Els glucòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa indueixen l'apoptosi a les cèl·lules de carcinoma hepatocel·lular H22 mitjançant vies de senyalització extrínseques i intrínseques

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li i Jinyao Li

Resum

Antecedents:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight és una medicina tradicional xinesa que parasita les arrels de la planta Tamarix i s'ha utilitzat per tractar la impotència masculina, l'esterilitat, la debilitat corporal i com a tònic. No obstant això, el seu efecte antitumoral sobre el carcinoma hepatocel·lular encara és esquivat. Aquí, hem investigat l'efecte antitumoral deC. tubulosa glicòsids feniletanoides(CTPG) sobre cèl·lules de carcinoma hepatocel·lular H22 tant in vitro com in vivo i els seus mecanismes. Mètodes: es van analitzar la morfologia, la viabilitat, l'apoptosi, el cicle cel·lular i el potencial de membrana mitocondrial (Δψm) de les cèl·lules H22 mitjançant microscòpia invertida, assaig MTT i citometria de flux, respectivament. L'expressió i l'activació de proteïnes a la via de l'apoptosi es van detectar mitjançant Western blot. L'efecte antitumoral in vivo es va avaluar en un model de ratolí tumoral establert amb ratolins Kunming mascles. Resultats: el tractament amb CTPG va suprimir significativament el creixement de cèl·lules H22 de manera dependent de la dosi i del temps, que es va correlacionar amb l'augment de l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular a les fases G0/G1 i G2/M. A més, es va observar condensació cromosòmica a les cèl·lules H22 tractades amb CTPG. El tractament amb CTPG va augmentar significativament la relació Bax/Bcl-2, va reduir Δψm i va millorar l'alliberament del citocrom c. Els nivells de caspasa escindida-8 i caspasa-9 a les vies de senyalització extrínseques i intrínseques van augmentar significativament que la caspasa-7 i -3 activades seqüencialment per escindir PARP. Finalment, CTPG (Cistanchetubulosaglicòsids feniletanoides) va inhibir el creixement de cèl·lules H22 en ratolins i va millorar la taxa de supervivència dels ratolins tumorals. Conclusions: Aquests resultats van suggerir que CTPG va suprimir el creixement de cèl·lules H22 a través de les vies d'apoptosi extrínseca i intrínseca.

Fons

El càncer de fetge ocupa el sisè lloc per incidència de càncer i el quart per morts per càncer a tot el món. A més, va ocupar el quart lloc per incidència de càncer i primer per mortalitat per càncer als països amb un índex sociodemogràfic baix [1]. A la Xina, el càncer de fetge és la tercera causa de mort per càncer el 2015 [2]. Més del 90 per cent dels càncers de fetge primaris són carcinomes hepatocel·lulars (HCC) al món [3]. Actualment, la resecció hepàtica és la principal opció per al tractament de l'HCC. No obstant això, menys del 30 per cent dels pacients amb CHC complien els criteris de resecció hepàtica curativa, i la taxa de supervivència global 5-any encara és tan baixa com el 35-50 per cent a causa de l'alta taxa de recurrència [4, 5] ]. La disponibilitat d'opcions de tractament per als pacients amb CHC intermedi o avançat és molt limitada. El sorafenib, un fàrmac dirigit molecularment, ha estat aprovat per la FDA com a tractament de primera línia per a l'HCC avançat. Tanmateix, el sorafenib només allarga uns 3 mesos de supervivència i la taxa de resposta és inferior al 4% [6, 7]. És urgent desenvolupar nous fàrmacs o estratègies contra l'HCC. La medicina tradicional xinesa (MTC) sola o combinada amb altres estratègies s'ha utilitzat per tractar l'HCC i s'ha mostrat els beneficis clínics que inclouen el temps de supervivència prolongat, la millora de la qualitat de vida, la reducció de les reaccions adverses, etc. [8, 9].Cistanche, una mena de MTC, té diverses funcions biològiques, com araanti-oxidació, antiinflamatòria, anti-envelliment,i neuroprotecció [10, 11]. Els glucòsids feniletanoides s'han considerat els principals components actius deCistanche, que tenen activitats diverses que inclouen antioxidació, antiinflamació, hepatoprotecció i neuroprotecció [12–15]. El nostre grup ho ha informatGlucòsids feniletanoides de Cistanche tubulosa(CTPG) podria induir l'apoptosi a les cèl·lules del melanoma B16-F10 i inhibir el creixement de tumors en ratolins [16]. En aquest estudi, vam mesurar l'efecte antitumoral del CTPG sobre cèl·lules HCC H22 tant in vitro com in vivo i vam investigar els seus mecanismes. Vam trobar que CTPG va induir l'apoptosi a les cèl·lules H22 a través de vies de senyalització extrínseques i intrínseques i va suprimir el creixement de tumors H22 en ratolins.

