Cistanche Tubulosa protegeix les neurones dopaminèrgiques mitjançant la regulació de l'apoptosi i el factor neurotròfic derivat de les cèl·lules glials: in vivo i in vitro-Ⅰ

INTRODUCCIÓ

La malaltia de Parkinson (MP) és una malaltia neurodegenerativa comuna que es presenta en persones grans amb les manifestacions patològiques de la pèrdua de neurones dopaminèrgiques a la substància negra (SN) a causa de la degeneració. La gravetat de la malaltia es correlaciona amb la pèrdua de cèl·lules neuronals de dopamina (DA) al SN, la qual cosa és coherent amb la visió que el procés neurodegeneratiu progressa durant molts anys abans que aparegui cap símptoma (Sawle i Myers, 1993). La naturalesa progressiva de la malaltia suggereix possibilitats interessants d'intervenció terapèutica bloquejant el procés neurodegeneratiu subjacent. Per tant, la recerca d'accions potents i específiques induïdes per la teràpia de factors neurotròfics sobre la supervivència de la neurona DA té un interès considerable.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A PROTEGER LES NEURONES DOPAMINÈRGIQUES PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Els factors neurotròfics són proteïnes essencials, com ara el factor de creixement nerviós (NGF), el factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF) i el factor neurotròfic derivat de les cèl·lules glials (GDNF), que promouen el creixement dels nervis, el desenvolupament neurològic, la guia axonal i la funció neuronal. Entre tots els factors neurotròfics que protegeixen i promouen la reparació de les neurones dopaminèrgiques, el GDNF té els efectes més forts (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). S'ha demostrat que el GDNF posseeix efectes neurotròfics potents sobre les neurones DA in vitro (Lin et al., 1993) i que exerceix efectes neuroprotectors in vivo. S'ha demostrat que el GDNF rescata les neurones DA nigral de la mort cel·lular induïda per lesions després d'una axotomia quirúrgica o induïda per toxines en rates (Beck et al., 1995; Kearns i Gash, 1995; Sauer et al., 1995) i parcialment també després administració sistèmica deN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)en ratolins (Tomac et al., 1995). L'augment de la incidència d'apoptosi neuronal i els efectes protectors reduïts dels factors neurotròfics, potencialment desencadenats per diversos factors patològics, són la base de la degeneració de les neurones dopaminèrgiques (Holden et al., 2006).

C. tubulosa és una herba medicinal que s'origina a partir de diverses plantes del gènere Cistanche. És una opció terapèutica important per a la síndrome de deficiència renal que està estretament relacionada amb les hormones andrògenes de la medicina tradicional xinesa (MTC). Fins ara, moltes investigacions clíniques i bàsiques sobre C. tubulosa han demostrat l'activitat de les malalties neurodegeneratives. Per tant, la identificació de prescripcions de tonificació renal de TCM en el tractament de la MP pot proporcionar un tractament clínic alternatiu per a la MP.Echinacòsid (ECH)és un component bioactiu important que es troba a l'herba medicinal C. tubulosa. Els estudis han demostrat els efectes terapèutics dels glucòsids de Cistanche i ECH,verbascosid(VER) i icariina (ICA) en pacients amb malaltia d'Alzheimer (MA), PD i altres pacients amb demència vascular (Urano i Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) van suggerir que els extractes de C. tubulosa que contenien suficient ECH i acteòsid van millorar la disfunció cognitiva causada per A -42 mitjançant el bloqueig de la deposició d'amiloide i la inversió de la funció neuronal dopaminèrgica colinèrgica i hipocampal. Tao et al. (2015) ho van trobarglicòsids feniletanoidesde C. tubulosa (Ph Gs-Ct) va prevenir l'edema cerebral a gran altitud disminuint l'expressió de proteïnes i ARNm d'AQP4 al teixit cerebral de models de rata.

