Efecte dels extractes de Cistanche Tubulosa sobre la funció reproductiva masculina en rates diabètics induïdes per estreptozotocina-nicotinamida-Ⅱ

3.2. Anàlisi in vivo

3.2.1. Efectes del CTE sobre el pes corporal i la ingesta de calories

Després de 6 setmanes d'experimentació, el grup diabètic (HFD-DM) va mostrar un pes corporal més gran que el grup control. El grup HFD-DME4 va mostrar un pes corporal més baix que els grups HFD-DM i HFD-DMER (figura 7a). La ingesta de calories del grup control va ser significativament menor que en els altres grups. No hi va haver cap diferència significativa entre la ingesta de calories dels altres cinc grups (figura 7b).

3.2.2. Prova de tolerància a la glucosa oral (OGTT) per determinar la inducció amb èxit de la diabetis

La prova de tolerància a la glucosa oral (OGTT) s'utilitza com una eina prometedora per detectar la diabetis mellitus. L'augment dels nivells de glucosa a la sang indica la condició diabètica. Com es mostra a la figura 8a, el nivell de glucosa plasmàtica era més baix en els grups CTE que en el grup DM a 0, 30, 90 i 120 min. A més, l'àrea sota la corba (AUC) de la concentració de glucosa plasmàtica va mostrar que en els grups CTE i RSG, la taxa de captació de glucosa en sang va augmentar (figura 8b).

3.2.3. Continguts totals de glucosa, colesterol i triglicèrids en plasma

El nivell de glucosa en sang plasmàtica en dejuni va ser més alt en el grup DM i més baix en el grup DME2 (excepte control) que en altres. No hi va haver cap diferència significativa en el colesterol total entre els grups excepte pel grup DME4. En el grup DME4, el nivell de colesterol era més baix que els altres. El nivell de triglicèrids va ser més alt en el grup DM i més baix en el grup DME4 i el contingut de triglicèrids va disminuir amb un augment de la concentració de CTE (taula 2). Els resultats mostren que el nivell de glucosa plasmàtica, colesterol i triglicèrids era més alt en el grup de DM i el nivell es va reduir significativament amb el tractament amb CTE.

3.2.4. Nivells d'insulina plasmàtica, nivell de leptina plasmàtica i avaluació del model d'homeòstasi: valors de resistència a la insulina (HOMA-IR)

Els nivells d'insulina plasmàtica, leptina i valors de HOMA-IR es mostren a la taula 3. El grup de DM tenia nivells d'insulina i leptina plasmàtica més alts que el grup control. L'índex HOMA-IR també va ser significativament més alt en el grup DM. Els valors plasmàtics d'insulina, leptina i HOMA-IR es van reduir amb un augment de la concentració de CTE. La leptina plasmàtica es va reduir significativament en els grups CTE, però el grup de fàrmacs RSG (DMR) no va mostrar cap diferència significativa amb el grup DM.

3.2.5. Efecte del CTE sobre els nivells de LH i testosterona en plasma en rates diabètics

Com es mostra a la taula 4, les concentracions de testosterona en rates diabètics (DM) es van reduir significativament, mentre queles concentracions de testosterona van augmentar significativamenta diferents dosis de CTE. A més, els resultats van mostrar una lleugera disminució del nivell de LH en el grup DM en comparació amb DMR, DME1, DME2 i DME4. La producció de LH va ser més alta al grup DME4.

3.2.6. Efecte del CTE sobre els paràmetres de l'esperma de rates diabètics

Els resultats experimentals van mostrar que el grup DM va tenir una disminució significativa del nombre i la motilitat d'espermatozoides que el grup control, mentre que la taxa d'anormalitat espermàtica va augmentar significativament en el grup DM. Curiosament, el nombre d'espermatozoides, la motilitat dels espermatozoides i la taxa d'anormalitats espermàtiques del grup DMR van millorar, però la motilitat dels espermatozoides no arriba a un nivell significatiu en comparació amb DME4. DME2 va mostrar un millor recompte d'espermatozoides que tots i la taxa de motilitat va augmentar significativament al grup DME4. No hi va haver cap diferència significativa entre el nombre d'espermatozoides anormals entre els grups tractats amb RSG i CTE (taula 5).

