD va augmentar notablement la proporció d'albúmina urinària a creatinina en ratolins WT, i aquest efecte es va augmentar encara més significativament en els ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox (figura 2b). Els ratolins hipertensos Nphs2.cre Atg5lox / lox també van mostrar un augment significatiu de l'esclerosi glomerular en comparació amb els companys de camada WT (figura 2c–e). D'acord amb la proteinúria mesurada, els motlles proteïnes i la dilatació tubular eren significativament més freqüents en ratolins amb deficiència de podòcits a ATG5 (figura 2f-h).
Figura 2|La supressió d'Atg5 específicament als podòcits provoca un augment significatiu de l'albuminúria,ronyólesió i pèrdua de podòcits després de 6 setmanes d'infusió d'angiotensina II (AngII) dieta alta en sal (HSD). ( a ) Pressió arterial sistòlica en ratolins Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox durant 36 dies d'AngII + HSD. n=9 ratolins per genotip. Els valors es presenten com a mitjana ± SEM. Anàlisi bidireccional de la variància (ANOVA): ns. A (b–m), n=10 ratolins per genotip. A (b, g, h, k), els valors es presenten com a diagrames individuals i la mitjana ± SEM. (b) AngII + HSD (continuació)
Figura 2|(continuació) va provocar un augment espectacular de l'albumínúria a Nphs2. cre Atg5lox/lox ratolins en comparació amb els ratolins de control Atg5lox/lox. ANOVA bidireccional: genotip, P=0.013; temps, P=0.0018. ( c – f ) Imatges representatives de les seccions de glomèruls tenyides de tricrom de Masson del control Atg5lox / lox i els ratolins Nphs2.cre Atg5lox / lox després de 6 setmanes de AngII + HSD. Barres=50 mm en (c,d). Barres=100 mm en (e,f). (g,h) Comparació (g) de la proporció de glomèruls escleròtics i (h) del nombre de motlles tubulars per camp microscòpic. Prova de Mann-Whitney: **P=0,0026 in (h), ***P{=0,0003 in (g). (i, j) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió del tumor de Wilm 1 (WT1; vermell) i Podocalyxin (PODXL; verd) en glomèruls de control Atg5lox/lox i ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox després d'AngII + HSD durant 6 setmanes. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barres=50 mm. ( k ) Quantificació del nombre de cèl·lules WT1+ per secció glomerular. Prova de Mann-Whitney: **P=0,0029 in (l,m). Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de CD44 (verd) en glomèruls de control Atg5lox/lox i ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox després d'AngII + HSD durant 6 setmanes. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barres=50 mm. (n, o) Fotomicrografies representatives de microscòpia electrònica de transmissió de seccions de glomèruls de control Atg5lox/lox i ratolins Nphs2.cre Atg5lox/lox després de AngII + HSD durant 6 setmanes, que mostren l'esborrament del procés del peu del podòcit (punts de fletxa) en Nphs2 hipertens. cre Atg5lox/lox ratolins. Barres=1 mm. n=3 ratolins per genotip. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.kidney-international.org.
Figura 3|Expressió i activitat de la calpaïna en podòcits. (a) Anàlisi Western blot de l'expressió de calpain-1, calpain-2 i calpain-4 en podòcits primaris. L'expressió de tubulina serveix com a normalització. ( b ) L'activitat de la calpaina es va mesurar en podòcits primaris tractats o no tractats amb angiotensina II (AngII; 100 nM) durant 24 hores amb o sense calpeptina (10 mM). n=5 experiments independents. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA): tractament, P=0.0035. Prova de comparació múltiple de Sidak: *P=0,0128 per a AngII versus la línia de base, ##P{=0,0056 per a AngII + calpeptina versus AngII. ( c ) L'activitat de Calpain es va mesurar en podòcits primaris de tipus salvatge (WT) ocalpastatinaratolins transgènics (CSTTg) tractats o no tractats amb AngII (100 nM) durant 24 hores. n=7 experiments independents. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. ANOVA bidireccional aparellat per al tractament: genotip, P=0.0483. Prova de comparació múltiple de Sidak: ***P=0,0009 per a WT AngII versus la línia de base, *P=0,0420 per a CSTTg AngII versus la línia de base, #P{=0,0424 per a WT versus CSTTg AngII. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.ronyó-international.org.
El nombre de podòcits per glomèrul va disminuir significativament a Nphs2. Cre Atg5lox/lox ratolins tractats amb AngII + HSD (figura 2i–k). La lesió de podòcits en ratolins Nphs2.cre Atg5lox / lox amb infusió d'AngII + HSD fins i tot va progressar cap a glomerulosclerosi focal i segmentària, tal com es mostra amb l'expressió del marcador d'activació de cèl·lules epitelials parietals (PEC) CD44 als glomèruls (figura 2l i m). L'anàlisi de microscòpia electrònica va identificar canvis significatius associats a la deficiència d'ATG5 després de la infusió crònica d'AngII amb HSD, inclosa l'esborrament del procés del peu en Nphs2 hipertens. cre Atg5lox/lox ratolins. Per contra, es van trobar pocs defectes ultraestructurals en podòcits de ratolins WT fins i tot després de 10 setmanes d'infusió d'AngII amb HSD (figura 2n i o), cosa que indica que l'activitat autofàgica dels podòcits és necessària per a la seva resistència al dany induït per AngII + HSD. En conjunt, els nostres resultats van indicar que en el model AngII + HSD,autofàgiala inhibició agreuja la lesió i la pèrdua dels podòcits i indueix una glomeruloesclerosi focal i segmentària posterior.
