Efecte de l'extracte aquós de Cistanches Herba sobre la pèrdua òssia en rata ovariectomitzada

Contacte: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Haidong Liang 1*, Fang Yu 2, Zhihong Tong 1 i Zaiguo Huang 3

1 Hands and feet microsurgery, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, China; E-Mail: tongzhih37@sina.cn

2 School of Medicine, Dalian University, Dalian 116033, China; E-Mail: yufangk7@sina.cn

3 Orthopedics Department, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, China; E-Mail: huangzg41@sina.com

Resum:Per avaluar la capacitat de l'extracte de Cistanches Herba (CHE) de la medicina tradicional xinesa per prevenir la pèrdua òssia a la rata ovariectomitzada (OVX), es va administrar extracte de Cistanches Herba (CHE) per via intragàstrica a les rates. Les rates femelles van ser anestesiades amb pentobarbital sòdic (40 mg kg-1, ip) i els seus ovaris es van eliminar bilateralment. Les rates del grup d'operacions simulades van ser anestesiades, laparotomies i suturades sense eliminar els ovaris. Després d'una setmana de recuperació de la cirurgia, les rates OVX es van dividir aleatòriament en tres grups i es van tractar per via oral amb H2O (grup OVX) o CHE (100 o 200 mg kg-1 diaris) durant 3 mesos. El grup simulat (n=8) es va tractar per via oral amb H2O. Després de 3 mesos, es van examinar la densitat mineral òssia (BMD), el contingut mineral ossi (BMC), l'índex biomecànic ossi, els nivells de minerals en sang i les activitats d'enzims antioxidants en sang en rates operades simulades, ovariectomitzades i tractades amb extracte de Cistanches Herba. Els resultats van mostrar que el tractament amb extracte de Cistanches Herba va millorar significativament la densitat mineral òssia (BMD), el contingut mineral ossi (BMC), la càrrega màxima, el desplaçament a la càrrega màxima, l'estrès a la càrrega màxima, la càrrega al trencament automàtic, el desplaçament al trencament automàtic. , i l'estrès a la ruptura automàtica i les activitats dels enzims antioxidants en sang, van reduir els nivells de Ca, Zn i Cu en sang en comparació amb el grup OVX. Aquest experiment demostra que l'administració d'extracte de Cistanches Herba a rates ovariectomitzades reverteix la pèrdua òssia i prevé l'osteoporosi.

Paraules clau:ovariectomia; rata; os; antioxidant; Cistanches Herba

Cistanches Herba

1. Introducció

L'osteoporosi és una malaltia de l'envelliment associada a la pèrdua òssia que sovint es produeix sense símptomes fins que el deteriorament de la microarquitectura esdevé tan significatiu que la fractura òssia es produeix invariablement en el punt en què la reducció de la massa òssia està per sota del que es requereix per a la integritat òssia. L'osteoporosi és de gran importància en l'atenció sanitària. Encara que tenen una massa reduïda, els ossos són normals pel que fa a la mineralització, però histològicament, hi ha una disminució del gruix de l'escorça i del nombre i la mida de les trabècules de l'os esponjoso gruixut [1–3].

En els últims anys s'han fet molts estudis sobre aquesta malaltia. Les dades acumulades han indicat que la pèrdua d'estrògens a la menopausa és un contribuent important a la patogènesi de la malaltia perquè aquesta hormona és un regulador negatiu principal de l'activitat dels osteoclasts [4–6], i els osteoclasts són les principals cèl·lules responsables de la remodelació òssia en l'osteoporosi. [7].

L'osteoporosi postmenopàusica és la malaltia metabòlica òssia més freqüent, es caracteritza per una ràpida pèrdua de teixit ossi mineralitzat, alteració de l'arquitectura trabecular de l'os i canvis en les propietats cristal·lines dels dipòsits minerals, que donen lloc a una fallada estructural (fractura) de l'os. llocs rics en os esponjosos, com les vèrtebres, el maluc i l'avantbraç distal [8–11]. La deficiència d'estrògens es considera el principal determinant de la pèrdua òssia en dones postmenopàusiques. Les rates i gossos ovariectomitzats s'han utilitzat àmpliament en models d'osteoporosi. El 1996, es van informar dels efectes de l'ibandronat en gossos ovariectomitzats [12].

