Ferstatina II inhibeix eficaçment la replicació del SARS-CoV-2 a les cèl·lules Vero

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resum

Síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continua tenint un impacte significatiu en la salut pública mundial. S'han descrit diversos mecanismes per a l'entrada de cèl·lules SARS-CoV-2; tanmateix, el paper del receptor de transferrina 1 (TfR1) en la infecció per SARS-CoV-2 ha rebut poca atenció. Hem utilitzat ferritina II per induir la degradació de TfR1 a la superfície de les cèl·lules Vero i per estudiar les conseqüències d'aquest tractament sobre la viabilitat de les cèl·lules i la replicació del SARS-CoV-2. Hem demostrat que la ferritina II no és tòxica per a les cèl·lules Vero en concentracions de fins a 400 µM. Segons les dades de microscòpia confocal, la distribució de la transferrina marcada i el domini d'unió al receptor (RBD) de la proteïna Spike es veu afectada significativament pel pretractament de 18 hores amb ferritina II 100 µM en un medi de cultiu. La captació de proteïna RBD està gairebé totalment inhibida pel tractament amb ferritina II, tot i que aquesta proteïna roman unida a la superfície cel·lular. Les troballes es van confirmar bé per la inhibició significativa de la infecció SARS-CoV-2 de les cèl·lules Vero per ferritina II amb valors IC50 de 27 µM (per al virus Wuhan D614G) i 40 µM (per al virus Delta). Es va observar una reducció significativa del títol infecciós de la variant Omicron SARS-CoV-2 a una concentració de ferritina II tan baixa com 6,25 µM. Presentem la hipòtesi que la ferritina II bloqueja l'entrada de la cèl·lula hoste del SARS-CoV-2 mediada per TfR1-; tanmateix, calen estudis addicionals per dilucidar els mecanismes complets d'aquesta inhibició del virus, inclòs l'efecte de la ferritina II sobre altres receptors SARS-CoV-2, com ara ACE2, Neuropilin-1 i CD147. La inhibició de l'entrada viral dirigint-se al receptor de les cèl·lules hoste, en lloc de la proteïna propensa a la mutació viral, és una estratègia terapèutica prometedora de COVID-19.

Paraules clau: SARS-CoV-2;receptor de transferrina 1; ferritina II; domini d'unió al receptor (RBD); Cèl·lules Vero

Alexey Sokolov , Irina Isakova-Sivak *, Natalia Grudinina , Daria Mezhenskaya , Elena Litasova , Valeria Kostevich, Ekaterina Stepanova , Alexandra Rak , Ivan Sychev, Olga Kirik and Larisa Rudenko

Institut de Medicina Experimental, 197376 Sant Petersburg, Rússia

1. Introducció

La pandèmia de la malaltia del coronavirus 2019 (COVID-19) causada pel coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la síndrome respiratòria aguda severa continua suposant una càrrega socioeconòmica important per a la població mundial. L'enzim convertidor d'angiotensina 2 (ACE2) es considera el principal receptor de cèl·lules hoste que el SARS-CoV-2 utilitza per entrar a les cèl·lules [1–4]; tanmateix, s'han identificat diversos receptors i co-receptors alternatius capaços de facilitar l'entrada i la infecciositat de les cèl·lules SARS-CoV-2, com la neuropilina-1, el CD147, el receptor de la tirosina-proteïna quinasa OVNI (AXL) i altres. [5–10]. A més, es requereixen dos passos d'escissió proteolítica per a l'entrada eficaç del SARS-CoV-2 a les cèl·lules després de la implicació d'un receptor de cèl·lules hoste per una proteïna d'espiga viral (S). El primer pas implica la divisió del límit S1-S2 per la proteasa de furin dins d'una cèl·lula infectada, mentre que la divisió del lloc S20 depèn de les proteases de la cèl·lula diana, com ara TMPRSS2 i la catepsina L, que activen les proteïnes S a la membrana plasmàtica i en el endolisosoma, respectivament (revisat a [11]).