AngII D HSD activa l'activitat de la calpaïna als podòcits que contribueix al bloqueig de l'autofàgia
Com que es va trobar que l'activitat de la calpaïna (i) estava activada per AngII en diversos tipus de cèl·lules i (ii) escindia diversosautofàgiaproteïnes relacionades53, ens vam preguntar si el bloqueig de l'autofàgia mediat per AngII + HSD podria atribuir-se a l'augment de l'activitat de la calpaïna induïda per AngII. Primer vam trobar que els podòcits primaris expressaven les 3 formes omnipresents de calpains (figura 3a). Aleshores vam demostrar que AngII estimulava l'activitat de la calpaïna en podòcits primaris. Aquest augment de l'activitat de la calpaïna va ser bloquejat per un inhibidor selectiu de la calpaïna (figura 3b). Vam utilitzar un ratolí de trucada amb addicionalscalpastatinaexpressió transgènica (que condueix a una disminució de l'activitat de la calpaïna)43 per avaluar el paper de les calpaïnes en AngII + mediada per HSDronyólesions i bloqueig de l'autofàgia. Els podòcits primaris dels ratolins CSTTg van mostrar una disminució de l'activitat de la calpaïna en resposta a AngII en comparació amb els podòcits dels ratolins control (figura 3c). Així,calpastatinaLa sobreexpressió en podòcits va disminuir l'activació de la calpaïna mediada per AngII.
A continuació hem avaluatautofàgianivells en podòcits de ratolins CSTTg. Hem generat ratolins CSTTg amb el transgen GFP-LC3. El reporter LC3-GFP va permetre comptar els autofagosomes com a punts GFPþ/P62þ. El P62 s'acumularà en agregats a les cèl·lules quan es bloqueja l'eflux autofàgic. A l'estat basal, vam comptar menys punts GFP + P62 + (figura 4a, b i e) i menys acumulació de P62 (figura 4c, d i f) en podòcits de ratolins CSTTg GFP-LC3 que en podòcits de ratolins GFP-LC3 normals. , cosa que suggereix un augment de l'eflux autofàgic en podòcits de ratolins amb una gran abundància de calpastatina.
Figura 4|Avaluació de l'eflux autofàgic en podòcits decalpastatinaratolins transgènics (CSTTg). ( a, b ) Imatges representatives d'immunofluorescència de l'expressió de la proteïna fluorescent FL verda (GFP) (verd) i P62 (vermell) als glomèruls de ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 de 12- setmanes d'edat. Les puntes de fletxa indiquen autofagosomes GFP + P62 +. ( c, d ) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de P62 (verd) i Podocalyxin (PODXL; vermell) en glomèruls de ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 de 12- setmanes d'edat. Les subparts de la figura amb primer indiquen un augment més elevat. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barres=50 mm. ( e ) Quantificació del nombre de punts LC3 + P62 + per podòcit. Prova de Mann-Whitney: **P= 0,0065. (f) Quantificació de l'àrea P62+ per secció glomerular. Prova de Mann-Whitney: *P=0.0420. A (e,f), n=5 ratolins GFP-LC3 i n=8 ratolins CSTTg GFP-LC3. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.ronyó-international.org.
L'eflux autofàgic es pot controlar mitjançant la mesura de la conversió de la forma citoplasmàtica de LC3, LC3-I, a la forma autofagosòmica escindida i acoblada a fosfatidiletanolamina de LC3, LC3-II, a la Western blot . Els podòcits de ratolins CSTTg van mostrar un augment de la conversió de LC3-I a LC{3-II i una disminució de l'expressió de P62, tant en presència com en absència de bafilomicina A1 (figura 5a i b), cosa que indica un augment de l'eflux autofàgic en podòcits amb sobreexpressió de calpastatina. Finalment, l'acumulació de punts GFP + P62 + als podòcits després de l'administració de cloroquina va ser més important en els ratolins CSTTg GFP-LC3 que en els ratolins GFP-LC3, confirmant així quecalpastatinaLa sobreexpressió indueix un eflux autofàgic en podòcits in vivo (figura 5c–e). En conjunt, les nostres dades suggereixen que AngII estimula l'activitat de la calpaïna als podòcits, aixòautofàgiaés inhibida per la calpaina als podòcits, i que la inhibició de l'activitat endògena de la calpaïna per la sobreexpressió de la calpastatina és suficient per estimular l'eflux autofàgic en els podòcits.
Els ratolins CSTTg estan protegits de la lesió de podòcits induïda per AngII D HSD
Els ratolins CSTTg no van mostrar capronyóalteració fins als 12 mesos d'edat com a mínim (figura suplementària S5). Es va analitzar la lesió de podòcits en ratolins CSTTg durant el tractament amb AngII + HSD. Tot i que els ratolins WT van desenvolupar una glomeruloesclerosi lleu i una lesió dels podòcits després de 4 setmanes d'hipertensió, tal com mostra l'expressió anormal de podocalyxina i nefrina, els ratolins CSTTg van presentar menys lesions glomerulars escleròtiques (figura 6a i b) i van conservar l'expressió de podocalyxina i nefrina -h (figura 6a) . Aquestes diferències en el fenotip del podòcit es van observar en una etapa en què la densitat dels nuclis del podòcit no era diferent entre els ratolins WT i els hipertensos CSTTg (figura 6i-k).