Cistanches Herba (CH), planta holoparàsita de Cistanche deserticola YC Ma, es classifica com a agent tonificant en la medicina tradicional oriental i s'utilitza habitualment per tractar l'oblit, la pèrdua d'audició, la infertilitat i el restrenyiment crònic. CH té diverses activitats farmacològiques, incloent efectes antinociceptius, antiinflamatoris i immuno-potenciadors [13,14]. Un estudi anterior ha informat que Cistanches Herba pot guiar les cèl·lules mare mesenquimals òssies (BMSC) per diferenciar-se en osteoblasts, cosa que promet una perspectiva favorable per al tractament de l'osteoporosi i la desunió de fractures òssies [15]. Chen et al. [16] va informar que els polisacàrids de Cistanches Herba poden promoure la transició del cicle cel·lular de la medul·la òssia i la recuperació de la funció hematopoètica en ratolins anèmics deprimits de medul·la òssia, accelerar l'hematogènesi en la soca rubrum i la soca del macronucli.

En aquest estudi, es van examinar la densitat mineral òssia (BMD), el contingut mineral ossi (BMC), l'índex biomecànic ossi, els nivells de minerals en sang i les activitats d'enzims antioxidants en sang en rates operades simulades, ovariectomitzades i tractades amb Cistanches Herba per estudiar els efectes del tractament. amb extracte d'herba Cistanches sobre qualitat òssia.

Medicina tradicional xinesa Extracte d'herba de Cistanches (CHE)

2. Materials i Mètodes

2.1. Preparació d'extractes aquosos d'herba Cistanches

Cistanches Herba es va recollir al desert de la lliga alxa de la regió autònoma de Nei Monggol (Mongòlia Interior) l'any 2010.

La tija seca de Cistanches Herba es va extreure amb aigua destil·lada a 100 graus durant 2 h. La solució es va centrifugar a 4000 r/min durant 10 min. Els residus es van eliminar per filtració i el filtrat combinat es va evaporar escalfant per obtenir la concentració desitjada (2, 1 g d'extracte sec equivalent de planta/ml). El rendiment d'extracció va ser del 13,7 per cent (p/p). L'extracte aquós es va emmagatzemar a 2-8 graus.

2.2. Animals

Per a l'estudi es van utilitzar trenta-dues rates Wistar femelles de 3 mesos d'edat, amb un pes entre 240 i 270 g a l'inici de l'experiment. Es van mantenir en condicions estàndard de laboratori amb un cicle de llum i foscor de 12 h, amb accés gratuït a menjar per a rates de laboratori estàndard i aigua de l'aixeta.

2.3. Experiments amb animals.

Les rates femelles van ser anestesiades amb pentobarbital sòdic (40 mg kg-1, ip) i els seus ovaris es van eliminar bilateralment. Les rates del grup d'operacions simulades van ser anestesiades, laparotomies i suturades sense eliminar els ovaris. Després d'una setmana de recuperació de la cirurgia, les rates OVX es van dividir aleatòriament en tres grups (n=8 a cada grup) i es van tractar intragàstricament amb H2O (grup OVX), extracte de Cistanches Herba (CHE) (100 o 200 mg kg). −1 diari) durant 3 mesos. El grup simulat (n=8) es va tractar per via oral amb H2O.

L'últim dia de l'estudi, es van pesar i sacrificar els animals i es van recollir mostres de sang simultàniament. Els fèmurs es van disseccionar i es van retirar del teixit tou per a la mesura de les proves biomecàniques.