Mètodes

Línia cel·lular

Les cèl·lules de carcinoma hepatocel·lular H22 del ratolí es van obtenir del laboratori clau de recursos biològics i enginyeria genètica de Xinjiang, Universitat de Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Xina) i es van cultivar en medi RPMI 1640 (Gibco) complementat amb 100 U/ml de penicil·lina i 100 ug/ml. estreptomicina i sèrum boví fetal inactivat per calor al 10% (Gibco) a 37 graus en una atmosfera humidificada d'un 5% de CO2.

assaig MTT

El CTPG es va comprar a Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Xina) i els principals compostos de CTPG es van qualificar i quantificar mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment [16]. La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-bromur de difeniltetrazoli (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , EUA) assaig. Les cèl·lules H22 es van inocular a 96-plaques de pous a una densitat de 2 × 104 cèl·lules en 100 ul de medi per pou i es van cultivar a 37 graus. Després de 24 h, les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) o 0,3 per cent de DMSO (igual a la de 400 ug/ml CTPG) durant 24, 48 i 72 h, respectivament . Després de la centrifugació a 1000 rpm durant 7 min, es va descartar el sobrenedant i es van afegir 100 ul de solució MTT (5 mg/ml en PBS) a cada pou. Les plaques es van incubar a 37 graus durant 4 hores i es van afegir 100 ul de DMSO per dissoldre els cristalls de formazà formats. Els valors OD490 es van detectar mitjançant un lector de microplaques de 96- pou (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA). La viabilitat cel·lular es va calcular d'acord amb la fórmula: viabilitat cel·lular (per cent)=(tractat amb OD/no tractat) × 100 per cent.

Detecció d'apoptosi

Les cèl·lules H22 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) o 0,3 per cent de DMSO durant 24 h, i després es van tacar amb Annexina V FITC/ Kit de detecció d'apoptosi de iodur de propidi (PI) (YEASEN, Xina) segons les instruccions del fabricant. Les mostres es van analitzar mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur, EUA).

Detecció del potencial de membrana mitocondrial

Les cèl·lules H22 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 200 i 400 ug/ml) durant 24 h, i després es van tacar amb el colorant JC-1 permeable a la membrana (Beyotime, Xina) durant 20 min a 37 graus. Després de rentar dues vegades amb tampó JC-1, les mostres es van tornar a suspendre amb 300 ul de tampó JC-1 i es van analitzar mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur, EUA).

Anàlisi del cicle cel·lular

Les cèl·lules H22 es van inocular en plats de cultiu de 60 mm i es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) o 0,3 per cent de DMSO per a 24 h. Totes les cèl·lules es van recollir i es van rentar dues vegades amb PBS. Les cèl·lules es van fixar en etanol fred al 70 per cent a -20 graus durant 2 hores i es van rentar dues vegades amb PBS, després es van tornar a suspendre en tampó de tinció de iodur de propidi/RNasa de 300 ul (BD Biosciences). Després de 10 min a temperatura ambient, es van recollir mostres per citometria de flux (BD FACSCalibur, EUA) i es va analitzar la distribució del cicle cel·lular amb el programari ModFit LT 3.0.

Tinció de Hoechst 33.258

Els canvis morfològics dels nuclis cel·lulars H22 es van analitzar mitjançant la tinció Hoechst 33.258 de colorant d'unió a l'ADN permeable a la membrana. Les cèl·lules H22 es van sembrar en una placa de 6-pou a la concentració d'1 × 105 cèl·lules/pou en un medi de 2 ml. Després d'un 60 per cent a un 70 per cent de confluència, les cèl·lules es van tractar amb CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) durant 24 h. Les cèl·lules es van recollir i es van fixar amb un 4% de paraformaldehid fred a 4 graus durant 10 min. Després de rentar-se amb PBS, les cèl·lules es van tacar amb Hoechst 33.258 (Beyotime, Xina) a 4 graus durant 10 min. Les mostres es van observar mitjançant un microscopi de fluorescència invertida (Nikon Eclipse Ti-E, Japó).

