Activitat estrogènica dels glucòsids de Cistanche Deserticola com a adjuvant dels receptors d'estrògens in vitro

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

INTRODUCCIÓ

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" en xinès), una herba medicinal tradicional xinesa que es va registrar per primera vegada a ShenNongBenCaoJing, s'ha utilitzat per al tractament de la deficiència renal, la impotència, el restrenyiment senil i la deficiència de sang durant milers d'anys.[1] Es distribueix principalment a les regions desèrtiques del nord-oest de la Xina, com Gansu i Xinjiang.[2] La investigació farmacològica moderna va demostrar que C. deserticola pot avançar en funcions medicinals àmplies, com ara la regulació hormonal, l'activitat immunomoduladora, antioxidant, neuroprotectora, antiinflamatòria i estrogènica.[3,4] Els glucòsids de Cistanches (GC) es van considerar com un dels principals components actius amb diversos efectes biològics.[5,6]

Els receptors d'estrògens- (ERs-) i ER són els subtipus dels ER que podrien regular les funcions fisiològiques.[7] Aquestes proteïnes podrien regular la transcripció de gens diana unint-se a seqüències reguladores d'ADN associades al nucli cel·lular. Tots dos subtipus s'expressen notablement en els sistemes cardiovascular i nerviós central.[8,9] El RE existeix principalment a la glàndula mamària, l'úter, l'ovari, l'os, l'òrgan reproductor masculí i la pròstata. El RE està present principalment a la pròstata, l'ovari i la bufeta.[10,11] A més, hi ha alguns papers fisiològics comuns per als dos subtipus, com en el desenvolupament i la funció dels ovaris i en la protecció del sistema cardiovascular. [12,13] Investigacions anteriors del nostre grup van revelar el mecanisme semblant a l'estrogènic dels GC mitjançant el mètode d'anàlisi metabolòmica.[14] En un estudi continu, es va analitzar el mecanisme de l'activitat estrogènica dels GC en línies cel·lulars MCF-7 relacionades amb ER.

MATERIALS I MÈTODES

Instruments

La incubadora ECO-170P-230 era de New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., el lector de microplaques Bio-Rad 680 i els aparells d'electroforesi eren de Bio-Rad Laboratories, Inc., el microscopi CX21 era d'Olympus Co., Ltd. , el sistema d'imatge en gel GIS-2019 era de Tanon Science and Technology Co., Ltd., la placa de fons pla era de Corning Inc., la citometria de flux EPICS-XL era de Beckman-Coulter Inc. i la reacció en cadena de la polimerasa en temps real de StepOnePlus (PCR) era de Thermo Fisher Scientific.

Productes químics i reactius

Els GC es van preparar al nostre laboratori tal com es va informar anteriorment,[14] i es va determinar que la puresa dels GC era del 52 per cent (es va utilitzar l'acteòsid com a marcador per determinar els GC) mitjançant espectrofotometria ultraviolada. L'estradiol (E2) es va comprar a Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Xangai, Xina). El sèrum boví fetal (FBS) i RPMI-1640 eren de Gibco Co., Ltd., la placa de fons pla de 96 pous era de Corning Inc. i el dimetilsulfòxid (DMSO) i el 3-[4,5-dimetil-2-tiazolil El bromur de ]-2,5-difeniltetrazoli (MTT) es va comprar a Sigma-Aldrich Corporation. El reactiu TRIzol, el kit de transcripció inversa (RT) i el kit TB Green™ RT-PCR es van comprar a TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Xina. Els anticossos anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb i -actina es van comprar a Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Tots els altres productes químics comuns es van comprar a proveïdors comercials estàndard.

Preparació de la mostra

Preparació de glucòsids de la solució madre de Cistanches

L'extracte de GC es va dissoldre en DMSO per fer una solució de reserva amb la concentració de 0,1051 g/ml i es va emmagatzemar a 4 graus. Es va utilitzar RPMI-1640 sense vermell de fenol per diluir la solució d'estoc a diverses concentracions abans del seu ús.

Preparació de la solució madre d'estradiol

L'extracte d'E2 es va dissoldre en DMSO per fer una solució de reserva amb la concentració de 0,27 mg/ml i es va emmagatzemar a 4 graus. Es va utilitzar RPMI-1640 sense vermell de fenol per diluir la solució d'estoc a diverses concentracions abans del seu ús.