cistanche en vendaper alcapacitat immune

A part dels objectius d'entrada de cèl·lules hoste SARS-CoV-2 ben estudiats, hi ha proves que el receptor de transferrina 1 (TfR1) pot ser un co-receptor alternatiu per a l'entrada de SARS-CoV-2 [12]. TfR1, una glicoproteïna de membrana de tipus II homodimèrica de 95 kDa, s'expressa abundantment a la membrana plasmàtica de la majoria de cèl·lules humanes i media l'entrada de transferrina (Tf) a les cèl·lules per al lliurament de ferro [13]. De fet, hi ha una àmplia gamma de virus humans i zoonòtics que poden envair les cèl·lules hostes mitjançant la interacció amb TfR1 i altres factors en la via d'absorció del ferro, inclosos els arenavirus del Nou Món, el virus de la immunodeficiència humana, els parvovirus, el virus de l'hepatitis C, els alfavirus i altres. [14]. Per tant, dirigir-se a la via d'entrada viral mediada per TfR1- representa una estratègia terapèutica prometedora per a la infecció per SARS-CoV-2. Els primers estudis de cribratge van identificar dos compostos de mida petita (NCI11079 i NCI306711) que tenien un efecte inhibidor significatiu sobre la captació de ferro mediada per Tf per les cèl·lules HeLa. El compost NCI306711 té com a objectiu TfR1 induint la seva internalització i degradació i es va anomenar "ferritina" a causa de la seva propietat inusual d'inhibir el transport de ferro a través de la via dependent del colesterol [15]. Una altra molècula petita, la ferritina II (NSC8679), actua d'una manera similar a la ferritina i degrada TfR1 a través d'una via de bassa lipídica sensible a la nistatina [16]. A la llum d'aquestes dades, vam intentar avaluar la capacitat de la ferritina II per inhibir la replicació del SARS-CoV-2 a les cèl·lules Vero-CCL81 i explorar els mecanismes potencials d'aquesta inhibició.

2. Materials i Mètodes

2.1. Virus, proteïnes i compostos químics

El SARS-CoV-2 aïlla hCoV-19/St_Petersburg-3524S/2020 (linatge Wuhan D614G), hCoV-19 /Russia/SPE-RII-32759V/2021 (llinatge Delta) i hCoV{-19/Russia/SPE RII-6086V/2021 (llinatge Omicron) es van obtenir de l'Institut de Recerca Smorodintsev de Grip (Sant Petersburg, Rússia). Tot el treball amb virus infecciosos es va realitzar al laboratori de nivell de bioseguretat 3 (BSL-3). BIOCAD JSC (St.Petersburg, Rússia) va expressar una proteïna recombinant corresponent al domini d'unió al receptor (RBD) de la proteïna SARS-CoV-2 S en cèl·lules eucariotes. El sèrum humà saturat de ferro TF (Fe2-TF) es va aïllar del sèrum de sang humana mitjançant cromatografia d'intercanvi iònic amb DEAE-Toyopearl, UNOsphere S i filtració en gel a Sephadex G-75 Superfine, tal com es va descriure anteriorment. [17]. La ferrostatina II (figura 1) es va comprar a Sigma (C-1144, St. Louis, MO, EUA). El compost es va diluir en NaCl 150 mM, tampó Na-fosfat 10 mM, pH 7,4 (PBS) fins a la concentració final de 4 mm, i la solució es va filtrar a través d'una membrana estèril amb una mida de porus de 0,22 µm (Sartorius, Alemanya) .

2.2. Propagació del virus SARS-CoV-2 i avaluació de la capacitat d'inhibició del virus de la ferrostatina II

Els virus es van propagar a cèl·lules Vero CCL81 mitjançant DMEM complementat amb 1 × antibiòtic-antimicòtic, 10 mM HEPES i 2 per cent de FBS (tots de Capricorn, Ebsdorfergrund, Alemanya), (DMEM / 2 per cent de FBS). Els títols infecciosos es van determinar mitjançant un assaig de dosi d'infecció de cultiu de teixits del 50 per cent (TCID50), tal com es descriu a [18] i expressat en lgTCID50/mL.

