Avaluació del transport intestinal d'un extracte ric en glicòsids de feniletanoide de Cistanche Deserticola a través del model de monocapa de cèl·lules Caco-2

Introducció

La línia cel·lular Caco-2, que es va derivar d'adenocarcinomes de còlon humà, presenta característiques semblants als enteròcits. En condicions normals, les cèl·lules Caco-2 es diferencien espontàniament de les cèl·lules madures i formen monocapes intactes. Les cèl·lules adjacents s'adhereixen a través d'unions estretes formades al costat apical de la monocapa, que poden discriminar passivament lai va transportar activament fàrmacs a través de la capa epitelial. A causa de la similitud morfològica i bioquímica amb els enteròcits normals, les monocapes de cèl·lules Caco-2 serveixen com a model in vitro ben acceptat per a l'estudi del potencial d'absorció intestinal i les característiques de transport dels fàrmacs.

A diferència dels productes químics, els extractes de plantes (PE) són mescles l'activitat biològica i els components actius de les quals sovint no estan ben identificats. A més, les propietats de transport intestinal del PE, a diferència de les propietats dels seus components, estan estretament relacionades amb l'ús clínic. Les mesures de flux per a una mostra de prova a través d'una monocapa de cèl·lules Caco-2 solen incloure mètodes químics, com ara HPLC, LC/MS, etc. Tot i que aquests mètodes són eines potents, són complexos, requereixen molt de temps, són costosos i ocasionalment requereixen equips sofisticats. Més important encara, ni un component únic ni un component minoritari poden reflectir l'EP en el seu conjunt. Per tant, cal establir un nou enfocament independent de la determinació dels components per identificar i avaluar les característiques de transport de PE.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), una planta holoparàsita, és una medicina tradicional xinesa comuna que s'utilitza principalment per tractar la deficiència renal, la debilitat corporal i el restrenyiment, i aquests usos s'han registrat oficialment a la farmacopea xinesa.Glicòsids feniletanoides (PhGs), inclòs l'equinacòsid (EC), l'acteòsid (AC) i l'isoacteòsid (IS), etc., són una classe de compostos polifenòlics. Es consideren un dels principals constituents bioactius de les espècies de Cistanche. Els estudis farmacològics han demostrat que la bioactivitat dels PhG és diversa i inclou efectes antioxidants, antifatiga, hepatoprotectors, immunomoduladors, antiinflamatoris i neuroprotectors. Tanmateix, no s'han investigat les característiques del transport intestinal dels PhG. En aquest estudi, vam explorar la permeabilitat intestinal d'un extracte ric en PhG (PRE) de CD com a sistema integrat i la permeabilitat de tres PhG principals (AC, IS i EC) en cèl·lules Caco-2 diferenciades. Els nostres resultats van indicar que el PRE es transporta principalment mitjançant una difusió passiva mal absorbida per un gradient de concentració sense sortida, que proporciona la base farmacocinètica per a l'aplicació clínica de PhGs a la MC.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materials i mètodes

Materials

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>El 98%) es van comprar a Must Biotechnology Co. (Chengdu, Xina). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum fetal boví (FBS) i els aminoàcids no essencials (NEAA) van ser produïts per Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA). 6-Les plaques TranswellTM de pou (insereix l'àrea de creixement de la membrana 4,67 cm2) es van obtenir de Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, EUA). El col·lagen de cua de rata es va obtenir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Tots els reactius i productes químics per a l'anàlisi HPLC eren de grau analític.

Preparació de PRE a partir de CD

El material CD assecat a l'aire es va pols i es va extreure per percolació amb etanol al 70%. La fracció rica en PhG es va preparar tal com es va descriure anteriorment i es va extreure amb alcohol n-butílic saturat d'aigua. El licor d'extracte es va concentrar i es va assecar a pressió reduïda. L'espectrofotometria UV de resina macroporosa va mesurar un contingut de PhG del 78,4%. La mostra final va representar un rendiment de l'1,75% de matèria primera en pes sec. La mostra obtinguda es va emmagatzemar a -20 graus fins a un nou ús.

Determinació d'AC, IS i EC per HPLC

Es va utilitzar un sistema HPLC Shimadzu equipat amb programari de solució LC per assajar el contingut d'AC, IS i EC a PRE. Es va utilitzar una columna Intersil C18 de fase inversa (4, 6 mm × 25 0 mm, 5 μm) i es va mantenir a temperatura ambient. Les fases mòbils eren acetonitril i aigua que contenia 0, 1% d'àcid fosfòric (v/v) amb elució en gradient (taula 1) a un cabal d'1, 0 ml/min. El detector de l'espectrofotòmetre UV es va establir a 334 nm. Per determinar amb precisió el flux d'AC i IS, hem desenvolupat un nou mètode de detecció de fluorescència HPLC (HPLC-FLD). Després d'una anàlisi estructural i una exploració de longitud d'ona de fluorescència (dades no mostrades), vam obtenir les condicions òptimes de detecció de fluorescència per a AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) i IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm).