Western blot

L'anti-caspasa-3, la caspasa anti-clivada-3, l'anti-Bcl-2 i l'anti-Bax es van comprar a Beyotime Biotech Co., Ltd. (Xangai, Xina). Anticaspasa-7, anti-caspasa-7, anti-caspasa-8, anti-caspasa-8, anti-caspasa-9, anti -caspasa-clivada-9, anti-PARP, PARP anti-escissió, IgG-HRP anti-ratolí i IgG-HRP anti-conill es van comprar a Cell Signaling Technology. L'anti- -actina es va comprar a Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, Xina).

Les cèl·lules H22 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) o 0,3 per cent de DMSO durant 24 h. Les cèl·lules es van recollir i lisar amb la solució de lisi cel·lular RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) durant 30 minuts sobre gel. Les mostres es van girar (12,000 g durant 15 min a 4 graus) per recollir els sobrenedants i es van mesurar les concentracions de proteïnes mitjançant el kit BCA (Thermo Fisher Scientific, EUA). Es va aïllar una quantitat igual de proteïna a cada mostra amb un 12% de SDS-PAGE i es va transferir a membranes PVDF (Biosharp, Xina). Després del bloqueig amb el tampó TBST que contenia un 5 per cent de llet sense greix, les membranes es van incubar amb anticossos primaris corresponents i anticossos secundaris conjugats a la peroxidasa de rave picant (HRP), respectivament. Després del rentat amb TBST, les proteïnes diana es van detectar mitjançant el kit d'assaig ECL (Beyotime, Xina).

Animals i declaració ètica

Es van comprar ratolins Kunming mascles d'{0}} setmanes d'edat al Animal Laboratory Center de la Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Xina). Els ratolins es van mantenir en una instal·lació d'animals amb cicle de llum estàndard de temperatura controlada de la Universitat de Xinjiang. Tots els estudis amb animals es van dur a terme segons les directrius del Comitè d'ús i cura dels animals de la Universitat de Xinjiang. El protocol va ser aprovat pel Comitè d'Ètica dels Experiments amb Animals del Laboratori Clau de Recursos Biològics i Enginyeria Genètica de Xinjiang (BRGE-AE001), de la Universitat de Xinjiang.

Estudi del tumor del ratolí

Per a la inducció del model de ratolí tumoral, es van injectar subcutàniament ratolins Kunming mascles amb 1 × 106 cèl·lules H22 en 100 ul PBS al flanc dret. Després de 3 dies, els ratolins es van dividir aleatòriament en 3 grups (7 ratolins/grup). Al grup de control se li va injectar 0,1 ml de DMSO per via subcutània al voltant del tumor. Els grups CTPG-200 i CTPG- 400 es van injectar per via subcutània amb 200 o 400 mg/kg de CTPG en 0,1 ml de DMSO al voltant del tumor. Els ratolins es van tractar cada 2 dies durant un màxim de 21 dies. Les mides del tumor es van mesurar amb pinces fins a 25 dies i el volum del tumor es va calcular segons la fórmula: volum del tumor (mm3)=(longitud × amplada2)/2. Després de 25 dies, la supervivència dels ratolins tumorals es va controlar cada dia fins al final d'aquest estudi.

Anàlisi estadística

La significació estadística es va calcular mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància entre els grups de tractament i control. Totes les dades es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (SD). p < 0,05="" es="" va="" considerar="" estadísticament="">

Resultats

CTPG va reduir la viabilitat de les cèl·lules H22 in vitro

Per explorar l'efecte antitumoral del CTPG sobre l'HCC, les cèl·lules H22 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) in vitro. Després de 24 h, es va observar la morfologia de les cèl·lules H22 mitjançant un microscopi invertit. Vam trobar que la morfologia de les cèl·lules H22 es va canviar dràsticament pel tractament CTPG. Amb l'augment de la concentració de CTPG, les cèl·lules es van tornar petites i rodones i el nombre de cèl·lules també es va reduir molt (Fig. 1a). El test MTT es va utilitzar per analitzar la viabilitat de les cèl·lules H22 després del tractament amb CTPG durant 24, 48 i 72 h, respectivament. CTPG va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules H22 de manera dependent de la dosi i del temps (Fig. 1b). El CTPG a 300 ug/ml va arribar a la millor taxa d'inhibició (Fig. 1c). Els valors de IC50 de CTPG per a cèl·lules H22 són 236 ug/ml a les 24 h i 169,8 ug/ml a les 48 h.