Tots els experiments es van dur a terme d'acord amb els protocols d'investigació establerts pel comitè de cura dels animals de la Xina.

2.4. Densitometria òssia

El contingut mineral ossi femoral (BMC) i la densitat mineral òssia (BMD) es van determinar mitjançant un QDR{{0}}W DXA Hologic. L'instrument es va adaptar per a un mode d'ultraalta resolució amb un interlineat de 0.{0254 cm, una resolució de 0,0127 cm i un col·limador de 0,9 cm de diàmetre. Els ossos es van col·locar en una placa de Petri. Per simular la densitat dels teixits tous que envolten els ossos, es va abocar aigua de l'aixeta al voltant dels ossos per aconseguir una profunditat d'1 cm. Els resultats es donen per BMC i per a l'àrea mesurada. La DMO d'aquesta àrea es calcula com a BMC dividit per àrea. A més dels resultats del fèmur total, es van analitzar la regió distal i mitjana del fèmur com a subregions [17].

2.5. Proves biomecàniques òssies

Els ossos del fèmur es van mantenir a 4 graus fins a la determinació de la resistència a la ruptura mitjançant un dispositiu de flexió de 5-kN, configurat per a proves de flexió de tres punts i connectat a una màquina de prova universal Instron model 4502 equipada amb un 10- Cèl·lula de càrrega kN (Instron, Canton, MA, EUA), tal com es va descriure anteriorment [18]. La velocitat de la creu era de 50 mm/min i la velocitat de mostreig de dades era de 10 mostres/s. La càrrega màxima, la tensió a la càrrega màxima, la càrrega a la fallada i la tensió a la fallada es van determinar als fèmurs mitjançant el programari Sèrie IX, v 8.08.00 (Instron).

2.6. Anàlisi Bioquímica

Els nivells de Ca, Zn i Cu en sang es van mesurar mitjançant espectrofotometria d'absorció atòmica.

Basant-se en el mètode de King i Armstrong [19], es va analitzar l'activitat de la fosfatasa alcalina (ALP) utilitzant fenil fosfat disòdic com a substrat. El color desenvolupat es va llegir a 510 nm en un espectrofotòmetre UV-vis després de 10 min. Les activitats d'ALP es van expressar com a IU/L.

La concentració de malondialchehyche en sang (MDA) es va determinar mitjançant el mètode descrit per Jain et al. [20], basat en la reactivitat de TBA. Breument, 0, 2 ml de grànuls d'eritròcits o sobrenedant obtinguts dels teixits, 0, 8 ml de tampó fosfat (pH 7,4), 0.025 ml de BHT i {{ {19}}Es van afegir 0,5 ml de TCA al 30 per cent als tubs i es van barrejar. Després de 2 h d'incubació a -20 graus, la mescla es va centrifugar (4000 × g) durant 15 min. Després d'això, es va agafar 1 mL de sobrenedant i es va afegir a cada tub, i després 0,075 mL d'EDTA 0,1 M i

Es van afegir 0,25 ml d'1 per cent de TBA. Aquests tubs amb taps de rosca revestits de tefló es van incubar a 90 graus en un bany d'aigua durant 15 minuts i es van refredar a temperatura ambient. La densitat òptica es va mesurar a 532 per a la concentració de MDA en sang.

L'activitat de la glutatió peroxidasa (GSH-Px) es va determinar segons el mètode de Lawrence i Burk [21]. La barreja d'assaig constava de 2,0 ml de tampó fosfat de 75 mM (pH 7,0), 50 μL de glutatió 6{0 mM, {{15} },1 ml de 30 unitats/ml glutatió reductasa, 0,1 ml d'EDTA 15 mM, 0,1 ml de NADPH 3 mM i la quantitat adequada de sobrenedant de teixit fins a un volum final de 3,0 ml . La reacció es va iniciar mitjançant l'addició de 0,1 ml de 7,5 mM d'H2O2. La taxa de canvi d'absorbància durant la conversió de NADPH a NADP plus es va registrar espectrofotomètricament a 340 nm durant 3 min. L'activitat de GSH-Px per als teixits es va expressar com a μmols de NADPH oxidats a NADP més proteïna min-1 mg-1.