El mètode analític HPLC es va validar utilitzant les següents característiques de rendiment: estabilitat, linealitat, sensibilitat, precisió (variabilitat intra i interdia) i precisió. Els analits del tampó de transport es van emmagatzemar a 25 graus a la foscor durant 24 hores i es va mesurar la seva estabilitat. Els analits eren altament estables en presència de vitamina C (0,4%) perquè els valors de desviació estàndard relativa (RSD) a les zones màximes eren <3,5%. L'equació de regressió lineal, el coeficient de correlació, el rang de linealitat, el LOD i el LOQ per a AC, IS i EC es mostren a la taula 2. Els LOD (18–30 nM) i LOQ (60–100 nM) Els valors il·lustren que els mètodes HPLC-FLD i HPLC-UV són altament sensibles. Els valors de RSD que expressen la precisió del mètode eren tots < 2% per a la variabilitat intra i interdia, cosa que indica una bona precisió. Per a l'avaluació de la recuperació, es van afegir AC, IS i EC al tampó de transport per obtenir tres nivells de concentració (alt, mitjà i baix). Els valors de recuperació del mètode per als analits es resumeixen a la taula 3. Les recuperacions mitjanes van oscil·lar entre el 90,0% i el 96,4%, cosa que indica una bona precisió. En conclusió, els mètodes d'HPLC establerts són satisfactoris pel que fa a la linealitat, la sensibilitat, la precisió i la precisió per a la quantificació d'AC, IS i EC al tampó de transport.

Determinació de PRE per sistema d'assaig biològic

El bioassaig (capacitat antioxidant total) es va basar en l'assaig FRAP (ferric reductor/antioxidant power) que hem descrit anteriorment [16] i validat en termes de linealitat i precisió (variabilitat intra i interdia). La linealitat del mètode de bioassaig es va determinar a partir de les corbes de calibratge. L'interval de concentració de linealitat era 0.0625 - 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). La precisió del mètode de bioassaig establert es va determinar en termes de variabilitat intra i interdia per a una anàlisi de PRE (10,0 ug/ml). La repetibilitat intradia del mètode es va determinar a partir de cinc determinacions consecutives el mateix dia. La repetibilitat entre dies es va mesurar a partir de cinc determinacions consecutives en tres dies diferents. Els valors de RSD per a la precisió del mètode van ser de l'1,014% i del 4,72% per a la variabilitat intra i interdia, respectivament, cosa que indica una bona precisió. Així, el mètode de bioassaig establert és satisfactori pel que fa a la linealitat, la precisió i la precisió per a la quantificació de PRE en un tampó de transport.

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules de caco{{0}} es van cultivar a 37 graus i 95% d'humitat relativa en una atmosfera que contenia un 5% de CO2 i un medi format per DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamina, penicil·lina. (100 U/ml) i estreptomicina (100 ug/ml). El medi es va canviar cada dos dies durant el creixement i la diferenciació cel·lular. Les cèl·lules es van cultivar en matràs de plàstic de 75-cm2 i es van collir cada 3-5 dies amb EDTA-tripsina al 0,05%. Per als experiments de transport, les cèl·lules es van sembrar a una densitat d'1 × 105 cèl·lules/cm2 sobre insercions Transwell recobertes de col·lagen. Aproximadament 21 dies després de la sembra, les monocapes es van utilitzar per als experiments de transport. La seva integritat es va determinar mesurant la resistència elèctrica transepitelial (TEER) a través de les monocapes amb un EVOM equipat amb ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., EUA). Els valors TEER de la monocapa de cèl·lules Caco-2 havien de superar els 500 O∙cm2.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A PHGS LAXANT I LAXATIU75% ECH 30% ACT 12%

Experiments de transport

La monocapa es va rentar amb tampó de transport (tampó P que conté 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvat de sodi, 10 mM de glucosa, 3 mM de CaCl2 i 145 mM de NaCl, pH 7,4) i es va preincubar durant 20 min. a 37 graus. Després d'eliminar el tampó de transport, es va afegir un tampó de transport fresc que contenia mostres de prova a la cambra apical (AP) (1, 5 ml) en estudis direccionals AP a basolaterals (BL) o la cambra BL (2, 5 ml) en estudis direccionals BL a AP. Per als assajos AC, IS i EC mitjançant HPLC, es va treure una alíquota (300 ul) de cada cambra receptora a diferents intervals de temps (30, 60, 90 i 120 min). La cambra receptora es va reposar amb el mateix volum de tampó de transport fresc preescalfat (37 graus) després de cada mostreig. Les mostres recollides es van emmagatzemar a -20 graus per a un ús posterior. Per a la determinació de PRE mitjançant bioassaig, només es van prendre les mostres als 120 min. A causa de la inestabilitat de PRE, AC, IS i EC, es va afegir un 0,4% (p/v) de vitamina C per estabilitzar les mostres per determinar els continguts de AC, IS i EC per HPLC, i les mostres per al bioassaig PRE van ser analitzat immediatament després de la mostra. Es va calcular el valor del coeficient de permeabilitat aparent (Papp o 'Papp) de cada mostra.