3.2.7. Efecte del CTE en la morfologia dels túbuls seminífers en rates diabètics

La figura 9 mostra la tinció H&E de la secció de testicles. La fletxa negra indica la cel·la de Leydig i la fletxa blanca indica la cel·la de Sertoli. Tant la cèl·lula de Leydig com la de Sertoli del grup DM van mostrar una atròfia significativa i es va observar una cavitat a la llum. L'estructura de les cèl·lules de Leydig i de Sertoli es va restaurar en grups tractats amb CTE i RSG. El gruix del túbul seminífer va ser més gran en els grups CTE i RSG que en el grup DM.

3.2.8. Efecte del CTE en els MRNA KiSS1, GPR54, SOCS-3 i SIRT1 a l'hipotàlem de rates diabètics

L'expressió de KiSS1 (Figura 10a), GPR54 (Figura 10b), SOCS -3 (Figura 10d) i SIRT1 (Figura 10c) es va mostrar a la Figura 10. L'expressió d'ARNm de KiSS1 i el receptor GPR54 en rates diabètiques va ser significativament menor que en el grup control. Els nivells d'expressió d'ARNm KiSS1 i GPR 54 a DMR, DME1, DME2 i DME4 van augmentar significativament. En particular, l'expressió d'ARNm de GPR54 va augmentar significativament a DME4 i era gairebé similar al grup control.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER PROTEGER LA PRODUCCIÓ DE TESTOSTERONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Aquest experiment va explorar encara més la quantitat d'ARNm SOCS-3 i SIRT1 a l'hipotàlem de rates. L'expressió de l'ARNm de SOCS-3 en rates diabètiques va augmentar significativament, cosa que indica que la impedància de la leptina era més greu. Els grups DMR, DME1, DME2 i DME4 van mostrar millores significatives en comparació amb el grup diabètic. L'expressió d'ARNm de SIRT1 en el grup DM va disminuir significativament i va augmentar significativament en els grups DME1 i DME4.

3.2.9. Efecte del CTE sobre els enzims antioxidants en el plasma i els testicles de rates diabètics

La taula 6 mostra que l'activitat de SOD plasmàtica, l'activitat de GPx i l'activitat de catalasa de rates diabètics es van reduir significativament i les activitats van augmentar en els grups tractats amb CTE i RSG. A més d'això, DME4 va mostrar millores significatives en l'activitat GPx que altres. Els resultats van mostrar que les activitats de SOD i catalasa a les rates diabètiques es van reduir significativament després de sis setmanes. L'activitat SOD i catalasa del grup DMR no arriba a un nivell significatiu. Els grups tractats amb CTE van mostrar millores significatives en l'activitat SOD i catalasa. L'augment de les activitats de catalasa i SOD en grups CTE també es va observar als testicles (taula 7). La major activitat de SOD i catalasa es va observar al grup DME1 i als grups DME2 respectivament.

3.2.10. Efectes del CTE sobre l'estrès oxidatiu i la inflamació al plasma i testicles de rates diabètics

La producció d'òxid nítric (NO) al plasma (figura 11a) i testicles (figura 11b) es va mostrar a la figura 11. La producció de NO al grup DM va augmentar significativament tant al testicle com al plasma en comparació amb el grup control. Es va observar una reducció gradual de la producció de NO als grups DME1, DME2 i DME4 (al plasma). El grup DMR també va mostrar una reducció significativa de la producció de NO. En el cas del testicle, es va observar una lleugera reducció de la producció de NO en els grups CTE, mentre que el grup DMR no va reduir significativament la producció de NO.

Com es mostra a les figures 12 i 13, els nivells de TNF- i IL-6 van augmentar significativament en rates diabétiques (tant al plasma com als testicles), cosa que indica que la inflamació és més greu. Al plasma, el nivell de TNF- és similar als grups tractats amb CTE i RSG (figura 12a). Els grups CTE (especialment DME2) van reduir significativament el nivell de TNF- al testicle (figura 12b). El nivell d'IL-6 es va reduir significativament al plasma dels grups CTE i RSG (figura 13a). Al testicle, hi va haver una tendència a una reducció del nivell d'IL-6, però això no va assolir un nivell significatiu (figura 13b).

3.2.1.1. Efectes del CTE sobre l'estrès oxidatiu i la inflamació en els espermatozoides de rates diabètics induïts per una dieta alta en greixos

La figura 14 mostra el contingut d'anions superòxid en l'esperma de rata. Els resultats van mostrar que la producció d'anions superòxid en l'esperma de rates diabètics va augmentar significativament i no es va observar cap millora significativa en el grup DMR. Els grups DME1 i DME4 van mostrar una producció significativament reduïda d'anió superòxid.