L'activitat de la superòxid dismutasa (SOD) es va determinar a la sang segons el mètode de Sun et al. [22]. El principi del mètode es basa en la inhibició de la reducció de tetrazoli nitroblau (NBT) mitjançant l'ús del sistema xantina-xantina oxidasa com a generador de superòxid. L'activitat es va avaluar en els sobrenedants de 10.000 g d'extractes de metanol/cloroform (5/3, v/v) d'homogeneïtats de teixit (10 per cent). Es va definir una unitat de SOD com la quantitat d'enzim que provocava una inhibició del 50 per cent de la taxa de reducció de NBT.

L'activitat de la catalasa (CAT) es va mesurar mitjançant el mètode d'Abei [23]. El sèrum es va afegir a una cubeta que contenia 2,89 ml d'un tampó fosfat de 50 mmol/L (pH 7.0). La reacció es va iniciar afegint 0,1 ml de 30 mmol/L H2O2 acabat de preparar per obtenir un volum final de 3,0 ml a 25 graus. La velocitat de descomposició de H2O2 es va mesurar a 240 nm durant 5 min en un espectrofotòmetre. Una unitat (U) de CAT es va definir com la quantitat d'enzim necessària per descompondre 1 nmol d'H2O2 per min, a 25 graus i pH 7,8.

2.7. Anàlisi estadística

Els resultats experimentals es van expressar com a mitjana ± SD per a vuit animals de cada grup. Els paràmetres bioquímics es van analitzar estadísticament mitjançant una anàlisi unidireccional de la variància ANOVA, seguida de la prova de comparació múltiple de Dunnett (DMCT). P-valor de<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultats

Dos animals van caducar durant el curs de l'estudi. En conseqüència, els números dels grups a la conclusió de l'estudi van ser: 8 en el control simulat; 7 al grup OVX; 7 en el grup de tractament CHE (100 mg kg-1 diari) i 8 en el grup de tractament CHE (200 mg kg-1 diari). Dos dies després de l'operació, la ingesta d'aigua i menjar de les rates va ser lleugerament inferior a la d'abans de l'operació. Cap animal va patir infecció i anabiosi. No es van observar efectes adversos clínicament evidents en rates.

Abans de l'operació, no hi havia cap diferència significativa (p > {{0}}.01) en el pes corporal de les rates entre els grups. El pes corporal del grup OVX va ser significativament (p <{12}}.01) inferior="" al="" del="" grup="" simulat="" (taula="" 1).="" l'administració="" d'extracte="" de="" cistanches="" herba="" a="" una="" dosi="" d'100="" i="" 200="" mg/kg="" al="" dia="" va="" augmentar="" significativament="" (p="">< 0,05)="" el="" pes="" corporal="" de="" les="" rates="" en="" el="" grup="" tractat="" amb="" che="" (100="" i="" 200="" mg/kg="" diari).="" les="" dades="" obtingudes="" dels="" animals="" van="" mostrar="" que="" hi="" havia="" diferències="" estadísticament="" significatives="" entre="" la="" dmo="" i="" la="" bmc="" del="" grup="" ovx="" i="" del="" control="" simulat="" (p="">< 0,="" 01).="" com="" era="" d'esperar,="" l'administració="" d'extracte="" de="" cistanches="" herba="" a="" una="" dosi="" de="" 200="" mg/kg="" va="" provocar="" un="" augment="" significatiu="" de="" la="" dmo="" i="" la="" bmc="" del="" grup="" tractat="" amb="" che="" (p=""><0,05; p=""><>

4. Discussió

L'osteoporosi és un dels trastorns més comuns associats amb la deficiència d'estrògens i l'envelliment. La menopausa provoca un augment de la renovació òssia, un desequilibri entre la formació òssia i la reabsorció òssia i la pèrdua òssia neta. La pèrdua òssia causada per la deficiència d'estrògens es deu principalment a un augment de la reabsorció òssia osteoclàstica tant en humans com en animals d'experimentació [24].