Anàlisi de dades

Els valors de Papp a les direccions AP BL o BLAP d'AC, IS i EC es van calcular a partir de l'equació següent: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), on Papp és el coeficient de permeabilitat aparent (cm/s) determinat per HPLC. (4Q/4t) és la velocitat d'aparició del compost de prova (AC, IS o EC) al costat del receptor (μmol/s); A és la superfície de la inserció (cm2); C0 és la concentració inicial del compost de prova al costat del donant (μmol/ml). Concretament, es va utilitzar la unitat de massa "ug" en lloc de "μmol" quan es van calcular els valors de 'Papp. Les dades s'expressen com a mitjanes ± SD.

Resultats

Composició de AC, IS i EC en PRE a partir de CD

Perquè AC, IS i EC es consideren els principals bioactiusPhGs de les espècies de Cistanche, vam analitzar el seu contingut en PRE mitjançant HPLC-UV. El cromatograma representatiu es mostra a la figura 1. La identificació d'aquests components es va basar en comparar els temps de retenció i l'espectre UV amb els d'estàndards autèntics a una longitud d'ona de 334 nm. Els continguts d'AC, IS i EC a PRE van ser del 26,60%, 1,84% i 32,83%, respectivament. Així, aquests tres compostos representen el 61,27% del PRE; a més, els resultats anteriors indiquen que el contingut de PhG en PRE és del 78,4%. Per tant, AC, IS i EC representen aproximadament el 80% dels PhG a PRE.

Capacitats antioxidants totals de PRE, AC, IS i EC

Estudis de laactivitat antioxidant dels PhGs'han informat de CD, i AC, IS i EC representen aproximadament el 80% dels PhG a PRE. Així, es van analitzar i expressar les capacitats antioxidants totals de PRE, AC, IS i EC mitjançant els valors FRAP (× 10–6 mmol). Com es mostra a la figura 2, quan el valor de FRAP era de 8 × 10–6 mmol, les concentracions finals de PRE, AC, IS i EC eren de 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml i 4,89 ug. /ml, respectivament, indicant que la capacitat antioxidant total d'aquestes quatre mostres es classifica de la següent manera: AC > EC > PRE > IS. La bioactivitat de PRE s'atribueix als seus grups d'ingredients actius (AIG). Durant aproximadament el 60% de PRE, AC i EC van mostrar una activitat antioxidant total més forta que PRE i IS. Com que IS (1,84%) constitueix una fracció molt petita de PRE, altres components, com l'IS feblement antioxidant, també són clarament actius en PRE. Sorprenentment, l'activitat antioxidant total va variar gairebé 7- vegades entre AC i el seu isòmer IS, cosa que indica que no només el nombre de grups hidroxil fenòlics, sinó també la posició dels grups hidroxil fenòlics a la molècula afectava l'efecte antioxidant. .

Validació de les monocapes Caco-2

Per validar el sistema de monocapa de cèl·lules Caco-2, els valors Papp del propranolol (un marcador ben transportat) i el groc Llucifer (un marcador mal transportat) de l'AP al BL a través de les monocapa de Caco-2 es van determinats com a 1,51 × 10–5 cm/s i 2,8 × 10–7 cm/s, respectivament, i aquests valors coincidien amb els publicats en informes anteriors. L'assaig d'activitat de la fosfatasa alcalina també va confirmar que les monocapes de cèl·lules Caco-2 eren qualitativament comparables a l'epiteli de l'intestí prim.

La permeabilitat de AC, IS i EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), mentre que els dels fàrmacs poc absorbits eren baixos (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

La permeabilitat del PRE

Els resultats anteriors indiquen que la capacitat antioxidant total de PRE es deu almenys al 61,27% d'AIG de PRE. Així, vam avaluar el TR de PRE en funció de la seva corba concentració-efecte de la capacitat antioxidant total i vam calcular els valors de Papp per reflectir les característiques de transport de PRE. Els valors de Papp de PRE per a AP!BL i BL!AP eren (2,16 ± 0,26) × 1{0–7 cm/s i (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectivament, indicant que aquest compost era poc permeable. A més, l'eflux o el transport actiu no era evident perquè la proporció de 'Papp BL a AP / 'Papp AP a BL per PRE era d'1,45. A més, el TR bidireccional de PRE va augmentar linealment entre aproximadament 300 i 900 ug/ml (Fig. 5). La manca de preferència direccional dels resultats suggereix que la difusió passiva és el principal mecanisme de transport de PRE.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA IMMUNITAT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Discussió