3.2.12. Efectes de la CTE sobre la peroxidació lipídica en espermatozoides de rates diabètics induïts per una dieta alta en greixos

Els estudis han demostrat que la peroxidació lipídica va augmentar tant en pacients amb diabetis tipus 1 com en tipus 2 [19]. El nivell de malondialdehid (MDA) en plasma, espermatozoides i testicles es mostra a la taula 8. El nivell de MDA en plasma, testicles i espermatozoides del grup DM va ser significativament més alt i el tractament amb CTE i RSG va reduir la producció de MDA. Es va observar una reducció significativa en els grups DME4 i DMEI al plasma. Aquest estudi va trobar que les rates diabètiques no només van augmentar el grau de peroxidació lipídica al plasma, sinó que també van augmentar els testicles i els espermatozoides. Es va observar una millora significativa a diverses dosis de CTE.

4. Discussió

La diabetis és una malaltia crònica associada a un alt nivell de sucre a la sang. El desequilibri entre els nivells d'antioxidants i ROS conduirà a la condició anomenada estrès oxidatiu. El superòxid, el radical hidroxil, el peròxid d'hidrogen, l'òxid nítric i l'oxigen singlet són alguns dels exemples de ROS que contribuiran a les condicions de diabetis mitjançant l'estrès oxidatiu [20].Cistanche tubulosaés una planta del desert que conté components actius com arapolisacàrids, oligosacàrids, glicòsids feniletanoides (equinacòsid, verbascòsid), àcid palmític, àcid linoleic, iridoides, alditols i lignans. Aquesta planta és capaç de produir efectes antiinflamatoris, neuroprotectors, antibacterians, antivirals, antioxidants, antitumorals i immunomoduladors [21]. Els estudis bibliogràfics mostren que els glicòsids feniletanoides de Cistanche tubulosa són la raó principal de l'activitat antioxidant [22]. El resveratrol (RES) i la rosiglitazona (RSG) es van prendre com a control positiu per als estudis in vitro i in vivo respectivament. RSG és un potent sensibilitzador de la insulina i té una afinitat cap a la isoforma del receptor activat per proliferador de peroxisomes (PPARc). Controla la hiperglucèmia en pacients diabètics [23]. RES té activitat antioxidant natural i actua com a vasodilatador, regula el metabolisme de les lipoproteïnes, inhibeix l'agregació plaquetària i prevé el càncer [24,25]. La nostra investigació va indicar que l'ECH mostra una millor activitat d'eliminació de radicals que CTE i RES (figura 1). També s'entén que l'ECH no causa cap toxicitat significativa a les cèl·lules LC-540 i TM3 Leydig (figura 2).

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA FUNCIÓ SEXUAL MASCULINA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Els AGE es van utilitzar per induir condicions d'estrès a les cèl·lules de Leydig. La producció d'AGE, la inflamació, l'estrès oxidatiu i la diabetis estan interconnectades. La condició hiperglucèmica de la diabetis afavoreix la lesió cel·lular mitjançant la producció d'AGE i estrès oxidatiu. Els AGE indueixen la toxicitat cel·lular, que afavoreix encara més el reclutament de cèl·lules immunitàries i la mort cel·lular. Un nivell elevat d'AGE afavoreix l'expressió de dos tipus de receptors anomenats RAGE i AGER1 [26]. El degoteig i la posterior transferència d'un electró de la cadena respiratòria mitocondrial a l'oxigen molecular durant l'estrès oxidatiu dóna lloc a la formació d'un anió superòxid. Els nostres resultats mostren que la producció d'anió superòxid induïda per AGE es va incrementar en el grup control i es van observar millores addicionals tant amb els tractaments amb ECH com amb RES. Segons el nostre estudi, es va entendre que la producció de superòxid (Figura 3) i H2O2 (Figura 4) induïda pels AGE es va reduir en presència d'ECH i RES.

NF-κB es coneix com el mediador important de la inflamació associat a la diabetis [27]. L'expressió de NF-κB condueix a la disfunció cel·lular i la mort cel·lular. L'activació de NF-κB per estrès oxidatiu estimula la resposta proinflamatòria, la regulació de l'endotelina i l'apoptosi [28]. L'expressió de RAGE i NF-κB es va augmentar en grups estimulats per AGE i es va observar la reducció posterior a les cèl·lules tractades amb ECH i RES (figura 5).