SNACKS EXTRACT DE CISTANCHE TUBULOSA NATURAL MILLOREM LA MEMÒRIA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Estudis anteriors han demostrat que els compostos d'herbes xinesos, inclosos els tres ingredients de C. tubulosa, epimedium i rhizoma polygonati, alleujaven el dany a les neurones dopaminèrgiques i augmentaven els nivells de dopamina mitjançant la regulació de l'expressió de factors neurotròfics (Wu et al., 2013). Així, encara no se sap si els efectes neuroprotectors induïts per C. tubulosa són de llarga durada i fins a quin punt el rescat de neurones DA nigral mitjançant l'administració de GDNF pot permetre una preservació significativa de comportaments motors rellevants per a la simptomatologia dels animals amb PD. Aquest estudi va utilitzar una recepta tonificant del ronyó de TCM, C. tubulosa nanopowder, que ha rebut una patent nacional (número de patent: 2011103028541) a la Xina i anteriorment ha demostrat un cert efecte terapèutic en la MP. El present estudi, per tant, va ser dissenyat per examinar els efectes neuroprotectors i regeneratius del tractament amb C. tubulosa i per investigar l'apoptosi a les cèl·lules MES23.5 i les rates definitives del comportament, i la regulació de GDNF, mesurada per una bateria de proves diana. .

MATERIALS I MÈTODES

Materials, reactius i equips

C. tubulosa es va comprar a Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, Xina. ECH, VER i ICA provenien dels National Institutes for Food and Drug Control, Xina. La línia de cèl·lules neuronals dopaminèrgiques MES23.5 va ser un regal del professor Biao Chen, Laboratori de Neurobiologia, Capital Medical University, Beijing, Xina. Es van comprar cinquanta ratolins mascles C57BL/6 (que pesaven entre 20 i 25 g cadascun) a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (número de llicència: SCXK2012-0002), Xangai, Xina.

MPP+, MTT i glutamina es van comprar a Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EUA); El medi DMEM/F12 i el sèrum boví fetal es van comprar a Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA); i l'estàndard MPTP, DA i l'estàndard d'àcid homovanil·lic (HVA) es van comprar a Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, EUA). -Actina, Bax, Bcl2, GDNF, receptor de la família GDNF alfa (GFR 1) i anticossos Ret es van comprar a Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, EUA); El kit de reactius de tinció de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) es va comprar a Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Xina); i el kit de preparació de mostres de gel SDS-PAGE, el kit de detecció de quimioluminescència millorada ultrasensible (ECL) i l'assaig d'àcid bicinconínic (BCA) es van comprar al Beyotime Institute of Biotechnology (Beijing, Xina).

Aquest estudi va utilitzar els instruments següents: lector de microplaques ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, EUA); incubadora de CO2 (Heraeus, Hanau, Alemanya); Sistema d'anàlisi d'imatges en gel Gel DOC 2000, cèl·lula d'electroforesi i tanc d'electroforesi (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA); Analitzador de proteïnes DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EUA); centrífuga refrigerada d'alta velocitat 5417R (Eppendorf, Hamburg, Alemanya); Molí de boles planetari doble SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Xina); molí mesclador MM400 (Retsch GmbH, Haan, Alemanya); Cromatografia líquida d'alt rendiment Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA); Electroforesi PowerPac Basic, sistema de transferència transmembrana PowerPac Basic, imatge de quimioluminescència Universal Hood II, sistema de transcripció inversa d'ARN Thermal Cycler S1000 (Bio-Rad); Sistema d'anàlisi d'imatges de teixits i cèl·lules Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Xina).

Preparació deC. tubulosaNanopols

Es va pesar C. tubulosa, després es va purificar i es va deshidratar. Després de la polverització convencional, la pols fina de C. tubulosa es va passar a través d'un tamís de 200-malla i es va liofilitzar. Per preparar la nanopols de C. tubulosa es va utilitzar un molí de boles d'alta energia i buit amb temperatura controlada. Primer, es va col·locar nanopols de C. tubulosa en brut en un dipòsit de fresat de boles al buit que es va carregar amb boles de mòlta de carbur. La proporció entre les boles de mòlta i la nanopols de C. tubulosa va oscil·lar entre 15:1 i 5:1. Per obtenir una pols fina, la velocitat i la durada del molí de boles d'alta energia es van establir a 300 rpm i 20 min, respectivament. La pols fina es va pesar per al processament de materials a nanoescala i es va processar al molí mesclador amb una freqüència de 25/s i una oscil·lació de 20 segons durant tres repeticions. Es va utilitzar PBS per dissoldre i preparar una solució d'emmagatzematge de 25 mg/mL, seguida de 30 min d'ultrasons, autoclau i, finalment, emmagatzematge a -20 ◦ C.

