Contacte: emily.li@wecistanche.com

Eficàcia clínica i anàlisi transcriptòmica dels grànuls de Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) en pacients amb síndrome de deficiència d'essència de la malaltia de Parkinson de Shen (ronyó)

CHEN Shi-ya1, XIAO Shao-jian1, LIN You-ning1, LI Xi-yu1, XU Qian2,

YANG Sha-sha2, HUANG Lian-hong3,4 i CAI Jing1,2

RESUMObjectiu: avaluar l'eficàcia clínica i la seguretat deGrànuls de Congrong Shujing(苁蓉舒痉颗粒, CSG) en el tractament de pacients ambmalaltia de Parkinson(PD) i la síndrome de Shen de la medicina xinesa (CM) (Ronyó) deficiència d'essència i investigar el mecanisme potencial que implica l'eficàcia mitjançant un enfocament de seqüenciació del transcriptoma. Mètodes: els pacients amb PD elegibles amb la síndrome de deficiència d'essència de Shen van ser assignats aleatòriament a un grup de tractament o a un grup de control mitjançant una taula de nombres aleatoris i van ser tractats amb CSG combinats amb medicina occidental (WM) o placebo combinat amb WM, respectivament. Els dos cursos de tractament van durar 12 setmanes. La UnificadaMalaltia de ParkinsonEs van avaluar la puntuació de l'escala de puntuació (UPDRS), la puntuació de la pregunta PD-39 (PDQ-39), la puntuació de l'escala de síndrome de CM i l'ús de fàrmacs de tots els pacients abans i després del tractament. La seguretat es va avaluar mitjançant proves de laboratori clínic i electrocardiògrafs. Es van recollir mostres de sang de 6 pacients de cada grup abans i després de l'assaig i es van utilitzar per a l'anàlisi transcriptòmica mitjançant l'anàlisi de l'ontologia gènica i l'anàlisi de la via de l'Enciclopèdia de Kyoto de gens i genomes. Els gens expressats de manera diferent es van validar mitjançant la reacció en cadena de la transcripció inversa-polimerasa. Resultats: es van seleccionar un total de 86 pacients amb EP del Tercer Hospital del Poble Afiliat de la Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Fujian entre gener de 2017 i desembre de 2017. Finalment, 72 pacients van completar l'assaig, inclosos 35 del grup de tractament i 37 en el grup de control. En comparació amb el grup control després del tractament, els pacients del grup de tractament van mostrar disminucions significatives de la puntuació UPDRS sub-Ⅱ, la puntuació PDQ-39, la puntuació de la síndrome CM i la dosi equivalent de levodopa (P).<0.05). during="" the="" treatment="" course,="" no="" significant="" changes="" were="" observed="" in="" safety="" indicators="" between="" the="" two="" groups="" (p="">0.05). Es va proposar un possible mecanisme d'eficàcia clínica que implicava la regulació dels processos relacionats amb el metabolisme cel·lular i les vies relacionades amb els ribosomes. El tractament amb CSG havia demostrat que afectava els loci genètics rellevants per a la PD, inclosos AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, BCL2L11, FTH1P2, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7, TGFBR1, WIPF2 i COX7B. Conclusions: els CSG combinats amb WM es poden utilitzar per tractar pacients amb PD amb síndrome CM de deficiència d'essència de Shen amb bona seguretat. Es va proposar el possible mecanisme d'acció i els loci genètics rellevants. (Núm. de registre ChiCTR-IOR-16008394)