CTPG va induir l'apoptosi a les cèl·lules H22

Per investigar si la disminució de la viabilitat de les cèl·lules H22 està mediada per la inducció de l'apoptosi, les cèl·lules H22 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) durant 24 h i es van tacar. amb PI i Annexina V. Els resultats de la citometria de flux van mostrar que CTPG va induir significativament l'apoptosi de les cèl·lules H22 (incloent l'apoptosi precoç i tardana) de manera dependent de la dosi (Fig. 2a). Tot i que la dosi elevada de CTPG també va augmentar significativament la necrosi de les cèl·lules H22, la necrosi té un paper menor en la inhibició del creixement de les cèl·lules H22 a causa de la seva menor proporció (8,3 per cent) en comparació amb la d'apoptosi (52,6 per cent). A més, les proteïnes totals de les cèl·lules H22 es van aïllar després del tractament amb CTPG i es van detectar les expressions del limfoma de cèl·lules B anti-apoptòtic 2 (Bcl-2) i la proteïna X associada a BCL-2-pro-apoptòtica (Bax) Western blot. Les dades d'escaneig en escala de grisos van mostrar que els nivells d'expressió de Bax i Bcl-2 van augmentar i disminuir, respectivament. La relació Bax/Bcl-2 va augmentar significativament (figura 2b). Aquests resultats suggereixen que CTPG indueix apoptosi a les cèl·lules H22.

CTPG indueix la condensació cromosòmica i l'aturada del cicle cel·lular a les cèl·lules H22

S'ha informat que el dany a l'ADN i l'aturada del cicle cel·lular induïda per fàrmacs poden inhibir el creixement de cèl·lules tumorals i causar apoptosi a les cèl·lules tumorals [17, 18]. Per detectar la morfologia dels nuclis a les cèl·lules H22 després del tractament amb CTPG durant 24 h, les cèl·lules H22 es van tacar amb Hoechst 33.342 i es van observar mitjançant microscòpia fluorescent invertida. Les cèl·lules tractades amb CTPG van mostrar un augment depenent de la dosi de la cromatina dels nuclis brillantment condensada, mentre que les cèl·lules no tractades mostraven nuclis tenyits de manera homogènia (Fig. 3a). La distribució del cicle cel·lular a les cèl·lules H22 es va analitzar encara més mitjançant la tinció de PI després del tractament amb CTPG durant 24 h. Com es mostra a la figura 3b, el tractament amb CTPG va augmentar significativament la proporció de cèl·lules en fase G0/G{{1- i G2/M i va disminuir significativament la proporció de cèl·lules en fase S, cosa que suggereix que CTPG va induir G. 0/G1 i G2/M aturada de fase a les cèl·lules H22. L'alta dosi de CTPG també va augmentar significativament la proporció de cèl·lules sub G1.

CTPG va disminuir el potencial de la membrana mitocondrial i va augmentar l'alliberament del citocrom c

La via dependent dels mitocondris té un paper important en la inducció de l'apoptosi [19, 20]. Els canvis del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) es poden controlar mitjançant la tinció de JC-1 a causa de l'agregat JC{-1 (fluorescència vermella) es pot desintegrar en monòmer (fluorescència verda) amb la reducció de Δψm [21]. Després del tractament amb CTPG durant 24 h, les cèl·lules H22 es van tacar amb un colorant JC- 1. Les dades de citometria de flux van mostrar que la fluorescència vermella al canal FL-2 i la fluorescència verda al canal FL-1 es van reduir i augmentar significativament amb el tractament amb CTPG. La proporció de PE-FITC més cèl·lules es va incrementar significativament (Fig. 4a), cosa que suggereix que CTPG va reduir el Δψm a les cèl·lules H22. Això és coherent amb l'augment de la relació Bax/Bcl-2. En conseqüència, vam observar que l'alliberament del citocrom c va augmentar significativament amb el tractament amb CTPG (Fig. 4b). Aquests resultats van indicar que CTPG podria induir parcialment l'apoptosi a les cèl·lules H22 mitjançant una via depenent dels mitocondris (intrínsec).

CTPG va activar la via de la caspasa i va impedir la reparació de l'ADN

A continuació, es va analitzar l'activació de la caspasa induïda per CTPG mitjançant vies de senyalització extrínseques i intrínseques. Després del tractament amb CTPG durant 24 hores, es van aïllar les proteïnes totals de les cèl·lules H22 i es van detectar els nivells de caspases pro i escindides mitjançant Western blot. En comparació amb el control no tractat o DMSO, el tractament amb CTPG va augmentar significativament no només el nivell de caspasa escindida -8 (via extrínseca), sinó també el nivell de caspasa escindida -9 (via intrínseca) (Fig. 5). Seqüencialment, la caspasa activada-8 i -9 van escindir la pro-caspasa-3 i -7 aigües avall observades a la figura 5. La caspasa activada-3 va escindir l'ADN enzim reparador de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) per evitar la reparació de l'ADN i acumular danys a l'ADN tal com s'observa a la figura 3a.