En comparació amb productes farmacèutics altament purificats, el PE és generalment mescles que consisteixen en centenars de components amb propietats fisioquímiques molt diferents. Per tant, PE exerceix una acció sinèrgica sistemàtica, multiobjectiu i multicanal a causa del seu complex AIG [21], que dificulta l'anàlisi de les característiques de transport de PE. Per avaluar les propietats de transport de PE de manera més científica, alguns investigadors han identificat diversos components, en lloc d'un únic component, a PE [22-24]. No obstant això, un nombre limitat de components no pot reflectir el PE en el seu conjunt. Tanmateix, determinar tots els components de PE és impossible. A més, si diversos components de PE mostren característiques de transport completament diferents, les característiques de transport holístiques de PE seran difícils d'identificar.

A la dècada de 1990, es van utilitzar sistemes de bioassaig per avaluar el TR dels agents antimicrobians [25]. El 2005, Eguchi i els seus col·legues [26] havien avaluat l'activitat antioxidant de l'extracte de pastanaga utilitzant medis BL de cèl·lules Caco-2 diferenciades; aquest enfocament és més adequat per reflectir situacions in vivo.

A partir d'un informe anterior sobre l'activitat dels PhG i els nostres resultats (Fig. 2), es pot avaluar el TR d'AIG en PRE determinant la capacitat antioxidant total del medi a la cambra receptora. Després dels experiments de transport, vam trobar que el TR de PRE era similar en ambdues direccions, i aquest transport estava insaturat i mal absorbit ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), i no ho va fer. indiquen eflux, cosa que suggereix que la difusió passiva per un gradient de concentració és el principal mecanisme de transport de PRE (Fig. 5). A més, les característiques de transport de PRE són coherents amb les d'AC, IS i EC, els components efectius que mostren activitat antioxidant a PRE (Fig. 4 i Taula 4). Aquest resultat s'esperava i va indicar que el sistema de bioassaig actual és adequat i fiable per a l'avaluació de les característiques de transport d'AIG en PRE en cèl·lules Caco-2 diferenciades.

En contrast amb el valor Papp canònic, que s'utilitza habitualment per reflectir el transport d'un sol compost, el valor Papp obtingut a partir del TR basat en la corba d'efecte concentració pot reflectir no només els components que penetren les monocapes amb una estructura intacta, sinó que també impliquen altres factors relacionats amb l'activitat objectiu, com els metabòlits dels components, els productes degradats químicament i fins i tot algunes citocines secretades per les cèl·lules Caco-2 en resposta a l'estimulació que pot afectar la bioactivitat objectiu. Així, el multifactor esmentat anteriorment, més que només els components intactes transportats, determina el "valor Papp". Per tant, "Papp pot correlacionar més fortament amb situacions in vivo que el valor canònic de Papp". En aquest estudi, vam aclarir la naturalesa difusa passiva i poc absorbida de PRE en funció del seu valor Papp, i aquesta naturalesa pot estar relacionada amb la dosi alta i el llarg període de tractament clínic de la MC. No obstant això, aquestes troballes proporcionaran una guia més sistemàtica per als metges en l'aplicació de la CD quan només s'han identificat les característiques de transport de la majoria d'AIG en CD, no només els PhG.

No obstant això, l'element de bioactivitat seleccionat ha de ser prou sensible per ser detectat al medi de la cambra receptora, la qual cosa suposa un repte per a l'establiment d'un sistema de bioassaig per avaluar les característiques de transport del PE. A més, la bioactivitat també hauria de dependre de tants components com sigui possible. En el nostre estudi, l'assaig de capacitat antioxidant total era més adequat que diversos altres mètodes (S1 Fig.). Però tot i així, el nostre assaig només pot detectar el TR de PRE als 120 min.

Col·lectivament, el present estudi va establir un nou sistema de bioassaig per avaluar la permeabilitat intestinal del PRE en cèl·lules Caco-2 diferenciades. Els resultats obtinguts van mostrar que una difusió passiva mal absorbida per un gradient de concentració sense efluència és el principal mecanisme de transport de PRE (Fig. 5), que proporciona la base farmacocinètica per a l'aplicació clínica de PhG en la MC. És factible l'ús d'un nou sistema de bioassaig per avaluar el TR i, per tant, calcular els valors de Papp per avaluar la propietat del transport intestinal d'AIG en PE. Aquest enfocament també pot ser adequat per a altres PE donada la bioactivitat adequada.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%