Figura 5|El bloqueig de la degradació autofagosòmica va confirmar un augment de l'eflux autofàgic dels podòcitscalpastatinaratolins transgènics (CSTTg). ( a ) Anàlisi de Western blot de l'expressió de LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1) / P62 i ATG5 en podòcits primaris de ratolins de tipus salvatge (WT) o CSTTg. L'expressió de tubulina serveix com a normalització. Els podòcits es van tractar o no amb bafilomicina A1 (BafA1; 100 nM) durant 4 hores abans de la detenció del cultiu. (b) Quantificació de les relacions LC{{10}}II/tubulina i P62/tubulina. n=10 ratolins WT i n=8 ratolins CSTTg. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Anàlisi bidireccional de la variància aparellada per al tractament: per a LC3-II/tubulina: genotip, P=0.{{30}}008; tractament, P <0,0001; per="" a="" p62/tubulina:="" genotip,="" p="0.0884;" tractament,="" p=""><0,0001. prova="" de="" comparació="" múltiple="" de="" sidak:="" per="" a="" lc3-ii/tubulina:="" ***p=""><0,0001 per="" wt="" més="" bafa1="" versus="" wt="" +="" bafa1,="" ***p=""><0,0001 per="" csttg="" més="" bafa1="" versus="" csttg="" +="" bafa1,="" ##p{="" {34}},0028="" per="" a="" wt="" +="" bafa1="" versus="" csttg="" +="" bafa1;="" per="" a="" p62/tubulina:="" ***p=""><0,0001 per="" a="" wt="" més="" bafa1="" versus="" wt="" +="" bafa1,="" ***p=""><0,0001 per="" a="" csttg="" més="" bafa1="" versus="" csttg="" +="" bafa1.="" (="" c,="" d="" )="" imatges="" d'immunofluorescència="" representatives="" de="" l'expressió="" de="" la="" proteïna="" fluorescent="" fl="" verda="" (gfp;="" verd)="" i="" p62="" (vermell)="" als="" glomèruls="" de="" ratolins="" gfp-lc3="" i="" csttg="" gfp-lc3="" d'12-="" setmanes="" d'edat.="" les="" subparts="" de="" la="" figura="" amb="" primer="" indiquen="" un="" augment="" més="" elevat.="" els="" nuclis="" es="" van="" tacar="" amb="" hoechst="" (blau).="" barres="50" mm.="" els="" ratolins="" van="" ser="" tractats="" amb="" cloroquina="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" hores="" abans="" de="" matar.="" les="" puntes="" de="" fletxa="" indiquen="" autofagosomes="" gfp="" +="" p62="" +.="" (="" e="" )="" quantificació="" del="" nombre="" de="" punts="" lc3="" +="" p62="" +="" per="" podòcit.="" n="5" ratolins="" per="" genotip.="" els="" valors="" es="" presenten="" com="" a="" gràfics="" i="" mitjanes="">±SEM. Prova t no aparellada amb SD igual: *P=0.0302. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.ronyó-international.org.
Figura 6 |CalpastatinaLa sobreexpressió prevé la lesió dels podòcits mediada per la dieta alta en sal (HSD) d'angiotensina II (AngII). ( a, b ) Imatges representatives de les seccions de glomèruls tenyides de tricrom de Masson de ratolins de tipus salvatge (WT) i transgènics de calpastatina (CSTTg) després de 6 setmanes d'AngII + HSD. Barres=50 mm. (c, d, f, g) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de (c, d) Podocalyxin (PODXL) i (f, g) nefrina (NPHS1) en ratolins WT i CSTTg després de 6 setmanes d'AngII + HSD i (e ,h) quantificacions associades. Barres=50 mm. ( i, j ) Imatges representatives d'immunofluorescència de l'expressió del tumor de Wilm 1 (WT1; verd) i PODXL (vermell) en glomèruls de ratolins WT i CSTTg després de 6 setmanes d'AngII + HSD i (k) quantificació associada del nombre de WT1 + cèl·lules per secció glomerular. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barres=50 mm. A (e,h,k), els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. n=9 ratolins WT i n=7 ratolins CSTTg. Prova t no aparellada amb SD igual: **P=0,0095 in (e), *P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k). Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.ronyó-international.org.
De la mateixa manera, després de 6 setmanes d'hipertensió, els ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 van presentar lesions de podòcits, però les lesions eren més destacades en els ratolins GFP-LC3 (figura 7). La relació albúmina-creatinina urinària va ser més alta en els ratolins GFP-LC3 després de 4 setmanes d'AngII + HSD (figura 7a). El nombre de podòcits no va ser diferent entre els 2 genotips, però l'expressió de nefrina es va reduir significativament més en els ratolins GFP-LC3 (control) (figura 7b-e). Correlacionant ambcalpastatina-protecció mediada, l'anàlisi ultraestructural va mostrar un esborrament lleu i focal del procés del peu del podòcit en ratolins GFP-LC3 tractats amb AngII + HSD amb una millor preservació de l'esborrament del procés del peu en ratolins CSTTg, tot i que la quantificació global del nombre de processos del peu per soterrani glomerular La longitud de la membrana (GBM) no va ser estadísticament diferent, probablement perquè la lesió dels podòcits és focal i segmentària al nostre model (figura 7f-h). Cal destacar la infiltració de macròfags i limfòcits Tronyonsno eren diferents entre els grups (figura suplementària S6). En conjunt, aquests resultats ho demostrencalpastatinava prevenir la lesió de podòcits induïda per AngII + HSD.
La sobreexpressió de calpastatina restaura l'eflux autofàgic en podòcits de ratolins després del tractament amb AngII D HSD
Finalment, ens vam preguntar sicalpastatinaLa protecció glomerular mediada en el model AngII + HSD implicava el manteniment de l'autofàgia en els podòcits. Curiosament, l'acumulació de P62 induïda per AngII + HSD als podòcits es va prevenir en ratolins CSTTg i GFP-LC3 CSTTg (figura 8a-d), cosa que indica que la calpastatina va impedir el bloqueig del podòcit.autofàgia. Cal destacar que el nombre d'etiquetatge de punts GFP + P62 + d'autofagosomes va ser similar en podòcits de ratolins hipertensos GFP-LC3 i GFP-LC3 CSTTg, cosa que suggereix que AngII + HSD va induir una desacceleració de l'eflux autofàgic del podòcit en lloc d'una aturada completa (Figura 8e-). g).
Predicció in silico del lloc d'escissió de la calpaïna a les proteïnes dels podòcits
Hem utilitzat diverses eines in silico per predir objectius potencials de calpaïna en podòcits (taules complementàries S1 i S2). Es van comparar tres bases de dades en línia: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 i DeepCalpain.56 L'anàlisi in silico va identificar diverses proteïnes de podòcits, entre elles nefrina i podocina, que podien ser escindides per calpains. Així,calpastatinaLa protecció glomerular mediada es podria relacionar amb una reducció de l'activitat enzimàtica de la calpaïna, la qual cosa condueix a una degradació reduïda d'algunes proteïnes podòcits.