Per a l'avaluació de la capacitat de neutralització del virus de la ferritina, hem utilitzat un assaig de microneutralització modificat. El dia abans dels experiments, les cèl·lules Vero es van sembrar en plaques de cultiu de {{{0}}pous (3 × 104 cèl·lules per pou) en DMEM complementat amb 1 × antibiòtic-antimicòtic i un 10 per cent de FBS. L'endemà, es va eliminar el medi i les cèl·lules es van infectar amb 100 TCID50 de SARS-CoV-2 preparats amb DMEM/2 per cent de FBS durant 2 h a 37 ◦ C, 5 per cent de CO2. Diversos pous es van mantenir sense infectar com a control negatiu. A continuació, es va eliminar l'inòcul i les cèl·lules es van cobrir amb 150 µL de dilucions de ferritina II de dues vegades preparades amb DMEM/2 per cent de FBS, mentre que els pous de control negatiu i positiu només es van cobrir amb medis. Cada dilució de ferritina II es va avaluar per triplicat. Les plaques es van incubar durant 48 h (per al virus Wuhan G614D) o 72 h (per als virus Delta i Omicron) a 37 ◦ C, 5 per cent de CO2, fins que es va observar un efecte citopàtic clar als pous de control positiu. Els sobrenedants es van recollir acuradament en tubs de 0, 2 ml per a la quantificació del títol viral i les cèl·lules es van fixar amb un 10 per cent de formaldehid a 4 ◦ C durant 24 h.

Les plaques fixes es van transferir al laboratori BSL{{0}} per a un procediment ELISA basat en cèl·lules. Això incloïa rentat amb PBST (PBS amb 0,05 per cent de Tween 20), permeabilització cel·lular amb un 0,1 per cent de Triton X-100 a temperatura ambient durant 15 min, bloqueig amb un 3 per cent de llet desnatada a 37 ◦C. durant 1 h, i rentat intensiu amb PBST. A continuació, es va afegir un anticòs anti-RBD de conill policlonal purificat (BIOCAD JSC, Sant Petersburg, Rússia) a una concentració d'1,5 µg/mL durant 1 h, seguit de rentat amb PBST i l'addició de secundària anti-conill anti-IgG HRP- anticossos conjugats (BioRad, Hercules, CA, EUA) durant 1 h a 37 ◦C. Les plaques es van desenvolupar mitjançant una solució de substrat 1-Step Ultra TMB-ELISA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). La reacció es va aturar amb una solució 1M H2SO4 i els resultats es van llegir a 450 nm mitjançant l'espectrofotòmetre xMark Microplate (BioRad, Hercules, CA, EUA). Per calcular el títol IC50, es va utilitzar una anàlisi de regressió no lineal de quatre paramètrics, basada en els valors OD450 de cèl·lules negatives i positives per virus, tal com es descriu a [18].

on comprar cistanche

Els títols de SARS-CoV-2 als sobrenedants cel·lulars es van calcular mitjançant RT-PCR quantitativa en temps real. L'ARN es va purificar a partir de 100 µL de medi de cultiu cel·lular, així com de SARS-CoV-2 amb títols coneguts per a la generació de les corbes estàndard d'assaig. Les mostres d'ARN es van purificar amb un kit d'extracció d'ARN (Biolabmix, Novosibirsk, Rússia) segons el protocol del fabricant. La reacció RT-PCR es va realitzar per duplicats amb un imprimador de reenviament 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30 i un cebador invers 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19] utilitzant un One-Tube RT-PCR SYBR kit (Evrogen, Moscou, Rússia) al sistema de PCR en temps real Quantstudio 1 (Thermofifisher Scientific, Waltham, MA, EUA), amb l'addició de 50x Rox com a colorant de referència.

El cicle de llindar (Ct) es va calcular per a cada mostra amb el programari de disseny i anàlisi QuantStudio v1.5.1 i es va generar la corba estàndard a cada placa de reacció. El títol del virus a cada pou es va calcular mitjançant valors Ct normalitzats a corbes estàndard calculades a partir de la valoració estàndard del virus i expressats en lgTCID50/mL. Per determinar si la ferritina II pot inhibir els passos inicials d'unió viral a les cèl·lules, es van barrejar 100 TCID50 de SARS-CoV-2 amb dilucions de ferritina II i, després d'1 h d'incubació a 37 ◦ C, aquesta barreja es va afegir a Vero. cèl·lules, seguida d'una incubació addicional d'1 h a 37 ◦C. Després de l'absorció viral, es va eliminar l'inòcul i es van cobrir les cèl·lules amb 150 µL de medi fresc DMEM/2 per cent de FBS. Després de 48 h d'incubació a 37 ◦ C, 5 per cent de CO2 i CPE visible a les cèl·lules de control positiu, les plaques es van fixar i es van sotmetre a ELISA basat en cèl·lules tal com es descriu anteriorment.