Testosteronaés un esteroide anabòlic i primarihormona sexual masculinasintetitzat a partir del colesterol. El procés comença amb la divisió oxidativa de la cadena lateral del colesterol per part del gen de divisió de la cadena lateral del colesterol (CYP11A). Aquest gen es localitza a la membrana mitocondrial i converteix el colesterol en pregnenolona. A continuació, el gen CYP17A1 del reticle endoplasmàtic elimina dos àtoms de carboni addicionals i produeix múltiples esteroides C19. A més d'això, la pregnenolona s'oxida per formar androstenediona/progesterona per la hidroxiesteroide deshidrogenasa (3- -HSD). Finalment, la testosterona es produeix mitjançant la reducció del grup ceto a la posició de carboni 17 de l'androstenediona per 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (17- -HSD). Les cèl·lules de Leydig estan implicades en la producció principal de testosterona. La transferència de colesterol a la membrana mitocondrial interna requereix l'acció de la proteïna reguladora aguda esteroidogènica (StAR). Els estudis actuals mostren que l'expressió de StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 es va reduir a les cèl·lules tractades amb AGE (control) i es va mostrar un augment enorme a les cèl·lules tractades amb ECH i RES (Figura 6). . Així, els resultats mostren que la producció deLa testosterona va augmentar en els grups tractats amb ECH i RES. 

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DEL PODER SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Durant una condició diabètica, el transport de glucosa als òrgans és limitat i, com a resultat, els nivells de glucosa augmenten [29]. Per tant, la condició hiperglucèmica és un dels marcadors importants per a la detecció de la diabetis. Els nostres estudis mostren que el nivell de glucosa plasmàtica va augmentar en els grups diabètics i l'AUC del grup DM va ser significativament més gran que els altres grups (figura 8). Juntament amb la glucosa plasmàtica, el contingut total de colesterol i triglicèrids va augmentar significativament en el grup DM (taula 2). L'aterosclerosi es veu facilitada per un augment del nivell de colesterol i triglicèrids [30]. Tanmateix, el nivell de colesterol i triglicèrids es va reduir en els grups tractats amb CTE i RSG. El contingut de triglicèrids del grup DME4 va assolir valors gairebé similars als del grup control.

La insulina és una hormona produïda per les cèl·lules del pàncrees i funcionalitzada per controlar els nivells de sucre en sang al cos, mentre que la leptina és una hormona produïda pels adipòcits que són capaços de regular la ingesta d'aliments i la utilització d'energia. Els estudis van indicar que la leptina està implicada en la fisiopatologia de l'obesitat i hi ha una interacció positiva entre la leptina i la insulina [31]. Els nostres estudis mostren que el nivell d'inulina i leptina plasmàtiques eren més alts en el grup de DM i el nivell d'insulina es va reduir amb un augment de la concentració de CTE. El grup RSG no mostra cap diferència significativa amb el grup DM. La resistència a la insulina i la funció cel·lular es van avaluar mitjançant el mètode HOMA-IR. El valor HOMA-IR va augmentar en el grup DM i va ser significativament diferent d'altres grups (taula 3).

La DM afecta la funció reproductiva mitjançant l'alternança hormonal en l'eix HPG i els estudis van revelar que l'expressió d'insulina al testicle també es veu afectada per la diabetis. Es caracteritza per la vacuolització de les cèl·lules de Sertoli, l'augment de la fragmentació de l'ADN, la alteració de l'espermatogènesi i l'augment de l'esgotament de les cèl·lules germinals. L'estrès oxidatiu també contribueix a anomalies en la funció reproductiva [32]. El procés de formació dels espermatozoides en l'òrgan reproductor masculí (testicles) s'anomena espermatogènesi. El testicle està format per túbuls ben enrotllats anomenats túbuls seminífers. Les cèl·lules de Sertoli es veuen a les parets del túbul seminífer i proporcionen aliment als espermatozoides immadurs. La investigació dels paràmetres espermàtics va indicar que el nombre d'espermatozoides i la motilitat van disminuir i les anomalies van augmentar en el grup de DM (taula 5). Es va observar un efecte contrari en els grups tractats amb CTE i RSG. Tant les cèl·lules de Leydig com les de Sertoli del grup DM van mostrar una atròfia significativa i la cavitat es va veure al lumen. El gruix del túbul seminífer també va disminuir en el grup DM. Es va observar un resultat millorat en grups tractats amb CTE i RSG (figura 9). A més d'això, el nivell de LH i testosterona va disminuir en el grup de DM i els nivells van augmentar en els grups tractats amb CTE (taula 4). En els homes, la testosterona sèrica baixa i la freqüència de pols de LH més baixa es van associar sovint amb l'obesitat i la diabetis mellitus tipus 2 [33].