A més, almenys 3autofàgia-Les proteïnes relacionades són dianes directes de les calpaines. L'ATG5 és escindit per les calpaines, provocant una alteració en la formació del complex ATG12-ATG5.57,58 L'administració d'inhibidors de la calpaïna in vivo també va impedir la divisió de la proteïna autofàgica Beclin-1.59 L'anàlisi in silico de el lloc de divisió putatiu de les proteïnes relacionades amb l'autofàgia dóna suport a la hipòtesi que la calpaina podria regular l'autofàgia mitjançant la divisió enzimàtica de les proteïnes de l'autofàgia.
Cistanche-funció renal
Expressió d'ARNm del reticle endoplasmàtic (ER) i marcadors d'estrès oxidatiu en glomèruls de ratolins tractats amb AngII més HSD
Es va avaluar l'estrès del reticle endoplasmàtic (ER) i l'estrès oxidatiu mitjançant PCR quantitativa en glomèruls durant el tractament amb AngII + HSD (taula 1). Al principi, no vam observar cap canvi en l'expressió d'ARNm dels gens analitzats en glomèruls de ratolins WT i Nphs2.cre Atg5lox/lox (figura suplementària S7). Després de 6 setmanes d'hipertensió, glomèruls de Nphs2. Els ratolins cre Atg5lox/lox van mostrar un perfil d'ARNm diferent dels gens de l'estrès ER i les vies d'estrès oxidatiu amb una expressió més gran de Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 i Hsp90b1 en comparació amb els glomèruls WT, cosa que suggereix queautofàgial'esgotament dels podòcits va afavorir l'estrès ER induït per AngII + HSD i l'estrès oxidatiu. Per contra, els glomèruls dels ratolins CSTTg van presentar una regulació a la baixa de diversos gens de les vies d'estrès ER i d'estrès oxidatiu, així com una disminució de l'expressió d'alguns gens pro-apoptòtics (figura 9).
En conjunt, aquests resultats ho indiquencalpastatinaLa sobreexpressió podria prevenir la lesió glomerular reduint l'ER induït per AngII + HSD i l'estrès oxidatiu.
DISCUSSIÓ
En el present estudi, vam demostrar que en la hipertensió induïda per AngII + HSD, l'autofàgia dels podòcits està marcadament regulada. A més, els ratolins amb la supressió específica del podòcit d'Atg5 eren més propensos a la glomeruloesclerosi induïda per AngII + HSD i la pèrdua de podòcits, demostrant així queautofàgiaen podòcits prevé el desenvolupament de nefropatia hipertensiva, destacant el paper crític de l'autofàgia en la lesió dels podòcits induïda per AngII + HSD. Se sap poc sobre els estímuls extracel·lulars que regulen l'autofàgia cel·lular, i aquests resultats aporten llum sobre la regulació fisiopatològica de l'autofàgia dels podòcits per AngII.
En la majoria de les glomerulopaties humanes, l'esborrament del procés podòcit del peu és un segell distintiu de la lesió glomerular que condueix a la proteinúria. És probable que l'autofàgia tingui un paper essencial en el manteniment de la funció dels podòcits perquè aquestes cèl·lules diferenciades terminalment presenten altes taxes deautofàgiafins i tot en absència d'estrès. Un estudi anterior va demostrar que AngII promou l'autofàgia a través de la generació d'espècies reactives d'oxigen en una línia cel·lular de podòcits murins immortalitzada condicionalment. poc clar. A diferència d'aquest darrer estudi, hem utilitzat podòcits de cultiu primari murins que retenen l'expressió de podocina i nefrina i enfocaments in vivo i no línies cel·lulars murines. Confirmem informes anteriors que els podòcits postmitòtics presenten un nivell de constitució inusualment altautofàgia. La mesura de la quantitat augmentada de LC3-II després de l'estimulació d'AngII en presència o absència d'inhibidors lisosòmics és necessària per determinar si augmenta o bloqueja l'eflux autofàgic. Estudis anteriors han deixat de banda aquest fenomen.60
Figura 7 |CalpastatinaLa sobreexpressió prevé la lesió de podòcits mediada per la dieta alta en sal (HSD) d'angiotensina II (AngII) en ratolins LC3 de proteïna fluorescent FL verda (GFP). ( a ) AngII + HSD va donar lloc a un augment espectacular de l'albuminúria en ratolins GFP-LC3 en comparació amb els ratolins GFP-LC3 CSTTg (transgènics de calpastatina). n=8 a 13 ratolins per genotip. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Anàlisi bidireccional de la variància: genotip, P=0.0429; temps, P=0.0165. Prova de comparació múltiple de Sidak: *P=0.0453 per a ratolins GFP-LC3 versus CSTTg GFP-LC3 el dia 28. (b, c) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió del tumor de Wilm 1 (WT1; verd) i nefrina (NPHS1) (vermell) en glomèruls de 18-ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 d'una setmana d'edat després de 6 setmanes d'infusió AngII + HSD. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barres=50 mm. Quantificació de ( d ) àrea NPHS1 + per secció glomerular i ( e ) el nombre de cèl·lules WT1 + per secció glomerular en 18- ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 d'una setmana després de 6 setmanes d'infusió AngII + HSD. n=19 ratolins GFP-LC3 i n=25 ratolins CSTTg GFP-LC3. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Prova t no aparellada amb SD igual: **P=0,0010 in (d), P= 0,1158 in (e). (f, g) Imatges de microscòpia electrònica de transmissió de glomèruls de ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 després de 6 setmanes d'AngII + HSD. Les puntes de fletxa indiquen l'esborrament del procés del peu. Barres=1 mm. (h) Quantificació del nombre de processos del peu per micròmetre de membrana basal glomerular (GBM). n=3 ratolins per genotip. Els valors es presenten com a diagrames individuals i SEM mitjà. Cada gràfic representa el nombre mitjà de podòcits per micròmetre de GBM en 1 longitud contínua de GBM. Prova t no aparellada amb SD igual: P=0.7512. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.ronyó-international.org.