PARAULES CLAU Grànuls de Congrong Shujing, malaltia de Parkinson, assaig controlat aleatoritzat, seqüenciació d'ARN, transcriptòmica, medicina xinesa

malaltia de Parkinson(PD) és una malaltia neurodegenerativa que es presenta tant a la població de mitjana edat com a la gent gran. La seva prevalença, morbiditat i càrrega econòmica associada han augmentat constantment. A la població general, la prevalença estimada de PDn als països industrialitzats és del 0,3 per cent . L'any 2030, s'espera que el nombre de pacients amb EP assoleixi els 4.940,000 a la Xina i els 8.670,000 a tot el món. El risc relatiu de mort en pacients amb MP és aproximadament el doble que la població total. Tanmateix, els règims de tractament actuals no poden impedir la progressió de la malaltia. Amb la progressió de la malaltia, l'eficàcia clínica del règim de medicació sovint disminueix i el funcionament diari i la participació social es veuen significativament compromesos. Per tant, l'atenció a llarg termini dels pacients amb EP comporta una càrrega econòmica important per a les persones, les famílies i la societat.

La levodopa, el "estàndard d'or" per al tractament de la MP, és eficaç generalment durant 3-5 anys. Després d'això, els pacients solen experimentar complicacions motores greus, com ara el fenomen del final de la dosi, rigidesa matinal, congelació i discinesia. Tractament de la PD ambLes medicines xineses(CM) poden millorar els símptomes clínics dels pacients i els efectes secundaris corresponents, millorant així la qualitat de vida dels pacients amb PD.

Grànuls de Congrongjing(苁蓉精颗粒, CRJ) està compost principalment perHerba Cistanchesi Polygonatum sibiricum, que prové de la famosa prescripció clàssica de CM Dihuang Decoction (地黄饮子) que s'utilitzava per al tractament de la MP. En els nostres estudis experimentals anteriors, es van confirmar els efectes beneficiosos del CRJ. Les dades van mostrar que Polygonatum sibiricum iHerba Cistanches, el component principal del CRJ, va millorar l'expressió de la dopamina, va reduir el contingut de factors d'apoptosi relacionats (caspasa-3, FasL), va augmentar les expressions de factors neurotròfics i va disminuir l'apoptosi de les cèl·lules nervioses dopaminèrgiques. L'estudi també va demostrar que el CRJ protegia les neurones dopaminèrgiques mitjançant la regulació de l'apoptosi i el factor neurotròfic derivat de les cèl·lules glials. Tots aquests esmentats anteriorment van suggerir que el CRJ era un medicament terapèutic segur i valuós per al tractament de la MP.

A partir de la nostra experiència clínica i investigació experimental, el CRJ es va modificar afegint Radix Paeoniae Rubra, Cortex Moutan i Salvia miltiorrhiza Bge., per tantCOngrong Shujing Grànuls(苁蓉舒痉颗粒, CSG) es van compondre. Aquest estudi va observar l'eficàcia clínica dels CSG en el tractament de pacients amb PD amb síndrome CM de deficiència d'essència de Shen (ronyó) i els canvis genètics en l'ARNm de sang perifèrica dels pacients. Per investigar el mecanisme d'acció subjacent dels CSG en el tractament de la MP, es va utilitzar un enfocament de seqüenciació d'ARN (ARN-seq) per analitzar de manera exhaustiva les transcripcions gèniques dels pacients abans i després de l'assaig, i per identificar i validar gens expressats de manera diferencial (DEG) .

MÈTODES

Criteris de diagnòstic

Els criteris de diagnòstic de la medicina occidental (WM) es referien als últims estàndards de diagnòstic de la MP publicats per la International Parkinson and Movement Disorder Society el 2015. Els criteris de diagnòstic de CM de la síndrome de deficiència d'essència de Shen es referien als estàndards relacionats publicats per la Xina Press of Traditional Chinese. Medicament.

Criteris d'inclusió i exclusió

Els pacients que complien els criteris de diagnòstic de WM anteriors, així com els criteris de diferenciació de la síndrome de CM per a la deficiència d'essència de Shen, de 50 a 80 anys, tenien una escala d'estadificació de Hoehn-Yahr (HY) de 4 i es van incloure consentiments informats per escrit signats a l'estudi. . Els pacients als quals se'ls va diagnosticar malalties importants, com ara disfunció orgànica severa, malalties mentals o neurològiques, infeccions greus, tumors, encefalitis o constitució al·lèrgica, van rebre tractament amb MC per a la MP en un termini de 3 mesos o van participar en altres assaigs clínics en els darrers 3 mesos. exclosos.