Control de qualitat dels components actius deC. tubulosaper HPLC

L'ECH i el VER contenien elució en gradient amb sílice enllaçada amb octadecilsilà com a farciment, metanol com a fase mòbil A i 0, 1% solució d'àcid fòrmic com a fase mòbil B. La longitud d'ona de detecció era de 330 nm. L'ICA contenia elució en gradient amb sílice unida a octadecilsilà com a farciment i acetonitril-aigua (30:70) com a fase mòbil. La longitud d'ona de detecció va ser de 270 nm. La mostra, el control i el control negatiu es van mesurar com a 10 µL cadascun per a la prova.

Cultiu cel·lular i assaig MTT per mesurar la viabilitat de MPP+-Cèl·lules tractades

Les cèl·lules MES23.5 es van inocular amb sèrum de vedella fetal al 5%, glutamina a l'1%, solució de Sato al 2% 50x i medi DMEM/F12 amb penicil·lina/estreptomicina al 2%. Es van incubar a 37◦C en una incubadora al 5% de CO2 amb humitat saturada. Les cèl·lules es van aïllar i es van passar amb tripsina al 0, 25% i la suspensió cel·lular es va recollir en la fase de creixement logarítmic. Les cèl·lules aïllades amb una densitat d'1 × 105 es van sembrar en plaques 96-revestides de polilisina, seguida de l'addició de diferents concentracions finals (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 i 800 µmol/L). ) dels mitjans MPP+. Les cèl·lules MES23.5 que es van incubar amb medi de cultiu normal durant 24 h i 48 h es van utilitzar com a controls negatius en els experiments in vitro. Les cèl·lules dels diferents grups de tractament es van incubar amb reactiu MTT durant 4 h. Posteriorment es va descartar la solució dels pous i es van afegir 150 µL de DMSO i es va fer oscil·lar durant 10 min. L'absorbància de cada mostra a una longitud d'ona de 570 nm es va mesurar mitjançant un lector automàtic de microplaques. El percentatge de viabilitat cel·lular (%)=absorbància mitjana del grup experimental/absorbància mitjana del grup control negatiu × 100%.

Es van afegir concentracions rellevants de medi MPP+ per al tractament 24-hora a les cèl·lules MES23.5 utilitzant el mateix enfocament que per al cultiu in vitro. Després del tractament, es va descartar la solució del pou. Es van afegir medis que contenien diferents concentracions (10, 50, 100, 200, 250, 500 i 1000 µg/mL) de nanopols de C. tubulosa a les cèl·lules MES23.5 en diferents pous i es van deixar incubar durant 24 h i 48 h. Les cèl·lules MES23.5 que es van incubar amb medi de cultiu normal durant 24 h i 48 h es van utilitzar com a controls negatius. Les cèl·lules MES23.5 que es van incubar amb medi MPP + es van utilitzar com a vehicle. Les mesures es van fer per triplicat per a cada mostra. Es va mesurar l'absorbància dels grups de tractament i control corresponents per calcular la viabilitat cel·lular.