Aquí, hem utilitzat un model hipertensiu basat en la perfusió AngII i HSD. Els podòcits presenten receptors AT1 i estan exposats a pèptids filtrats lliurement com AngII.13,16,26,61–65. Se suposa que els efectes renoprotectors observats de la inhibició del RAAS podrien ser, almenys parcialment, deguts a un bloqueig d'aquest podòcit. RAAS específic. De la mateixa manera, els estudis in vivo van confirmar l'efecte de l'AngII sobre la lesió dels podòcits i l'orientació del gen específic del podòcit d'AT1 van demostrar que l'activació dels receptors AT1 al glomèrul en la nefritis lúpica experimental és suficient per accelerar.ronyólesió en absència d'hipertensió.66,67 Mediada per calpainaautofàgiaLa desregulació del nostre model podria estar relacionada amb la senyalització directa d'AnII-AT1 als podòcits o ser una conseqüència de la hipertensió. Podem donar una resposta primerenca a aquesta pregunta. De fet, al model DOC-sal, també vam trobar una acumulació de P62 en podòcits de ratolins hipertensos (figura suplementària S3). Això suggereix que el bloqueig de l'autofàgia es produeix en els podòcits d'aquest model, que se suposa que és independent de l'AngII. de l'autofàgia dels podòcits depèn dels efectes directes o indirectes de l'AngII.
Figura 8 |CalpastatinaLa sobreexpressió impedeix la dieta induïda per l'angiotensina II (AngII) D alta en sal (HSD)autofàgiaregulació a la baixa en podòcits. ( a, b ) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de P62 (verd) i Podocalyxin (PODXL; vermell) en glomèruls de la proteïna fluorescent FL verda (GFP) - LC3 i CSTTg (calpastatinatransgènics) ratolins GFP-LC3 després de 6 setmanes d'AngII + HSD. Les subparts de la figura amb primer indiquen un augment més elevat. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barres=50 mm. (c, d) Quantificació de l'àrea P62 + per secció glomerular. n=9 ratolins de tipus salvatge (WT) i n=7 ratolins CSTTg a (c) i n=16 ratolins GFP-LC3 i n{=16 ratolins CSTTg GFP-LC3 a (d). Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Prova de Mann-Whitney: **P=0,0033 in (c), **P{=0,0011 in (d). ( e, f ) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de GFP (verd) i P62 (vermell) en glomèruls de ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 després de 6 setmanes d'AngII + HSD. Les subparts de la figura amb primer indiquen un augment més elevat. Les puntes de fletxa indiquen autofagosomes GFP + P62 +. ( g ) Quantificació del nombre de punts LC3 + P62 + per podòcit. n=11 ratolins GFP-LC3 i n=16 ratolins CSTTg GFP-LC3. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjana ± SEM. Prova t no aparellada amb SD igual: P=0.1014. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article a www.ronyó-international.org.
Taula 1|Matriu personalitzat de PCR RT2 Profiler
Calpain-1 i calpain-2 són proteases proinflamatòries omnipresents, l'activitat de les quals està controlada percalpastatina, el seu inhibidor específic. De fet, la calpastatina inhibeix selectivament les calpaines i cap altra proteasa fins ara. L'activació de Calpain s'ha relacionat recentment ambronyólesions en diversos contextos patològics.69,70 Es va trobar que el canal potencial del receptor transitori del transportador de canals de calci C6 activava la calpaïna-1 als podòcits mitjançant l'activació de Ca2+/calcineurina. Els ronyons de pacients amb glomeruloesclerosi focal i segmentària tenien una expressió augmentada del canal potencial del receptor transitori C6, augment de l'activitat de la calpaïna i calcineurina i una expressió reduïda de la talina objectiu de calpain-1, que és fonamental per a l'estabilitat del citoesquelètic dels podòcits.71 Canal potencial del receptor transitori. C6 també s'uneix directament a calpain-1 i calpain-2. Aquesta interacció és crucial per a la regulació de la divisió de talina{11}} i per controlar la motilitat dels podòcits.72
Ratolins transgènics sobreexpressantcalpastatinaestan protegides contra la remodelació vascular i la inflamació dependent de l'AngII73; contra la inflamació en models de glomerulonefritis43, sèpsia74 o rebuig d'al·loempelt75; i contra la inflamació relacionada amb l'edat.76 No s'ha explorat la lesió dels podòcits en aquests ratolins. Peltier et al. va mostrar aquesta sobreexpressió decalpastatinava prevenir la inflamació perivascular depenent de AngII als ronyons.43 Així, la protecció renal en ratolins CSTTg podria estar mediada, almenys parcialment, per un mecanisme antiinflamatori. Avaluem la infiltració de macròfags i limfòcits al nostre model i no vam trobar cap diferència significativaronyóinflamació entre CSTTg i ratolins de control en analitzar globalronyóinfiltració de leucòcits (figura suplementària S6).
La calpaina va participar recentment en la regulació de l'autofàgia (revisada recentment a Weber et al.53) amb propietats interessants i bioprotectores de la inhibició de la calpaina en el context diabètic mitjançant la restauració deautofàgia.77 Aquí, vam informar que la inhibició de la calpaïna a travéscalpastatinaLa sobreexpressió (i) va prevenir la lesió dels podòcits durant la hipertensió i (ii) va restaurar l'autofàgia als podòcits, posant de manifest un nou paper perjudicial de l'activació de la calpaïna durant la hipertensió mitjançant la inhibició deautofàgia.
Es va demostrar que gairebé totes les proteïnes ATG estaven escindides per calpains in vitro. 78 Aquí postulem queautofàgiaEl manteniment en ratolins hipertensos CSTTg va ser mediat per la inhibició de la calpaïna. Per donar suport a la nostra hipòtesi, vam demostrar que els podòcits de CSTTg tenen una disminució de l'activitat de la calpaïna quan es desafien amb AngII in vitro (figura 3c). Vam trobar un augment del nivell de proteïna ATG5 als podòcits de ratolins CSTTg, cosa que suggereix que la sobreexpressió de calpastatina va impedir la divisió ATG5 mediada per calpaina en aquest context (figura 5a). En canvi, es va demostrar quecalpastatina- la inhibició de la calpaïna mediada podria ser independent de la inhibició de la seva activitat proteasa79; per tant, no podríem excloure la regulació de l'autofàgia per la calpastatina independent de l'activitat enzimàtica de la calpaïna.