Criteris d'abandonament i terminació

Els pacients que es van retirar voluntàriament de l'assaig o no van poder ser contactats es van considerar abandonats. Els pacients que van experimentar efectes adversos greus o malalties i complicacions greus sobtades i no van poder continuar l'assaig, tenien un compliment deficient del subjecte, van rebre menys del 80 per cent o més del 120 per cent de les dosis de tractament designades, van violar els protocols de l'assaig, van proporcionar informació incompleta que afectats l'avaluació de l'eficàcia van ser exclosos de l'estudi.

Participants

Es van inscriure pacients ambulatoris i hospitalitzats amb PD elegibles del Tercer Hospital del Poble Afiliat de la Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Fujian. El pla experimental, el consentiment informat i els formularis d'informe del cas van rebre l'aprovació per escrit del Comitè d'Ètica Mèdica del Tercer Hospital del Poble Afiliat de la Universitat de Medicina Tradicional Xinesa de Fujian (núm. 2017KS-6-1) i es va registrar a la clínica clínica xinesa. Registre de proves (núm. de registre ChiCTR-IOR-16008394).

Estimació de la mida de la mostra

La mida de la mostra es va calcular a partir de les dades presentades a l'estudi anterior, i el mètode d'estimació de la mida de la mostra• 414 • Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419 va ser establert pel treball estadístic dels assaigs clínics de la Xina Grup. Utilitzant la fórmula de disseny de contingut de la mostra d'un disseny totalment aleatori, i tenint en compte una taxa d'abandonament del 20 per cent, es va determinar que el grup de tractament i el grup control haurien d'incloure 43 subjectes, respectivament.

Aleatorització, ocultació de l'assignació i cegament

En aquest estudi, es va utilitzar un mètode doble cec totalment aleatoritzat. El programari SPSS es va utilitzar per assignar subjectes aleatòriament als dos grups i per generar una taula numerada aleatòriament. Els farmacèutics dispensaven medicaments segons la taula. Els subjectes, els metges i els revisors estaven encegats a l'assignació de subjectes i fàrmacs.

Drogues

Cada dosi de CSG estava composta per l'extractiu deHerba Cistanches6 g, Polygonatum sibiricum 12 g, Salvia miltiorrhiza Bge. 15 g, Radix Paeoniae rubra 12 g, i Cortex Moutan 10 g. El placebo està format per un 5 per cent de Radix Bupleuri amb midó, dextrina, etc. El seu aspecte, olor i gust són similars als dels CSG. Tant els CSG (lot núm. 16004691) com el placebo (lot núm. 16004728) van ser proporcionats per Beijing Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (Beijing, Xina) i distribuïts pel Departament de Farmàcia del Tercer Hospital del Poble Afiliat de la Universitat Tradicional de Fujian. Medicina Xinesa.

Tractament

Els subjectes del grup de tractament van ser tractats amb WM combinat amb CSG, mentre que els subjectes del grup control van ser tractats amb WM combinat amb placebos. Els WM es van seleccionar segons la directriu. Entre ells, els medicaments més utilitzats van ser Madopar (lot núm. H10930198, Shanghai Roche Pharmaceutical Co. Ltd., Xina) i Sifrol (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH, Alemanya). Segons la guia proporcionada, durant el tractament, els metges primaris ajustarien la dosi del medicament en funció de l'estat del pacient. Cada dosi de CSG i placebo es va dividir en dos paquets iguals, pres 0,5 h després de l'esmorzar i el sopar, respectivament, durant 12 setmanes consecutives.