Tot i que l'osteoporosi afecta tant els homes com les dones grans, les dones postmenopàusiques han estat el focus principal de l'osteoporosi [25,26]. Una deficiència dramàtica d'hormones femenines és el factor més important per a l'osteoporosi de les dones postmenopàusiques. El model de rata OVX s'utilitza amb més freqüència en la investigació sobre l'osteoporosi postmenopàusica [27, 28], en què l'ovariectomia provoca un excés de reabsorció òssia respecte a la formació òssia inicialment i provoca pèrdua òssia. L'operació OVX provoca un augment significatiu del pes corporal que podria ser una guia per avaluar l'èxit de l'operació [29]. Al final del present estudi, els pesos corporals del grup OVX es van reduir notablement en comparació amb els del grup simulat, i el tractament amb extracte de Cistanches Herba va prevenir completament aquestes disminucions. Suposem que OVX va causar molèsties fisiològiques severes que van afectar la ingesta d'aliments de les rates. Posteriorment, el pes corporal del grup OVX es va reduir notablement.

La densitat mineral òssia s'ha descrit com una mesura substitutiva de la força òssia [30]; no obstant això, les propietats microarquitectòniques són un marcador recentment sorgit per a l'avaluació de l'impacte real del tractament en la qualitat de l'os trabecular. Tot i que la massa òssia baixa és un factor de risc important per a la fractura [31], la preservació de l'arquitectura òssia trabecular contribueix significativament a la força òssia i pot reduir el risc de fractura més enllà de la DMO i la BMC, tal com demostren diversos estudis que han informat de correlacions estretes entre la microestructura propietats i la força biomecànica dels ossos [32,33]. En aquest treball, es va trobar que la BMD i la BMC eren significativament diferents entre els grups simulats i ovariectomitzats. El tractament amb extracte de Cistanches Herba va millorar significativament la BMD i la BMC en rates OVX. A més, l'administració d'extractes de Cistanches Herba encara augmenta significativament depenent de la dosi la càrrega màxima, el desplaçament a la càrrega màxima, l'estrès a la càrrega màxima, la càrrega a la ruptura automàtica, el desplaçament a la ruptura automàtica i l'estrès als grups tractats amb CHE d'incorporació automàtica. en comparació amb el grup OVX. Aquests resultats van indicar que els ossos del fèmur de rates alimentades amb extracte de Cistanches Herba tenien una càrrega més alta en el fracàs i, per tant, podrien ser més resistents a les fractures per estrès. A més, les rates del grup OVX tenien nivells sanguinis de Ca, Zn i Cu més alts que les del grup simulat. L'administració d'extracte de Cistanches Herba va reduir els nivells sanguinis de Ca, Zn i Cu en rates OVX.

La idea que l'estat oxidatiu és important en l'osteoporosi és coherent amb la forta associació epidemiològica entre l'osteoporosi i l'aterosclerosi, una malaltia en la qual l'estrès oxidant té un paper important. A més, recentment s'ha observat que hi ha una associació en dones entre l'estrès oxidatiu (mesurat per un biomarcador d'estrès oxidatiu, 8-iso-PGF2-) [34], els nivells d'antioxidants [35] i densitat mineral òssia. Els estudis clínics que han examinat la relació entre l'ascorbat dietètic i/o suplementari i la massa òssia en humans també suggereixen una associació amb un augment de la massa òssia [36].