Les kisspeptines codificades pel gen KiSS1 es coneixen com el potent estimulador de l'eix HPG i qualsevol mutació en el gen kisspeptina conduirà a nivells baixos d'esteroides sexuals i gonadotropina. Els estudis mostren que en rates diabétiques induïdes per STZ, els nivells d'ARNm de Kiss1 es van reduir [33]. L'inici i el manteniment de la infertilitat dels mamífers estan connectats amb el receptor 54 acoblat a proteïnes G (GPR54). La mutació en GPR 54 es caracteritza per l'absència de maduració sexual i nivells baixos d'hormones gonadotròpiques (LH i FSH). Les citocines proinflamatòries com la IL-6 i el TNF regulen l'expressió del supressor de la senyalització de citocines 3 (SOCS3) implicat en la resistència a la insulina mediada per la inflamació al fetge i als adipòcits [34]. SIRT 1 és un gen associat a la regulació de diverses malalties de l'envelliment. Aquest gen s'expressa de manera destacada a les cèl·lules del pàncrees i regula la secreció d'insulina i prevé l'apoptosi. Els estudis actuals van indicar que l'expressió de KiSS1, GPR54 i SIRT1 va disminuir en el grup DM, però l'expressió va augmentar en els grups tractats amb CTE (figura 10). Un augment de les expressions SOCS-3 al grup DM indica la condició inflamatòria. El primer enllaç molecular identificat entre l'obesitat i la inflamació va ser el TNF-. Per tant, un augment del nivell de TNF- és un indicador d'inflamació. La disminució del nivell de citocines proinflamatòries com ara TNF i IL-6 es va observar en grups tractats amb CTE (figures 12 i 13).

El desequilibri entre ROS i antioxidants condueix a la condició diabètica. La superòxid dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) i la glutatió peroxidasa (GPX) es coneixen com els principals antioxidants responsables de mantenir el nivell òptim de ROS [35]. A partir dels resultats, es va trobar que l'activitat dels antioxidants era significativament menor en el grup DM. Els grups tractats amb TC van mostrar millores en la producció d'antioxidants. El grup tractat amb RSG no va mostrar cap millora significativa en l'activitat antioxidant (taules 6 i 7).

L'òxid nítric (NO) es coneix com un important ROS que contribueix a la inflamació. Els nostres estudis assenyalen que el nivell de NO es va reduir en els grups tractats amb CTE (figura 11). Els resultats van mostrar que el contingut d'anions superòxid en l'esperma de rates diabètics va augmentar significativament i no hi va haver cap millora significativa després de l'administració de RSG. La producció de superòxid es va reduir en els grups CTE.

La determinació de MDA és molt útil per avaluar la peroxidació lipídica. La peroxidació lipídica és el procés d'oxidació dels lípids i finalment provoca danys cel·lulars. MDA es produeix com a resultat de la peroxidació lipídica d'àcids grassos poliinsaturats. Els estudis mostren que el nivell de MDA es correlaciona amb l'edat i el nivell de glucosa en sang en dejú [36]. L'estudi actual indica que el CTE millora la peroxidació lipídica en plasma, testicles i espermatozoides (taula 8).

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Conclusions

L'estrès oxidatiu durant les condicions de diabetis pertorba el sistema reproductor masculí a causa del deteriorament dels espermatozoides i la disfunció gonadal. Cistanche tubulosa és una planta del desert molt acceptada en la medicina xinesa pels seus efectes farmacològics.Echinacòsid (ECH)és el principal constituent del CTE responsable de les seves activitats antioxidants i antiinflamatòries. Els nostres resultats in vitro van indicar que l'ECH va restaurar la via de síntesi de testosterona i va reduir el nivell d'expressió de proteïnes NF-κB i RAGE. ECH va inhibir eficaçment la producció d'anió superòxid i H2O2 a les cèl·lules de Leydig. Els estudis in vivo van revelar que l'ECH va reduir els nivells de colesterol, triglicèrids, TNF- i IL-6. A més d'això, es van millorar significativament les expressions d'ARNm a l'hipotàlem de les rates diabètiques. També cal destacar que l'ECH va reduir la peroxidació lipídica i va millorar la resistència a la insulina en rates mascles diabètics. Les activitats antioxidants van augmentar tant al plasma com als testicles. Per tant, els nostres estudis van suggerir que l'ECH proporcionava una protecció eficaç contra la disfunció reproductiva en rates mascles diabètics induïdes per STZ.