2.3. Avaluació de l'efecte citotòxic de la ferrostatina II

La citotoxicitat de la ferritina II per a les cèl·lules Vero es va avaluar mitjançant el bromur de {{0}}(4,5-dimetiltiazol- 2-il){-2,5-difeniltetrazoli ( MTT) assaig de reducció [20]. Es van preparar dilucions dobles de ferritina II en medi DMEM/2% FBS a partir d'una concentració de 400 µM i es van afegir als pous de les plaques de 96-pous amb monocapes de cèl·lules Vero. Després de 48 h d'incubació, es van eliminar els medis i es van rentar les cèl·lules suaument amb PBS calent. El reactiu MTT de 0, 5 mg/ml es va afegir a cada pou en un volum de 100 µl i la placa es va incubar més a 37 ◦ C durant 2 h. A continuació, es va eliminar el reactiu i es van rentar les cèl·lules amb PBS i es van assecar a l'aire, seguit de l'addició de 100 µL d'etanol al 96 per cent per dissoldre els cristalls de formazan. La intensitat del color es va registrar amb un espectrofotòmetre a una longitud d'ona de 535 nm. Com a controls negatius es van utilitzar pous de la placa no sembrats amb cèl·lules Vero. La inhibició del 50 per cent de la viabilitat cel·lular (CC50) es va calcular mitjançant una anàlisi de regressió no lineal de quatre paramètrics mitjançant el programari GraphPad Prizm.

2.4. Etiquetatge de la transferrina sèrica humana i la proteïna RBD recombinant

La reacció d'etiquetatge es va dur a terme a més 4 ◦C durant 12 h afegint una solució 5 mM d'èster NHS 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) en dimetilsulfòxid a solucions de Fe2-TF o RBD 30 µM en 200 mM de NaHCO3, mantenint la proporció 5-TAMRA: proteïna=8:1 (mol/mol). Després de l'eliminació de l'excés de colorant, el grau d'etiquetatge es va estimar mitjançant la proporció d'A541 i A280, que era de 3,5 i 3,2 mol TAMRA per mol Fe2-TF i RBD, respectivament

2.5.Estudi de l'efecte de la ferrostatina II de l'absorció de TF i RBD per les cèl·lules Vero

Les cèl·lules Vero es van cultivar durant 18 h en DMEM/2 per cent de FBS sense ferritina Il i amb l'addició d'100 uM de ferritina Il amb cobertors per a la microscòpia col·locats prèviament a la part inferior de les plaques de cultiu. A continuació, es va substituir el medi durant 15 h per un medi sense FBS que contenia 1,2 μM de Fe2-TF-TAMRA (0,25 mg/mL) o 1,2 μM de RBD-TAMRA (0,1 mg/mL). Després de la incubació, les cèl·lules es van rentar suaument dues vegades amb PBS, es van fixar amb un 4% de paraformaldehid (w/) en PBS durant 10 minuts, es van rentar dues vegades amb PBS durant 30 minuts. A continuació, es van tacar els nuclis de les cèl·lules amb DAPI 360 nM durant 5 minuts, es van rentar amb PBS i cobertors i es van muntar a les diapositives mitjançant una resina polimeritzant per a microscòpia de fluorescència (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Les imatges es van adquirir mitjançant un microscopi d'exploració làser confocal Axio Observer.Z1/7 (Carl Zeiss, Jena, Alemanya), amb un objectiu Plan-Apochromat 63×/1,40 Oil DIC M27. Es va utilitzar làser A561 nm per excitar la fluorescència TAMRA, un { Es va utilitzar un filtre {28}} nm per registrar la fluorescència, es va utilitzar un làser de 405 nm per excitar DAPI. i es va utilitzar un filtre de 400-570 nm per registrar la fluorescència. Les imatges es van adquirir i processar mitjançant el programari subministrat amb el microscopi.