Preparació de sèrum boví fetal tractat amb carbó dextran

Es van barrejar centenars de mil·lilitres de FBS amb 250 mg de pols de carbó activat i 25 mg de dextran. Després d'incubar durant 45 min a 55 graus, la mescla es va centrifugar a 4 graus, 1000 rpm durant 15 min. El sobrenedant es va filtrar mitjançant la membrana Millipore Express PES per obtenir el carbó vegetal tractat amb dextran (CDT)-FBS i es va emmagatzemar a -20 graus.

Cultiu cel·lular

Les línies cel·lulars MCF-7 de càncer de mama humà es van obtenir de la col·lecció de cultiu de tipus americà (ATCC). A més, les cèl·lules es van cultivar amb un medi RPMI-1640 que contenia un 10% de FBS i un 1% de penicil·lina-estreptomicina a 37 graus sota una atmosfera humidificada del 5% de CO2. Les cèl·lules es van cultivar en el medi RPMI-1640 sense vermell de fenol que contenia un 5% de CDT-FBS 4 dies abans de l'assaig MTT, de manera que s'hauria de netejar l'estrògen de les cèl·lules.

Anàlisi de la proliferació cel·lular d'estradiol en línies cel·lulars MCF-7

La proliferació cel·lular es va mesurar mitjançant l'assaig MTT per a cèl·lules MCF-7.[15,16] L'E2 es va dissoldre en medis de cultiu RPMI-1640 que contenien 0,1 per cent de DMSO a concentracions finals de {{27} }}.1, 1, 10, 100 i 1000 nM. Les línies cel·lulars MCF-7 es van cultivar en medi RPMI-1640 sense vermell de fenol durant 4 dies. Després de rentar tres vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS), es van afegir 100 µL de medi RPMI-1640 lliure de FBS a plaques de 96 pous a 1,5 × 104 per pou i es van incubar a 37 graus durant 24 h. Posteriorment, les cèl·lules es van tractar amb diverses concentracions de la solució E2 durant 72 h. A continuació, es van afegir 100 µL de solució MTT (0, 5 mg/ml) a cada pou. Les cèl·lules es van incubar durant 4 h. Finalment, es van afegir 150 µL de DMSO per dissoldre els cristalls de formazà. L'absorbància es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de microplaques i es va calcular la taxa de proliferació (PR).

Anàlisi de la proliferació cel·lular de glucòsids de Cistanches en línies cel·lulars MCF-7

La proliferació cel·lular es va mesurar mitjançant l'assaig MTT per a cèl·lules MCF-7. Els GC es van dissoldre en medis de cultiu RPMI-1640 que contenien 0,1 per cent de DMSO a concentracions finals de 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 i 175 µg /ml. Les línies cel·lulars MCF-7 es van cultivar en un medi RPMI-1640 sense vermell de fenol que contenia un 5% de CDT-FBS durant 4 dies. Després de rentar tres vegades amb PBS, es van afegir 100 µL de medi RPMI-1640 lliure de FBS a plaques de 96 pous a 1, 5 × 104 per pou i es van incubar a 37 graus durant 24 h. Posteriorment, les cèl·lules es van tractar amb diverses concentracions de la solució de GC durant 24, 48 i 72 h, respectivament. A continuació, es van afegir 100 µL de solució MTT (0, 5 mg/ml) a cada pou. Les cèl·lules es van incubar durant 4 h. Finalment, es van afegir 150 µL de DMSO per dissoldre els cristalls de formazà. L'absorbància es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de microplaques i es va calcular el PR. El RPMI-1640 sense vermell de fenol i el medi que conté E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) van ser els grups negatius i positius, respectivament.

Anàlisi de la proliferació cel·lular de glucòsids de Cistanches amb fulvestrant en línies cel·lulars MCF-7