EXTRACTE NATURAL DE CISTANCHE TUBULOSA ANTI FATIGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Expressió de TH mesurada per immunocitoquímica

Quan la nanopols de C. tubulosa estava en 100, 200 i 250 µg/ml, la taxa de supervivència cel·lular va augmentar significativament (figura 2G). Així, en experiments posteriors, vam provar les tres concentracions: grups de dosis baixa, dosis mitjanes i dosis altes. Es van provar tres rèpliques per a cadascun dels grups de C. tubulosa. Es van col·locar cobertors esterilitzats i recoberts de polilisina en plaques de 6-pous. A continuació, es van sembrar 5 × 104 cèl·lules a cada pou i es van incubar durant 24 h. El medi fresc convencional es va substituir al grup control normal i es va substituir una concentració final de 100 µmol/L de medi MPP+ als grups de tractament restants per incubar durant 24 h. A continuació, es van substituir medis frescos convencionals en els grups de control i vehicles normals, i es van incubar concentracions finals de nanopols de C. tubulosa de 100, 200 i 250 µg/mL amb les cèl·lules durant 24 h a la dosi baixa, moderada i alta. grups de tractament de C. tubulosa, respectivament. Les cèl·lules MES23.5 dels diferents grups es van rentar tres vegades en PBS per eliminar el sobrenedant i es van fixar més en paraformaldehid al 4% durant 15 min. Després de rentar-se amb PBS, les cèl·lules es van incubar amb un bloquejador de peroxidasa a 37 ◦ C durant 30 min i després es van rentar de nou amb PBS. Es va utilitzar una solució de Triton X-100 al 0, 2% per a la permeabilització cel·lular durant 10 min, seguida de rentat amb PBS. Es va afegir sèrum normal de cabra a cada mostra i es va incubar a temperatura ambient durant 30 min. A continuació, es va eliminar el sèrum de cabra normal i es va afegir l'anticossos primari diluït 1:400 en PBS a cada mostra i es va incubar a 4 ◦ C durant la nit. Les cèl·lules del grup de control negatiu es van incubar amb PBS a 4 ◦ C durant la nit. Després de rentar-se amb PBS, les cèl·lules es van incubar amb anticossos secundaris marcats amb biotina a la cambra d'humitat a 37 ◦ C durant 20 min. A continuació, es va rentar cada mostra en PBS i es va etiquetar amb conjugats de peroxidasa de rave picant-estreptavidina (solució de treball C) a 37 ◦ C durant 20 min. Després de rentar-se amb PBS, les cèl·lules es van tacar amb reactiu DAB a la foscor durant aproximadament 1-10 min i es va controlar el desenvolupament d'un color marró sota microscòpia de llum. A continuació, es va rentar cada mostra dues vegades amb aigua destil·lada durant 1-2 min i els nuclis es van tacar amb una solució d'hematoxilina durant 0,5-1 min. Després d'esbandir a fons cada mostra amb aigua, les cèl·lules es van submergir en alcohol d'àcid clorhídric a l'1% per a la diferenciació i amoníac aquós a l'1%, seguit de rentar les cèl·lules a fons amb aigua. Les cèl·lules de cada mostra es van deshidratar en etanol al 70% durant 2 min, 80% etanol durant 2 min, 90% etanol durant 2 min dues vegades, 95% etanol durant 2 min dues vegades i 100% etanol durant 2 min dues vegades. A continuació, les cèl·lules es van submergir en una solució de xilè durant 2 minuts dues vegades i es van muntar en un portaobjectes de vidre amb resines neutres. Sota microscòpia de llum, cada mostra es va sotmetre a una captura d'imatges i una selecció aleatòria de 5 a 10 camps visuals efectius per determinar l'expressió de proteïnes seleccionades a les neurones dopaminèrgiques indicades per la intensitat de les partícules marrons i per semiquantificar el contingut de proteïnes pel seu valor de gris mitjà. .