Com que l'MDA té una alta reactivitat cap als grups amino, inhibeix la síntesi d'àcids nucleics i proteïnes i també desactiva els enzims [37,38]. Així, la disminució dels enzims antioxidants del fèmur observada després de l'OVX pot ser deguda a l'augment de la peroxidació lipídica. Els enzims antioxidants estan implicats en el sistema de defensa contra el dany cel·lular o el teixit mediat pels radicals lliures. Metabolitzen els radicals lliures o els intermedis reactius de l'oxigen en productes no radicals. Aquests enzims inclouen una família d'enzims dependents del glutatió [39]. En aquest estudi, informem d'una disminució significativa dels nivells d'enzims antioxidants, és a dir. SOD, GSH-Px, CAT a la sang de rates ovariectomitzades. Aquestes troballes suggereixen que la deficiència d'hormones ovàriques es correlaciona amb la manca de combatre l'estrès oxidatiu. L'administració d'extractes de Cistanches Herba va millorar significativament les activitats de sang SOD, GSH-Px i CAT en rates OVX. Aquests resultats semblen indicar un millor efecte protector de l'extracte de Cistanches Herba contra l'estrès oxidatiu induït durant l'OVX.

En resum, l'extracte de Cistanches Herba és eficaç per prevenir la pèrdua òssia causada per la deficiència d'hormones ovàriques, tal com es veu des de la DMO del fèmur, els valors de BMC i els nivells sanguinis de Ca, Zn i Cu. Com que l'osteoporosi s'associa a l'estrès oxidatiu, estudis d'aquest tipus donen fe de la importància dels valors terapèutics dels antioxidants. Suposem que l'extracte de Cistanches Herba millora la qualitat òssia possiblement en part mitjançant la millora de les activitats dels enzims antioxidants de les rates OVX i la reducció dels elements minerals ossis.

Extracte d'herba de Cistanches: prevenció de la pèrdua òssia

Referències

1. Canalis, E.; Giustina, A.; Bilezikian, JP Mecanismes de teràpies anabòliques per a l'osteoporosi. N. Anglès. J. Med. 2007, 357, 905–916.

2. Heaney, RP; Recker, RR; Saville, PD Canvis de la menopausa en la remodelació òssia. J. Lab. Clin. Med. 1978, 92, 964–970.

3. McNamara, LM; Ederveen, AGH; Lió, CG; Preu, C.; Schaffer, MB; Weinans, H.; Prendergast, PJ Força del teixit trabecular ossi esponjós de rates normals, ovariectomitzades i tractades amb fàrmacs al llarg de l'envelliment. Bone 2006, 39, 392–400.

4. Compston, JE Teràpia de substitució hormonal. Clin. Reumatol. 1997, 11, 583–596.

5. Meiner, SE Una osteoporosi del paisatge en expansió: opcions de tractament avui. Adv. Nurse Pract.1999, 7, 26–31.

6. Aubin, JE; Bonnelye, E. Osteoprotegerin i el seu lligand: un nou paradigma per a la regulació de l'osteoclastogènesi i la reabsorció òssia. Osteoporos. Int. 2000, 11, 905–913.

7. Roodman, GD Avenços en biologia òssia: Els osteoclasts. Endocr. Rev. 1996, 17, 308–332.

8. Castanyer, CH, III. Teràpia farmacològica: calcitonina, bisfosfonats i esteroides anabòlics. En osteoporosi: etiologia, diagnòstic i gestió; Riggs, BL, Melton, LJ, III, Eds.; Lippincott-Raven: Filadèlfia, PA, EUA, 1995.

9. Quan, Q.-M.; Wu, W.; Li, Y.-X.; Cai, Q.-R. Variació en el contingut d'icariïna i flavonoides de les espècies de Barrenwort. J. Med. Plantes Res. 2010, 4, 1176–1181.

10. Du, XG; Pan, HZ; Zhang, CY; Zhang, HY; Liu, HM; Chen, ZY; L'extracte de Zeng, XY Zingiber officinale modula la immunosupressió induïda pels raigs G en ratolins. J. Med. Plantes Res. 2010, 4, 1647–1655.