La proliferació cel·lular es va mesurar mitjançant l'assaig MTT per a cèl·lules MCF-7. Els GC es van dissoldre en medis de cultiu RPMI-1640 que contenien 0,1 per cent de DMSO a concentracions finals d'1,75, 17,5 i 175 µg/ml. Les línies cel·lulars MCF-7 es van cultivar en un medi RPMI-1640 sense vermell de fenol que contenia un 5% de CDT-FBS durant 4 dies. Després de rentar tres vegades amb PBS, es van afegir 100 µL de medi RPMI-1640 lliure de FBS a plaques de 96 pous a 1, 5 × 104 per pou i es van incubar a 37 graus durant 24 h. Posteriorment, les cèl·lules es van tractar amb diverses concentracions de la solució de GC i es van incubar amb fulvestrant (6, 06 × 10−5 µg/ml) durant 48 h. A continuació, es van afegir 100 µL de solució MTT (0, 5 mg/ml) a cada pou. Les cèl·lules es van incubar durant 4 h. Finalment, es van afegir 150 µL de DMSO per dissoldre els cristalls de formazà. L'absorbància es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de microplaques i es va calcular el PR. El RPMI-1640 sense vermell de fenol i el medi que conté E2 (2, 725 × 10−3 µg/ml) van ser els grups negatius i positius respectivament.

Assaig del cicle cel·lular

Els GC es van dissoldre en medis de cultiu RPMI-1640 que contenien 0,1 per cent de DMSO a concentracions finals d'1,75, 17,5 i 175 µg/ml. Les línies cel·lulars MCF-7 es van cultivar en medi RPMI-1640 sense vermell de fenol que contenia un 5% de CDT-FBS durant 4 dies. Després de rentar tres vegades amb PBS, es va afegir 1 ml de medi RPMI-1640 lliure de FBS a plaques de 6 pous a 2, 5 × 105 per pou i es va incubar a 37 graus durant 24 h. Posteriorment, les cèl·lules es van tractar amb diverses concentracions de la solució de GC i es van incubar amb fulvestrant (6, 06 × 10−5 µg/ml) durant 48 h. Posteriorment, les cèl·lules es van recollir i es van rentar amb PBS tres vegades, es van centrifugar a 4 graus, 1000 rpm durant 10 min i es van fixar amb etanol al 70 per cent a -20 graus durant la nit. Després de rentar-se dues vegades amb PBS, les cèl·lules es van tacar amb una solució de PI (50 mg/mL) que contenia 1 mg/mL de RNasa A i 0, 1 per cent de Triton X-100 durant 30 min a la foscor a 4 graus. El cicle cel·lular es va detectar mitjançant citometria de flux i es va calcular l'índex de proliferació (PI) de la següent manera. El RPMI-1640 sense vermell de fenol i el medi que conté E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) van ser els grups negatius i positius, respectivament. PI=(S més G2 M)/(G0 /G1 més S més G2 M) × 100 per cent

Aïllament d'ARN i anàlisi quantitativa de reacció en cadena de la polimerasa en temps real

Per mesurar el nivell d'ARNm, es va utilitzar un assaig de PCR quantitativa RT (qPCR). L'ARN cel·lular total es va extreure amb el reactiu TRIzol. Per a qPCR, l'ARN es va transcriure inversament a cDNA a partir de 4 µg d'ARN total mitjançant un kit de RT. Les anàlisis RT-PCR es van realitzar mitjançant el kit TB Green™ RT-PCR. Tots els protocols es van realitzar segons les instruccions del fabricant. El parell d'encebadors utilitzat per a l'amplificació d'ER va ser 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (en endavant) i 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (invers); el parell d'encebadors utilitzat per a l'amplificació d'ER va ser 5'-AGTGCCGCTCTTGGGAGAGCTG-3' (en endavant) i 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (invers). Les condicions de PCR per a ER i ER eren de 94 graus durant 3 min seguides de 37 i 40 cicles, respectivament, de 94 graus durant 30 s, 58 graus durant 2 min i 72 graus durant 2 min. El parell d'encebadors utilitzat per a l'amplificació de GAPDH va ser 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (en endavant) i 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (invers). Les condicions de PCR per a GAPDH eren de 94 graus durant 3 min seguits de 30 cicles de 94 graus durant 30 s, 58 graus durant 2 min i 72 graus durant 2 min. Cada vegada que l'experiment RT-qPCR es va repetir més de dues vegades. Per a això es va utilitzar GAPDH com a control intern. Es va calcular l'expressió gènica relativa d'ER / ER dels transfectants en relació amb les cèl·lules control: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

L'expressió de proteïnes ER i ER es va detectar mitjançant l'anàlisi de western blot com a mètode informat amb modificacions menors. Breument, les cèl·lules MCF-7 es van cultivar en plaques de 6 pous a 2, 5 × 105 cèl·lules per pou i es van tractar amb GC a la concentració final d'1, 75, 17, 5 i 175 µg/ml durant 48 h, respectivament. Després de la incubació, els extractes de cèl·lules senceres es van preparar mitjançant tampó RIPA que contenia PMSF 1 mM. Les proteïnes dels extractes de cèl·lules senceres es van separar mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi i poliacrilamida al 12% i després es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè. La membrana es va bloquejar amb llet desnatada al 5% (p/v) dissolta en tampó TBST i es va incubar amb anticossos primaris i secundaris al seu torn. Es van observar anticossos lligats.