Taxa d'apoptosi de cèl·lules MES23.5 mesurada per citometria de flux

Les cèl·lules adherides es van rentar una vegada amb PBS. Per a l'aïllament cel·lular, es va afegir una quantitat adequada de solució de tripsina sense EDTA a temperatura ambient i es va pipetear suaument la solució per permetre que les cèl·lules adherides es desprenguin. A continuació, es va afegir un medi de cultiu cel·lular per aturar la tripsinització. La barreja es va transferir a un nou tub de centrífuga i després es va centrifugar durant 5 min a 1500 rpm per recollir les cèl·lules aïllades. Després de descartar el sobrenedant, es va tornar a suspendre suaument el pellet cel·lular mitjançant PBS i es van comptar les cèl·lules. Es van centrifugar aproximadament entre 1 × 105 i 5 × 105 cèl·lules resuspeses durant 5 min a 1500 rpm i es va descartar el sobrenedant. Es van afegir cinc microlitres de solució d'unió d'Annexina V-FITC al pellet cel·lular per resuspendre suaument les cèl·lules. Es van afegir 5 µL més d'Annexina V-FITC i es van barrejar a fons. Es van utilitzar cinc microlitres de solució de iodur de propidi per a la tinció cel·lular incubant a temperatura ambient durant 10 minuts poc abans de la citometria de flux.

Anàlisi Western Blot perin vitro

Les cèl·lules es van dividir en un grup normal, grup de tractament MPP +, de dosis baixesC. tubulosagrup de tractament, grup de tractament amb dosis moderades de C. tubulosa i grup de tractament amb dosis altes de C. tubulosa. Es va mesurar l'expressió de Bcl2 i Bax en cadascun. Es van utilitzar un total d'1 × 105 cèl·lules per pou a la placa 6-pou per a la modelització i el tractament a cada grup abans de la recol·lecció de cèl·lules. Es va afegir un lisat mixt, que contenia tampó RIPA, inhibidor de proteasa i inhibidor de fosfatasa, per lisar les cèl·lules durant 30 min sobre gel. Després de la centrifugació, el sobrenedant es va utilitzar per a l'anàlisi de proteïnes. La proteïna total es va quantificar mitjançant un assaig de BCA i es va separar per un 10% de SDS-PAGE. Les proteïnes separades es van transferir a una membrana i es van incubar amb un tampó de bloqueig de llet desnatada al 5% a temperatura ambient durant 2 h. A continuació, es va incubar la membrana en anticossos primaris (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, dilució 1:200) a 4◦C durant la nit. Després d'un pas de rentat, la membrana es va incubar en un anticòs secundari (0, 5 mg/ml, dilució 1:5000) a 4 ◦ C durant 1 h i després en un desenvolupador ECL durant 2 min per al desenvolupament convencional. Es va utilitzar el programari Quantity One per a l'anàlisi semiquantitativa de l'expressió de proteïnes.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A ANTIFATIGA PROTEGEIX EL FEGGE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Modelatge d'animals experimentals i administració de fàrmacs

Cinquanta ratolins mascles lliures de patògens específics 8-setmanes es van dividir aleatòriament en cinc grups: un grup normal, un grup de tractament MPTP (vehicle), un grup de tractament amb dosis baixes de C. tubulosa, un tractament amb dosis moderades de C. tubulosa grup i grup de tractament amb dosis altes de C. tubulosa. Els animals es van allotjar a 20-22 ◦ C amb accés gratuït a menjar i aigua. Els ratolins del grup normal es van injectar per via intraperitoneal amb un volum igual de solució salina normal durant set dies consecutius. Els ratolins dels altres grups de tractament es van injectar intraperitonealment amb MPTP (30 mg/kg/d) durant set dies consecutius per establir vehicles.

Durant el modelatge de PD, als ratolins dels grups de tractament amb C. tubulosa de dosis baixes, moderades i altes se'ls va administrar intragàstricament volums clínics equivalents de 4 g/kg/d, 8 g/kg/d i 16 g/d. kg/dC. tubulosa nanopols, respectivament, durant 14 dies consecutius. Als ratolins dels grups control i vehicle se'ls va administrar intragàstricament volums equivalents de solució salina normal durant 14 dies consecutius. Tots els procediments experimentals van ser aprovats pel Comitè Ètic de la Universitat de Fujian de TCM i es van realitzar d'acord amb els principis acceptats internacionalment per a l'ús i la cura dels animals de laboratori. En aquest estudi es van fer tots els esforços per minimitzar el patiment dels animals.