11. Paschalis, EP; Betts, F.; DiCarlo, E.; Mendelsohn, R.; Boskey, AL FTIR anàlisi microespectroscòpica de biòpsies de cresta ilíaca humana de l'os osteoporòtic no tractat. Calcif. Teixit Int. 1997, 61, 487–492.

12. Motoie, H.; Kanoh, H.; Ogata, S.; Kawamuki, K.; Shikama, H.; Fujikura, T. Prevenció de la pèrdua òssia per bisfosfonat YM175 en gossos ovariectomitzats amb restricció de calci en la dieta. Jpn. J. Pharmacol. 1996, 71, 239–246.

13. Lin, LW; Hsieh, MT; Tsai, FH; Wang, WH; Wu, CR Activitat antinociceptiva i antiinflamatòria causada per Cistanche deserticola en rosegadors. J. Etnofarmacol. 2002, 83, 177–182.

14. Wu, XM; Gao, XM; Tsim, KW; Tu, PF Un arabinogalactan aïllat de les tiges de Cistanche deserticola indueix la proliferació de limfòcits cultivats. Int. J. Biol. Macromol. 2005, 37, 278–282.

15. Zeng, JC; Fan, YG; Liu, JR; Zeng YR; Yi, CZ; Liang Y. Estudi experimental de la diferenciació direccional de cèl·lules mare mesenquimals òssies (BMSC) a osteoblasts guiat per cistanche deserticola que conté sèrum. Zhongguo Gu Shang 2010, 23, 606–608.

16. Chen, Z.-W.; Zhu, B.-D.; Xu H.-Y. Estudi experimental de polisacàrids de cistanche que viuen al desert sobre hematogènesi regulada en ratolins amb anèmia deprimida de medul·la òssia. Barbeta. Arc. Tradit. Barbeta. Med. 2007, 25, 1473–1474.

17. Prakasam, G.; Sí, JK; Chen, M.-M.; Castro-Magana, M.; Liang, CT; Aloia, JF Efectes de l'hormona del creixement i la testosterona sobre la formació d'os cortical i la densitat òssia en rates ovariectomitzades envellides. Bone 1999, 24, 491–497.

18. McClung, JP; Stahl, CH; Marchitelli, LJ; Morales-Martínez, N.; Makin, KM; Jove, AJ; Scrimgeour, AG Efectes de la fitasa dietètica sobre l'augment de pes corporal, la composició corporal i la biomecànica òssia en rates en creixement alimentades amb una dieta baixa en zinc. J. Nutr. Bioquímica. 2006, 170, 190–196.

19. Rei, EJ; Armstrong, AR Un mètode convenient per determinar l'activitat de la fosfatasa biliar i sèrica. Llauna. Med. Assoc. J. 1934, 31, 376–381.

20. Jain, SK; McVie, R.; Duett, J.; Herbst, JJ Peroxidació lipídica de la membrana d'eritròcits i hemoglobina glicosilada a la diabetis. Diabetis 1989, 38, 1539–1543.

21. Llorenç, RA; Burk, RF Activitat de glutatió peroxidasa en fetge de rata amb deficiència de seleni. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 1976, 71, 952–958.

22. Sol, Y.; Oberley, LW; Ying, L. Un mètode senzill per a l'assaig clínic de la superòxid dismutasa. Clin. Chem. 1988, 34, 497–500.

23. Abei, H. Catalase in vitro. Mètodes Enzimol. 1988, 10, 121–126.

24. Mozaffari, Z.; Azarnia, M.; Abdolhamid Angaji, S. Avaluació dels efectes tòxics de l'extracte aquós de fulla de Trigonella foenum-graecum sobre el desenvolupament del teixit ossi llarg en el fetus de rata. J. Med. Plantes Res. 2010, 4, 1148–1155.

25. Buencamino, MCA; Sikon, AL; Jain, A.; Thacker, HL Un estudi observacional sobre l'adhesió a les directrius de tractament de l'osteopènia. J. Salut de la dona 2009, 18, 873–881.