3. Resultats

Hem utilitzat dues soques de SARS-CoV-2 distants antigènicament per avaluar la capacitat de la ferritina II per inhibir la replicació viral a les cèl·lules Vero. En la primera etapa, vam avaluar la inhibició viral en presència constant del compost al medi de cultiu. La detecció d'antigen viral en ELISA basat en cèl·lules va trobar que els valors IC50 de ferritina II eren de 26,5 i 40,4 µM per als virus Wuhan D614G i Delta, respectivament (figura 2A). La quantificació dels títols de virus en medis de cultiu va confirmar que l'alliberament del virus de les cèl·lules infectades al medi de cultiu va ser inhibit per ferritina II, a partir d'una concentració de 25 µM, i els valors d'IC50 calculats a partir de la reducció dels títols de TCID50 van ser de 24,0 i 25,2. µM per als virus Wuhan D614G i Delta, respectivament. A més, quan el compost es va afegir a una concentració de 100 µM, no es va produir cap replicació viral a les cèl·lules Vero (figura 2B).

cistanche i tongkat ali

A causa de les diferències significatives en les proteïnes RBD de les variants Wuhan D614G i Omicron SARS-CoV-2, aquesta última no es va poder detectar en ELISA basat en cèl·lules mitjançant l'anticòs anti-RBD disponible, ja que es va elevar a el RBD de la soca original de SARS-CoV-2. No obstant això, la reducció dels títols virals infecciosos en presència de ferritina II va ser encara més pronunciada en la variant Omicron en comparació amb les altres dues soques SARS-CoV-2: es va observar una disminució deu vegades del títol viral en una ferritina II. concentració tan baixa com 6,25 µM, sense que es produeixi cap replicació del virus a concentracions de 50 µM o superiors (figura 3). És important tenir en compte que aquesta inhibició del SARS-CoV-2 només es va produir quan la ferritina II estava constantment present al medi de cultiu, mentre que aquest efecte no es va observar quan les cèl·lules van ser pretractades amb el compost o quan un virus/ferritina. La barreja II es va utilitzar a l'etapa d'adsorció seguida de la incubació sense la substància (dades no mostrades).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 per a les soques Wuhan D614G, Delta i Omicron SARS-CoV-2, respectivament.

Per explorar els possibles mecanismes d'inhibició del SARS-CoV-2 per ferritina II, vam estudiar l'efecte de la substància sobre l'entrada viral mitjançant un assaig de captació de RBD substitut. Així, vam determinar com la concentració no tòxica de 100 µM de ferritina II pot afectar l'absorció de RBD marcat amb tetrametilrodamina (TAMRA) per les cèl·lules Vero. Se sap que TfR1, un objectiu per a l'acció de la ferritina II, media l'entrada de Tf; per tant, el TF marcat amb TAMRA es va utilitzar com a control positiu. El cultiu de cèl·lules Vero en presència de 100 µM de ferritina II durant 18 h sense afegir proteïnes marcades no va tenir cap efecte significatiu en la morfologia dels nuclis cel·lulars (figura 5, panell superior (Mock)), indicant indirectament l'absència de necrosi cel·lular i apoptosi. La incubació de cèl·lules amb TF-TAMRA sense tractament amb ferritina II va donar lloc a acumulacions de proteïnes marcades dins de les cèl·lules, sense afectar la regió nuclear tacada amb DAPI (una tríada d'imatges del mig esquerra (TF-TAMRA) a la figura 5). El tractament de cèl·lules amb ferritina II 100 µM va donar lloc a una reducció significativa de la inclusió de TF etiquetat (una tríada d'imatges del mig dret (TF-TAMRA) a la figura 5). La incubació de cèl·lules amb RBD-TAMRA sense tractament amb ferritina II, com en el cas del TF marcat, va donar lloc a l'acumulació de proteïnes marcades al citoplasma cel·lular, sense afectar la regió nuclear (tríada inferior esquerra (RBD-TAMRA) a la figura 5). ). Quan es van tractar les cèl·lules amb ferritina II 100 µM, es va produir una redistribució del senyal TAMRA. En lloc d'incorporar el RBD etiquetat a les cèl·lules, el senyal de TAMRA es va distribuir uniformement per la superfície cel·lular, amb només una petita part de l'etiqueta formant cúmuls que es solapaven parcialment amb la tinció DAPI dels nuclis, cosa que indica una localització superficial de l'etiqueta TAMRA (inferior). tríada dreta (RBD-TAMRA) a la figura 5). Els resultats que es mostren a la figura 5 indiquen que el tractament de cèl·lules Vero amb ferritina II 100 µM afecta la incorporació del RBD etiquetat a les cèl·lules. Tenint en compte que actualment no hi ha dades disponibles sobre l'efecte de la ferritina II sobre el receptor ACE2, no es pot excloure que l'efecte observat sigui degut a la unió de RBD marcat a la superfície cel·lular, però l'absència de TfR1 a les cèl·lules impedeix la incorporació. de RBD a les cèl·lules tractades amb ferritina II.