Aquests resultats van indicar que CTPG va induir l'apoptosi a les cèl·lules H22 a través de vies de senyalització extrínseques i intrínseques.

CTPG suprimeix el creixement de H22 HCC in vivo i millora la taxa de supervivència dels ratolins tumorals

Finalment, es va avaluar l'efecte antitumoral del CTPG sobre l'HCC en un model de ratolí tumoral, que es va establir mitjançant injecció subcutània de cèl·lules H22. Després de 3 dies d'injecció de cèl·lules H22, els ratolins tumorals van ser tractats amb CTPG 8 vegades. El pes corporal dels ratolins i les mides del tumor es van controlar en els punts de temps indicats. Com es mostra a la figura 6a, el pes corporal dels ratolins de cada grup no té cap diferència significativa, cosa que suggereix que les dosis seleccionades de CTPG no tenen efectes secundaris evidents. Curiosament, el creixement del tumor en ratolins tractats amb 200 mg/kg i 400 mg/kg de CTPG es va inhibir significativament (Fig. 6b). A més, les dues dosis de tractament amb CTPG van millorar molt la supervivència dels ratolins tumorals (3/7, 3/7) en comparació amb el grup control (0/7) al final de l'experiment (Fig. 6b). També vam trobar que el CTPG va millorar significativament la proliferació d'esplenòcits aïllats de ratolins Kunming mascles de manera dependent de la dosi (Fig. 6c), cosa que suggereix que el CTPG té un efecte immunoestimulador.

Discussió

La MTC s'ha utilitzat per tractar diverses malalties, inclosos els càncers durant una llarga història. S'ha informat que la TCM pot induir l'apoptosi en diferents tipus de cèl·lules tumorals mitjançant vies de senyalització extrínseques (mediades pel receptor de la mort) i intrínseques (depenents dels mitocondris) per exercir efectes antitumorals [22-25]. Les dues vies poden activar la caspasa -8 i -9, respectivament [24, 26]. Aquí, vam trobar que CTPG va suprimir significativament el creixement de les cèl·lules H22 mitjançant la inducció de l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular. Els nivells de caspasa escindida-8 i -9 es van regular significativament pel tractament CTPG, cosa que suggereix que les vies de senyalització extrínseques i intrínseques estaven implicades en la inducció de l'apoptosi. El nostre estudi anterior va demostrar que CTPG va induir l'apoptosi a les cèl·lules B16-F10 del melanoma per la via dependent dels mitocondris que augmentava el nivell de caspasa escindida-9 però no la caspasa-8 [16]. CTPG podria activar diferents vies de senyalització en diferents tipus de cèl·lules tumorals.

La integritat de la membrana mitocondrial està estretament regulada pels membres de la família de proteïnes BCL-2, inclosos Bax i Bcl-2 [27, 28]. La proporció de Bax a Bcl-2 té un paper crític en la via d'apoptosi dependent dels mitocondris [29]. A les cèl·lules H22 tractades per CTPG, la relació Bax/Bcl-2 es va regular significativament, cosa que podria provocar la reducció de Δψm i l'alliberament del citocrom c observat en aquest estudi. En conseqüència, la pro-caspasa-9 es va escindir i activar. Finalment, els iniciadors de la caspasa activa-8 i -9 van activar el botxí de la caspasa-3 per tallar PARP per evitar la reparació de l'ADN. En conjunt, aquests resultats van suggerir que CTPG va induir l'apoptosi a les cèl·lules H22 a través de vies de senyalització extrínseques i intrínseques.

En el model de ratolí tumoral, CTPG va suprimir significativament el creixement de H22 HCC i va millorar molt la supervivència dels ratolins tumorals. Curiosament, CTPG va promoure en funció de la dosi la proliferació d'esplenòcits de ratolins Kunming, que és coherent amb el nostre estudi anterior [16].

Aquests resultats van suggerir que CTPG podria suprimir el creixement de H22 HCC en ratolins tant mitjançant l'efecte antitumoral directe com la millora immune indirecta.

Conclusions

CTPG va suprimir el creixement de cèl·lules H22 tant in vitro com in vivo i va induir l'apoptosi a les cèl·lules H22 mitjançant vies de senyalització extrínseques i intrínseques. Aquestes dades van indicar que CTPG podria ser un candidat potencial per al tractament de l'HCC.