En resum, aquestes troballes van revelar un paper no reconegut anteriormentcalpastatinaen la regulació del podòcitautofàgiai va proporcionar una pista per a la investigació de noves estratègies terapèutiques per millorar la supervivència dels podòcits durant les nefropaties hipertensives.
DIVULGACIÓ
Tots els autors van declarar que no hi havia interessos en competència.
AGRAÏMENTS
Aquest treball va comptar amb el suport de l'Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) i la Université de Paris. L'IB va rebre el suport d'una beca de postgrau del Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL va ser finançat a través d'un premi de la Fundació Europea per a l'Estudi de la Diabetis (EFSD) recolzat pel Programa EFSD/Novo Nordisk per a la Investigació de la Diabetis a Europa i una subvenció de la Société Francophone duDiabète (SFD). BR i CH van ser finançats per Starting Grant 107037 del Consell Europeu de Recerca i la Unió Europea (P-LT). YS va comptar amb el suport d'una beca de postgrau de la Fondation de France.
Agraïm a Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac i l'equip ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, París, França) per l'assistència en la cura i manipulació d'animals, Nicolas Sorhaindo per les mesures bioquímiques (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat). , París, França) i Alain Schmitt i Jean-Marc Masse per a la microscòpia electrònica de transmissió (Institut Cochin, París, França). Donem les gràcies a Morgane Le Gall (instal·lació proteòmica Cochin 3P5, París, França) per l'ajuda en l'anàlisi in silico. Agraïm el suport administratiu de Véronique Oberweis, Bruno Pillard i Cyrille Mahieux (Universitat de París, PARCC, Inserm, París, França).
MATERIAL COMPLEMENTARI
Fitxer suplementari (PDF)
Figura S1. El cultiu de podòcits primari expressa marcadors de podòcits. Anàlisi Western blot de l'expressió dels marcadors de podòcits NPHS1 i NPHS2 en cultiu de podòcits primaris de ratolins WT i CSTTg. La tubulina (TUBA) serveix com a control de càrrega. Representant de n=4 ratolins per genotip.
Figura S2. Nivell basal alt del podòcitautofàgia. (A, B) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de GFP (verd) i NPHS1 (vermell) en glomèruls de ratolins GFP-LC3 tractats o no amb CQ (80mg/kg) 4 hores abans de matar. Les puntes de fletxa mostren autofagosomes GFP +. (C, D) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de GFP (verd) i P62 (vermell) en glomèruls de ratolins GFP-LC3 tractats o no amb CQ (80 mg/kg) 4 hores abans de matar. Les puntes de fletxa mostren els autofagosomes GFP + P62 +. (A–D) (0 ) representen un augment més elevat. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barra=50 mm. N=4 ratolins per condició (E–H) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de GFP (verd) i P62 (vermell) en podòcits primaris de ratolins GFP-LC3 tractats (F, H) o no (E, G) ) amb bafifilomicina A1 (100 nM) durant 4 hores. N=5 ratolins per condició.
Figura S3. P62 s'acumula en podòcits en el model DOC-sal d'hipertensió. (A-C) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de P62 (verd) i PODXL (vermell) en glomèruls de ratolins WT després de 2 a 6 setmanes de model de sal DOC. (0 ) representen un augment més elevat. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Barra ¼ 50 mm. (D) Quantificació de l'àrea de P62 per àrea de podòcits (per cent). N=5–6 ratolins per condició. Anàlisi unidireccional de la variància: temps P=0,0059, prova de comparació múltiple de Sidak: D42 versus D14 **P{=0,0055, D28 versus D14 P=0,8590.
Figura S4. Podòcitautofàgiaés prescindible per al desenvolupament de podòcits. (A) Pressió arterial sistòlica, (B) relació albúmina-creatinina d'orina i (C) nivells de nitrogen d'urea en sang en ratolins Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 ratolins per genotip. Els valors es presenten com a gràfics i mitjans individuals±SEM. Prova de Mann-Whitney: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) i P{=0.6623 (C). (D-E) Imatges representatives de les seccions de glomèruls tenyides de tricrom de Masson de ratolins Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F-G) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de PODXL (verd) i WT1 (vermell) en ratolins Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). (D–G) Barra=50 mm. N ¼ 6 ratolins per genotip. (H–I) Fotomicrografies representatives de seccions de microscòpia electrònica de transmissió de glomèruls de ratolins Atg5lox/lox i Nphs2.cre Atg5lox/lox. Barra=1 mm. N=3 ratolins per genotip.
Figura S5.Calpastatinala sobreexpressió no influeixronyófunció a la línia de base. (A) nivells de nitrogen ureic en sang i (B) nivells d'albúmina plasmàtica en ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 de 12-setmanes d'edat. N=5 GFP-LC3 i N=6 CSTTg GFP-LC3. Els valors es presenten com a gràfics i mitjans individuals±SEM. Prova de Mann-Whitney: P=0,6623 (A) i P=0,9307 (B). (C, D) Imatges representatives de les seccions de glomèruls tenyides de tricrom de Masson de ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3. (E–H) Imatges d'immunofluorescència representatives de l'expressió de PODXL (E, F) i NPHS1 (G, H) en ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3. (C–H) Barra=50 mm. (I, J) Quantificació associada de l'àrea PODXL i NPHS1 per secció glomerular. N=5 GFP-LC3 i N=6 CSTTg GFP-LC3. Els valors es presenten com a gràfics i mitjans individuals±SEM. Test de Mann-Whitney: P=0,1898 (A) i P=0,8413 (B).
Cistanche-funció renal
Figura S6.Calpastatinala sobreexpressió no influeix en la inflamació renal global. Immunohistoquímica representativa de l'expressió de F4/80 (A, B) i CD3 (D-E) en ratolins GFP-LC3 i CSTTg GFP-LC3 després de 6 setmanes d'Angiotensina II þHSD. Barra=200 mm. (C, F) Quantificació associada de l'àrea F4/80 i CD3 perronyósecció. N=7 CSTTg GFP-LC3 i N=8 ratolins GFP-LC3. Els valors es presenten com a diagrames individuals i mitjans SEM. Prova de Mann-Whitney: P=0,3969 (C) P= 0,3357 (F).
Figura S7. Podòcitautofàgiadeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Taula S1. Previsió in silico dels llocs d'escissió de la calpaïna. Els llocs d'escissió de Calpain es van predir en proteïnes relacionades amb podòcits i autofàgies amb GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP://calpain.org) i DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio. info/help.php). Fitxer suplementari (Excel)
Taula complementària S2. L'arxiu complet de la previsió in silico dels llocs d'escissió de la calpaïna. Els llocs d'escissió de Calpain es van predir en podòcits iautofàgia-proteïnes relacionades amb GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) i DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Els llocs d'escissió de predicció es reprenen per a cada proteïna per a GPS-CCD i DeepCalpain Predict.
REFERÈNCIES
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, et al. Prevalència de la crònicaronyómalaltia als Estats Units. JAMA. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, et al. A qui s'ha de dirigir el cribratge d'ERC? Impacte de la diabetis, la hipertensió i les malalties cardiovasculars. Am J Kidney Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC, et al. Factors de risc per a ESRD en individus amb GFR estimat conservat amb i sense albuminúria: resultats del Programa d'avaluació precoç del ronyó (KEEP). Am J Kidney Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Tensió arterial elevada i risc de malaltia renal en fase terminal en subjectes sense malaltia renal inicial. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, et al. La lesió dels podòcits és la base de la glomerulopatia de rates hipertenses de sal de Dahl i és revertida pel bloquejador d'aldosterona. Hipertensió. 2006;47:1084–1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. Excreció de podòcits urinaris com a marcador de preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. La podocituria és anterior a la proteinúria i les característiques clíniques de la preeclampsia: un estudi prospectiu longitudinal. Hipertensió. 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, et al. Pèrdua de podòcits en la nefrosclerosi hipertensiva humana. Sóc J hipertensos. 2009;22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Expressió intrarenal de miRNAs en pacients amb nefrosclerosi hipertensiva. Sóc J hipertensos. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Nefropaties proteïnúriques cròniques: resultats i resposta al tractament en una cohort prospectiva de 352 pacients amb diferents patrons de lesió renal. Am J Kidney Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. La pèrdua persistent de podòcits depenent de l'angiotensina II dels glomèruls desestabilitzats provoca la progressió de l'etapa finalronyómalaltia. Ronyó Int. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Els efectes dels bloquejadors del receptor d'angiotensina-II sobre el dany dels podòcits i l'apoptosi glomerular en un model de rata de nefropatia diabètica induïda per estreptozotocina experimental. Acta Histochem. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. L'angiotensina II contribueix a la lesió dels podòcits augmentant l'expressió de TRPC6 mitjançant una via de senyalització de retroalimentació positiva mediada per NFAT. Sóc J Pathol. 2011;179:1719–1732.
14. El Grup d'Estudi EUCLID. Assaig aleatoritzat controlat amb placebo de lisinopril en pacients normotensos amb diabetis insulinodependent i normoalbuminúria o microalbuminúria. Lanceta. 1997;349:1787–1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. La proteinúria, un objectiu per a la renoprotecció en pacients amb nefropatia diabètica tipus 2: lliçons de RENTAL. Ronyó Int. 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Els canvis en la selectivitat de la permanent glomerular induïts per l'angiotensina II impliquen una disfunció dels podòcits i un reordenament de proteïnes del diafragma d'escletxa. Semin Nefrol. 2004;24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Caracterització dels subtipus de receptors d'angiotensina II en podòcits. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, et al. La proteïnúria i l'expressió de la proteïna del diafragma de la ranura del podòcit, la nefrina, en la nefropatia diabètica: efectes de la inhibició de l'enzim convertidor d'angiotensina. Diabetologia. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. Efectes de l'inhibidor de l'enzim convertidor d'angiotensina, l'antagonista del receptor de l'angiotensina II i l'antagonista del calci sobre els podòcits urinaris en pacients amb nefropatia IgA. Sóc J Nephrol. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG, et al. L'angiotensina II augmenta l'activitat del calci citosòlic en podòcits de rates en cultiu. Ronyó Int. 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, et al. Efectes beneficiosos a llarg termini de la inhibició de l'enzim convertidor d'angiotensina en pacients amb proteinúria nefròtica. Am J Kidney Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, et al. L'angiotensina II augmenta l'activitat del calci intracel·lular en podòcits del glomèrul intacte.RonyóInt. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, et al. L'angiotensina II modula les funcions cel·lulars dels podòcits. Kidney Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. L'estirament redueix l'expressió de nefrina mitjançant un mecanisme dependent de l'angiotensina II-AT(1) en podòcits humans: efecte de la rosiglitazona. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Estirament, tensió i adhesió: mecanismes adaptatius del citoesquelet d'actina als podòcits. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Activació d'un sistema local d'angiotensina tissular en podòcits per una soca mecànica. Ronyó Int. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. La força d'estirament cíclic regula selectivament les isoformes beta del factor de creixement transformant en cèl·lules mesangials de rata cultivades. Sóc J Pathol. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. El dany dels podòcits és un pas crític en el desenvolupament de la glomeruloesclerosi en la rata hipertensa uni nefrectomitzada-desoxicorticosterona. Arxiu de Virchows. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J, et al. La pèrdua de l'autofàgia disminueix la massa i la funció de les cèl·lules beta pancreàtiques amb hiperglucèmia resultant. Metab cel·lular. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Autofàgiaés important en l'homeòstasi dels illots i l'augment compensatori de la massa de cèl·lules beta en resposta a una dieta alta en greixos. Metab cel·lular. 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, et al. L'autofàgia de cèl·lules endotelials i podòcits protegeixen sinèrgicament de la glomeruloesclerosi induïda per la diabetis. Autofàgia. 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, et al. L'autofàgia influeix en la susceptibilitat a la malaltia glomerular i manté l'homeòstasi dels podòcits en ratolins envellits. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, et al. Dos tipus d'autofàgia en els podòcits en mostres de biòpsia renal: un estudi ultraestructural. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. MAP-LC3, un prometedor marcador autofagosòmic, es processa durant la diferenciació i la recuperació dels podòcits de la nefrosi PAN. FASEB J. 2003;17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.AutofàgiaCombat la malaltia mitjançant l'autodigestió cel·lular. Naturalesa. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S, et al. L'autofàgia hepàtica defectuosa en l'obesitat afavoreix l'estrès del RE i provoca resistència a la insulina. Metab cel·lular. 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionsky DJ. Formació d'autofagosomes: maquinària bàsica i adaptacions. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Sensació de nutrients, autofàgia i nefropatia diabètica. Diabetis. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Autofàgia: una nova diana terapèutica per aronyómalalties. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Rol emergent deautofàgiaen funció renal, malalties i envelliment. Autofàgia. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Implicacions de l'autofàgia per a l'envelliment glomerular i la malaltia. Teixit cel·lular Res. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K, et al. Els podòcits mantenen alts nivells basals d'autofàgia independentment de la senyalització del motor. Autofàgia. 2020;16:1932–1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. L'activació i la secreció de calpaina promouen la lesió glomerular en la glomerulonefritis experimental: evidència decalpastatina-ratolins transgènics. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Expressió específica de podòcits de la recombinasa Cre en ratolins transgènics. Gènesi. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. La supressió de l'autofàgia basal a les cèl·lules neuronals provoca malalties neurodegeneratives en ratolins. Naturalesa. 2006;441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O, et al. La tetraspanina CD9 controla la migració i la proliferació de cèl·lules epitelials parietals i la progressió de la malaltia glomerular. Nat Commun. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, et al. El receptor del factor de creixement epidèrmic promou la lesió glomerular i la insuficiència renal en la glomerulonefritis crentica de progressió ràpida. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. L'acció directa de l'endotelina-1 sobre els podòcits promou la glomeruloesclerosi diabètica. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, et al. El factor 2 relacionat amb el factor eritroide 2-nuclear impulsa l'expressió específica del podòcit del receptor g activat pel proliferador de peroxisomes essencial per a la resistència al GN crentic. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R, et al. Les calpaïnes alliberades pels limfòcits T escinden TLR2 per controlar l'expressió IL-17. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. El calpain/calpastatinaEl sistema té funcions oposades en el creixement i la difusió metastàtica del melanoma. PLoS One. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. Les calpaines contribueixen a la reparació vascular en la forma ràpidament progressiva de glomerulonefritis: paper potencial de la seva externalització. Arterioscler Tromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E, et al. Matar dos ocells enfadats d'un tret:autofàgiaactivació mitjançant la inhibició de les calpaines en malalties neurodegeneratives i més enllà. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X, et al. GPS-CCD: un nou programa computacional per a la predicció de llocs d'escissió de calpaïna. PLoS One. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: un recurs per a la calpaïna i la proteòlisi moduladora. Genoma Informa. 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Predicció precisa dels llocs d'escissió de la calpaïna i la seva aberrància causada per mutacions en càncer. Front Genet. 2019;10:715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, et al. L'escissió d'Atg5 mediada per calpaina canvia l'autofàgia a l'apoptosi. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G, et al. Control de l'autofàgia basal per l'escissió d'ATG5 mediada per calpain1.Autofàgia. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Escissió mediada per calpaina de Beclin-1 i desregulació de l'autofàgia després d'una lesió isquèmica de la retina in vivo. Mort cel·lular Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, et al. ANG II promouautofàgiaen podòcits. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Transactivació del receptor del factor de creixement epidèrmic per l'angiotensina II en podòcits glomerulars. Nephron Exp Nefrol. 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, et al. Localització immunohistoquímica del receptor ANG II AT1 en rata adultaronyóutilitzant un anticòs monoclonal. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Expressió funcional del sistema renina-angiotensina en podòcits humans. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F710–F719.
64. Premi Pavenstadt H. Franz Volhard 2000: senyalització d'angiotensina II al podòcit. Premsa sanguínia renal Res. 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. El sistema renina-angiotensina aldosterona en podòcits. Semin Nefrol. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J, et al. La infusió d'angiotensina II indueix canvis en l'expressió de la nefrina i l'apoptosi dels podòcits. Sóc J Nephrol. 2008;28:500–507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Els receptors glomerulars d'angiotensina tipus 1 augmenten la lesió renal i la inflamació en la nefritis autoimmune murina. J Clin Invest. 2009;119:943–953.
68. Song K, Stuart D, Abraham N, et al. La renina del conducte col·lector no media la hipertensió de la sal DOCA ni la lesió renal. PLoS One. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Paper protector del knockout de la calpaina endotelial en l'agut induït per lipopolisacàridsronyólesió mitjançant l'atenuació de la via p38-iNOS i la producció de NO/ROS. Exp Mol Med. 2020;52:702–712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. L'activitat de la calpain-10 és la base de la producció d'aldosterona induïda per l'angiotensina II en un model de cèl·lules rulosa del glom suprarenal. Endocrinologia. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. La proteasa calpaïna depenent del calci-1 enllaça l'activitat TRPC6 amb la lesió dels podòcits. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.
72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ, et al. TRPC6 s'uneix i activa la calpaina, independentment de la seva activitat de canal, i regula el citoesquelet dels podòcits, l'adhesió cel·lular i la motilitat. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Orientar el sistema calpaïna/calpastatina com una nova estratègia per prevenir la remodelació cardiovascular en la hipertensió induïda per l'angiotensina II. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Calpastatinacontrola la sèpsia polimicrobiana limitant l'alliberament de micropartícules procoagulants. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Paper crític de l'equilibri calpaïna/calpastatina en el rebuig agut d'al·lograft. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. La inhibició específica de la calpaïna protegeix laronyócontra la inflamació. Ciència Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, et al. Restaura la inhibició de la calpaïnaautofàgiai prevé la fragmentació mitocondrial en un model iPSC humà de la liopatia diabètica endo. Stem Cell Rep. 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. La divisió in vitro de les proteïnes altes per proteases de mort cel·lular. Autofàgia. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Regulació diferencial del complex calpaïna-calpastatina pel domini L decalpastatina. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.