4. Discussió

El SARS-CoV-2 utilitza múltiples mecanismes per envair les cèl·lules hostes i provocar una infecció viral reeixida, i actualment s'estan avaluant una àmplia gamma d'inhibidors d'entrada de cèl·lules hostes com a estratègies terapèutiques de COVID-19 [21]. En l'estudi actual, informem dels resultats preliminars de la inhibició de la replicació in vitro del SARS-CoV-2 mitjançant el tractament de les cèl·lules diana amb ferritina II, una molècula de mida petita que pot degradar selectivament el receptor 1 de transferrina. Transferrina saturat de ferro (Fe2-Tf o holo-Tf) posseeix una gran afinitat amb els seus receptors, que s'expressa a les superfícies de la majoria de cèl·lules humanes i s'interioritza en complex amb holo-Tf per endocitosi mediada pel receptor. La formació dels complexos entre ferro i Tf, així com entre holo-Tf i TfR, depèn del pH i proporciona l'alliberament de ferro de Tf i Tf de TfR en l'entorn àcid de l'endosoma. El reciclatge de l'endosoma fa que el TfR torni a la membrana plasmàtica i alliberi la forma apo de Tf per a una nova ronda de lliurament de ferro a la cèl·lula. L'absorció de ferro per part de cèl·lules de mamífers és un procés important per regular el creixement de cèl·lules canceroses que no tenen agents farmacològics amb mecanismes d'acció coneguts. Un cribratge de 2000 compostos de mida petita de la biblioteca Diversity Set de l'Institut Nacional del Càncer va identificar 10 inhibidors del transport de ferro amb valors d'IC50 que oscil·laven entre 5 i 30 µM [22]. La ferrostatina II s'ha utilitzat com a bloquejador de TfR1 en estudis d'infecció cel·lular mitjançant TfR1 amb el virus de l'hepatitis C [23,24], el virus de la gastroenteritis transmissible [25] i el reovirus [26] (Taula 1). Cal tenir en compte que els experiments sobre la degradació de TfR1 amb ferritina II es duen a terme gairebé sempre en presència permanent de la substància al medi.

En una configuració d'assaig similar, vam trobar que la ferritina II era pràcticament no tòxica per a les cèl·lules Vero durant 48 hores d'exposició a una concentració de 400 µM. Aquesta concentració és suficient per a la degradació completa de TfR1 a la superfície de les cèl·lules cultivades [16]. D'una banda, aquest efecte es va confirmar per la reducció de la captació de Fe2-Tf marcat per les cèl·lules Vero pretractades amb 100 µM de ferritina II durant 18 h. El bloqueig no complet de la captació de Tf marcat, en aquest cas, es pot explicar per l'absència de ferritina II en el moment de l'addició de proteïnes marcades. D'altra banda, el tractament de les cèl·lules Vero amb ferritina II va canviar dràsticament l'absorció del RBD de les proteïnes Spike. En aquest estudi preliminar, no vam avaluar el nivell d'expressió d'altres receptors SARS-CoV-2 sota tractament amb ferritina II i no vam induir la eliminació d'aquests receptors coneguts per demostrar el paper independent de TfR en la mediació del SARS. - Entrada de cèl·lules CoV-2, que és una àrea de la nostra investigació posterior.