Anàlisi estadística

Els resultats es van expressar com a mitjanes i desviacions estàndard, i la significació estadística es va realitzar mitjançant la prova t de Student amb el programari SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

RESULTATS

Després de 24 h de tractament amb E2, òbviament es va millorar la proliferació de cèl·lules MCF-7 [Figura 1a]. 10 nM de solució E2 podrien estimular el creixement de les cèl·lules òbviament (123,89 per cent). Tanmateix, amb l'augment de la concentració d'E2, la capacitat de proliferació cel·lular es va afeblir. Per tant, 10 nM va ser la concentració òptima d'E2 en aquest experiment.

El grup GC a les concentracions d'1, 75, 17, 5 i 175 µg/mg podria millorar la proliferació de les línies cel·lulars MCF-7 de manera dependent del temps i de la dosi i va mostrar una diferència significativa amb el grup negatiu [Figura 1b]. En comparació amb un grup negatiu, el grup E2 va mostrar una proliferació evident (120,06 per cent).

El grup de medicació combinada (CMG) (fulvestrant amb E2 o GC) al medi CDT-FBS es va incubar amb cèl·lules MCF-4. Després de 72 h d'incubació, la CMG podria provocar una inclinació de PR en comparació amb el grup de medicació individual (IMG) (P <0.01) [figura="">

L'anàlisi de citometria de flux va mostrar que els GC podrien augmentar lleugerament el valor de PI, cosa que suggereix que els GC podrien avançar les cèl·lules de la fase G{{0}}/G1 a les fases S i G2/M [Figura 2 i Taula 1] i promoure l'ADN cel·lular síntesi. El resultat indica que el mecanisme dels GC a MCF-7 era similar al de l'E2. A CMG (fulvestrant amb GC), el valor PI de la cel·la PI va disminuir lleugerament al de IMG (P <0,>

L'anàlisi RT-PCR va indicar que les expressions d'ARNm ER i ER van augmentar en comparació amb el grup control (P <{0}}.01) de manera dependent de la dosi després de ser tractades amb diferents concentracions de GC durant 48 h [Figura 3a i b].

Resultat de Western blot que indica que després del tractament amb diverses concentracions de GC durant 48 h, el contingut de proteïnes ER i ER a MCF-7 augmenta amb els GC augmentant de manera dependent de la dosi [Figura 3c-e]

CONCLUSIÓ

En aquesta investigació, es va analitzar l'efecte dels GC sobre la proliferació i el cicle cel·lular de MCF-7 mitjançant el mètode de MTT i citometria de flux, respectivament. Els GC podrien augmentar la proliferació de cèl·lules MCF-7 a la concentració d'1,75, 17,5 i 175 µg/ml després d'incubar-les durant 72 h. Tanmateix, l'augment tendeix a alentir-se quan s'utilitzen conjuntament els CC i el fulvestrant. Els GC podrien augmentar el valor PI de les cèl·lules MCF-7, disminuir la cel·la de la fase G1 i augmentar la cel·la de les fases S i G2.

El fulvestrant és un antagonista específic de l'ER, que bloqueja la localització nuclear de l'ER perjudicant la dimerització del receptor i el transport nuclear depenent de l'energia.[17] En aquesta investigació, una conclusió ha confirmat que el fulvestrant pot debilitar la proliferació de GC a les cèl·lules MCF-7 i podria afectar la transformació del cicle cel·lular. Per tant, aquest estudi va indicar l'activitat estrogènica dels GC i, a més, l'ER és l'objectiu dels GC. A l'experiment RT-PCR i Western blot, les expressions d'ARNm i proteïnes d'ER i ER a les cèl·lules MCF-7 van augmentar amb l'augment de la concentració de GC. Per tant, els GC poden tenir un paper en l'activitat estrogènica segons l'ARNm i les proteïnes regulades d'ER i ER.