26. Schmitt, MN; Schmitt, J.; Dören, M. El paper de l'activitat física en la prevenció de l'osteoporosi en dones postmenopàusiques: una actualització. Maturitas 2009, 63, 34–38.

27. Lelovas, PP; Xanthos, TT; Thomas, SE; Lletra, GP; Dontasi, IA La rata de laboratori com a model animal per a la investigació de l'osteoporosi. Comp. Med. 2008, 58, 424–430.

28. Ncango, DM; Pohl, CH; van Wyk, PWJ; Kock, JLF Els fàrmacs antiinflamatoris no esteroides (AINE) inhibeixen el creixement dels patògens del llevat. Afr. J. Microbiol. Res. 2011, 5, 1123–1125.

29. Fazliana, M.; Nazaimoon, WMW; Gu, HF; L'extracte d'Ostenson, CG Labisia pumila regula el pes corporal i les adipocines en rates ovariectomitzades. Maturitas 2009, 62, 91–97.

30. Bourrin, S.; Ammann, P.; Bonjour, JP; Rizzoli, R. Recuperació de la densitat mineral i la força òssia de la tíbia proximal, però no de l'arquitectura òssia esponjosa, després d'una teràpia a llarg termini amb bifosfonats o moduladors selectius del receptor d'estrògens en rates envellides. Bone 2002, 30, 195–200.

31. Borah, B.; Dufresne, TE; Chmielewski, PA; Brut, GJ; Prenger, MC; Phipps, RJ Risedronate conserva l'arquitectura trabecular i augmenta la força òssia a la vèrtebra dels miniporcs ovariectomitzats, mesurat per tomografia microcomputada tridimensional. J. Bone Miner. Res. 2002, 17, 1139–1147.

32. Müller, R.; Hannan, M.; Smith, SY; Bauss, F. L'ibandronat intermitent preserva la qualitat òssia i la força òssia a la columna lumbar després de 16 mesos de tractament en el mico cynomolgus ovariectomitzat. J. Bone Miner. Res. 2004, 19, 1787–1796.

33. Lane, NE; Kumer, JL; Majumdar, S.; Khan, M.; Lotz, J.; Stevens, RE; Klein, R.; Phelps, KV Els efectes dels estrògens conjugats sintètics, a (Cenestin) sobre l'estructura i la força de l'os trabecular en el model de rata ovariectomitzada. Osteoporosi Int. 2002, 13, 816–823.

34. Basu, S.; Michaelsson, K.; Olofsson, H.; Johansson, S.; Melhus, H. Associació entre l'estrès oxidatiu i la densitat mineral òssia. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 2001, 288, 275–279.

35. Maggio, D.; Barabani, M.; Pierandrei, M.; Cristina Polidori, M.; Catani, M.; Mecocci, P.; Senin, U.; Pacifici, R.; Cherubini, A. Disminució marcada dels antioxidants plasmàtics en dones d'edat osteoporòtica: resultats d'un estudi transversal. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88, 1523–1527.

36. Morton, DJ; Barrett-Connor, EL; Schneider, DL ús de suplements de vitamina C i densitat mineral òssia en dones postmenopàusiques. J. Bone Miner. Res. 2001, 16, 135–140.

37. Ocell, RP; Draper, HH Efecte del malonaldehid i l'acetaldehid en cèl·lules de mamífers cultivades: morfologia del creixement i síntesi de macromolècules. J. Entorn. Salut 1980, 6, 811–823.

38. Abdelhalim, MAK La influència potencial de l'estrès oxidatiu induït per la dieta amb colesterol alt sobre la composició i les propietats dels glòbuls vermells dels conills. Afr. J. Microbiol. Res. 2010, 4, 836–843.

39. Chaudiere, J.; Ferrari-Illiou, R. Antioxidants intracel·lulars de mecanismes químics a bioquímics. Química dels Aliments. Toxicol. 1999, 37, 949–962.