No obstant això, una unió relativament uniforme de RBD a la superfície de les cèl·lules tractades amb ferritina II pot indicar que alguns dels receptors SARS-CoV-2 de les cèl·lules Vero romanen funcionals i s'uneixen al virus, però en absència de TfR1, el virus no pot entrar a la cèl·lula. Aquest receptor és molt probablement ACE2 ja que Prabhakara et al. va demostrar un augment de la captació de RBD marcat juntament amb la transferrina marcada per les cèl·lules que sobreexpressen ACE2, cosa que suggereix que ACE2 promou la captació de RBD mitjançant endocitosi mediada per clatrina, que és explotada per TfR1 [28]. A més, hi ha proves que SARS-CoV-2 pot infectar cèl·lules ACE2-negatives mitjançant vies d'entrada alternatives [29]; per tant, una anàlisi més profunda de l'acció de la ferritina II en diversos tipus de cèl·lules és permissiva per a la infecció per SARS-CoV-2 il·luminarà el paper de TfR1 en el cicle de vida del virus. Per entendre com de prometedora és aquesta substància per a la teràpia futura de la infecció per SARS-CoV-2, és important saber com es metabolitza aquest compost in vivo. Les rates tractades amb ferritina II tenien nivells més baixos de TfR1 al fetge i reduïen el ferro sèric i la saturació de Tf sense canvis en el ferro no hemo del fetge [16].

A més, la ferritina II va induir l'expressió d'hepcidina [16, 30]. En un altre estudi, es va avaluar l'expressió gènica després de l'administració de ferritina II (en oli de blat de moro) a l'estómac de rates Wistar a una dosi de 146 mg/kg/dia durant 7 dies. Entre els gens de proteïnes que regulen el ferro, es va observar una disminució de l'expressió de HFE i una expressió augmentada de CP, GDF15 i HAMP després de l'administració de ferritina II [31]. Cal destacar que l'efecte de la ferritina II en la via de senyalització dependent de p53-molt probablement va ser la barrera que limitava el seu ús només com a inhibidor de TfR1 en cultius cel·lulars [31].

La ferrostatina II també es coneix com a negre directe 38, clorazol negre E, CI 30235 o CAS 1937- 37-7 i s'utilitza habitualment com a colorant per a la tinció de granulòcits i onicomicosi [32,33]. És important destacar que els metabòlits de benzidina del negre directe 38 que tenen un risc potencial de càncer de bufeta es van observar en mostres d'orina de treballadors d'una unitat a petita escala que va fabricar aquest colorant [34]. Tot i que la ferritina II no es pot utilitzar directament en humans, per aquest motiu, hi ha un argument que l'estratègia d'inhibir l'entrada del SARS-CoV-2 a la cèl·lula bloquejant TfR1 és prometedora, ja que aquest enfocament s'adreça al receptor de l'hoste. cèl·lules en lloc de la proteïna propensa a mutacions virals. A més, es garanteixen més estudis per identificar compostos químics que actuen com la molècula de ferritina II, però sense la formació de metabòlits amb possibles riscos per a la salut.

disfunció erèctil cistanche

Referències

1 Scialo, F.; Daniele, A.; Amato, F.; Pastore, L.; Matera, MG; Cazzola, M.; Castaldo, G.; Bianco, A. ACE2: The Major Cell Entry Receptor for SARS-CoV-2. Lung 2020, 198, 867–877. [CrossRef] [PubMed]

2. Ni, W.; Yang, X.; Yang, D.; Bao, J.; Li, R.; Xiao, Y.; Hou, C.; Wang, H.; Liu, J.; Yang, D.; et al. Paper de l'enzim convertidor d'angiotensina 2 (ACE2) en COVID-19. Crit. Care 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. Shang, J.; Sí, G.; Shi, K.; Wan, Y.; Luo, C.; Aihara, H.; Geng, Q.; Auerbach, A.; Li, F. Bases estructurals del reconeixement del receptor per SARS-CoV-2. Natura 2020, 581, 221–224. [CrossRef] [PubMed]

4. Wan, Y.; Shang, J.; Graham, R.; Baric, RS; Li, F. Reconeixement del receptor pel nou coronavirus de Wuhan: una anàlisi basada en estudis estructurals de dècades del coronavirus SARS. J. Virol. 2020, 94, e00127-20. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, Q.; Chen, CZ; Swaroop, M.; Xu, M.; Wang, L.; Lee, J.; Wang, AQ; Pradhan, M.; Hagen, N.; Chen, L.; et al. El sulfat d'heparan ajuda el SARS-CoV-2 a l'entrada de les cèl·lules i pot ser dirigit per fàrmacs aprovats in vitro. Cell Discov. 2020, 6, 80. [CrossRef]

6. Wang, K.; Chen, W.; Zhang, Z.; Deng, Y.; Lian, JQ; Du, P.; Wei, D.; Zhang, Y.; Sol, XX; Gong, L.; et al. La proteïna d'espiga CD147-és una nova ruta per a la infecció per SARS-CoV-2 a les cèl·lules hostes. Transducte de senyal. Objectiu. Allà. 2020, 5, 283. [CrossRef]

7. Wei, C.; Wan, L.; Yan, Q.; Wang, X.; Zhang, J.; Yang, X.; Zhang, Y.; Fan, C.; Li, D.; Deng, Y.; et al. El receptor B tipus 1 d'eliminador de HDL facilita l'entrada del SARS-CoV-2. Nat. Metab. 2020, 2, 1391–1400. [Ref creuat]

8. Daly, JL; Simonetti, B.; Klein, K.; Chen, KE; Williamson, MK; Anton-Plagaro, C.; Shoemark, DK; Simon-Gràcia, L.; Bauer, M.; Holanda, R.; et al. La neuropilina-1 és un factor hoste per a la infecció per SARS-CoV-2. Science 2020, 370, 861–865. [Ref creuat]

9. Wang, S.; Qiu, Z.; Hou, Y.; Deng, X.; Xu, W.; Zheng, T.; Wu, P.; Xie, S.; Bian, W.; Zhang, C.; et al. AXL és un receptor candidat per al SARS-CoV-2 que promou la infecció de les cèl·lules epitelials pulmonars i bronquials. Res cel·lular 2021, 31, 126–140. [Ref creuat]

10. Cantuti-Castelvetri, L.; Ojha, R.; Pedro, LD; Djannatian, M.; Franz, J.; Kuivanen, S.; van der Meer, F.; Kallio, K.; Kaya, T.; Anastasia, M.; et al. La neuropilina-1 facilita l'entrada de cèl·lules SARS-CoV-2 i la infecciositat. Science 2020, 370, 856–860. [Ref creuat]

11. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mecanismes d'entrada del SARS-CoV-2 a les cèl·lules. Nat. mossèn Mol. Biol cel·lular. 2022, 23, 3–20. [CrossRef] [PubMed]

12. Tang, X.; Yang, M.; Duan, Z.; Liao, Z.; Liu, L.; Cheng, R.; Fang, M.; Wang, G.; Liu, H.; Xu, J.; et al. El receptor de la transferrina és un altre receptor per a l'entrada del SARS-CoV-2. bioRxiv 2020. [CrossRef]

13. Hentze, MW; Muckenthaler, MU; Andrews, NC Actes d'equilibri: control molecular del metabolisme del ferro dels mamífers. Cèl·lula 2004, 117, 285–297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick, M. Creuant la porta de ferro: per què i com els receptors de transferrina medien l'entrada viral. Ann. Rev. Nutr. 2018, 38, 431–458. [CrossRef] [PubMed]

15. Horonchik, L.; Wessling-Resnick, M. L'inhibidor del transport de ferro de molècules petites ferritina/NSC306711 promou la degradació del receptor de transferrina. Chem. Biol. 2008, 15, 647–653. [Ref creuat]

16. Byrne, SL; Buckett, PD; Kim, J.; Luo, F.; Sanford, J.; Chen, J.; Enns, C.; Wessling-Resnick, M. Ferristatin II promou la degradació del receptor de transferrina-1 in vitro i in vivo. PLoS ONE 2013, 8, e70199. [Ref creuat]

17. Sokolov, AV; Voynova, IV; Kostevich, VA; Vlasenko, AY; Zakharova, ET; Vasilyev, VB Comparació de la interacció entre la ceruloplasmina i la lactoferrina/transferrina: lligar o no lligar. Bioquímica. Biokhimiia 2017, 82, 1073–1078. [Ref creuat]