Mesures de resultat

Per a les mesures de resultats, incloses les escales de valoració de l'ús de fàrmacs i els índexs relacionats, els subjectes d'ambdós grups van ser avaluats per metges formats tant abans de l'estudi com als 3 mesos després de l'administració de la dosi inicial.

Mesures de resultats primaris

L'escala de valoració de la malaltia de Parkinson (UPDRS) estava composta per puntuacions de Ⅰ (comportament mental, comportament actiu i emoció), Ⅱ (activitats de la vida diària), Ⅲ (examen motor) i Ⅳ (complicacions motrius). Com més alta sigui la puntuació, més greu serà la condició.

Mesures de resultat secundàries

Les mesures de resultat secundàries inclosesMalaltia de ParkinsonPuntuació de la pregunta-39 (PDQ-39), (21) puntuació de l'escala de síndrome de CM i ús de fàrmacs de WM. El PDQ-39 avalua la qualitat de vida diària dels pacients amb PD puntuant les seves accions, emocions, vida diària i suport social. L'escala de síndrome de MC puntua les síndromes de MC relacionades dels pacients amb MP, per tal d'avaluar la gravetat de la malaltia (annex 1). La dosi de WM es va calcular com a dosi equivalent de Levodopa (LED). Per als fàrmacs relacionats amb el tractament de la MP i les seves complicacions que no estaven inclosos a la fórmula LED (és a dir, clorhidrat de benzhexol), es van fer les observacions corresponents.

Avaluació de seguretat

Les proves de laboratori clínic inclouen 3 rutines principals (sang/orina/excrements), funció hepàtica (aspartat transaminasa (AST) i alanina aminotransferasa (ALT)) i funció renal (nitrogen ureic en sang (BUN) i creatinina sèrica (Cr)) ja que l'electrocardiògraf (ECG) dels pacients es va avaluar abans i després de l'assaig. Es va registrar qualsevol esdeveniment advers amb detalls del moment, el grau de gravetat, els símptomes, la durada, les mesures preses i els resultats.

Anàlisi estadística

Per a l'anàlisi estadística es va utilitzar la versió 24 de SPSS.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Les dades de mesura distribuïdes normalment es van expressar com la mitjana ± desviació estàndard (x–± s), mentre que les dades no distribuïdes normalment es van expressar com la mitjana i el rang interquartil. Els recomptes es van expressar com a nombres absoluts i taxes. Quan es van comparar les dades de mesura entre grups, es va aplicar la prova t de dues mostres si les dades/dades transformades seguien una distribució normal. En altres casos, es va aplicar la prova de suma de rang de dues mostres. Quan es van comparar les dades de mesura abans i després de l'assaig, es va aplicar una prova t de mostres aparellades si les dades/dades transformades seguien una distribució normal, mentre que es va aplicar la prova de suma de mostres aparellades. Per a la comparació de dades de recompte, es va utilitzar la prova de Chi quadrat. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Experiments de seqüenciació de transcriptoma

ARN-seq Les mostres de sang de 6 pacients de cada grup es van seleccionar aleatòriament abans i després de l'assaig, i es va extreure, purificar i avaluar l'ARN. Per completar la construcció de la biblioteca de mostres de seqüenciació, l'ARN total es va sotmetre a l'eliminació de l'ARNr, la fragmentació, la síntesi d'ADNc de la primera cadena, la síntesi d'ADNc de la segona cadena, la reparació del terminal, l'addició d'A a l'extrem 3', la connexió conjunta i l'enriquiment. La biblioteca construïda va ser validada per Qubit® 2.0 Fluoròmetre i Agilent 2100. La seqüenciació es va realitzar després de la validació de la biblioteca.

Anàlisi Bioinformàtica

Per a l'anàlisi bioinformàtica, les lectures en brut derivades de l'anàlisi de seqüenciació es van purificar primer per obtenir lectures netes i d'alta qualitat. Posteriorment, es va utilitzar un algorisme de mapeig empalmat de His a 2 (versió 2.04) per al mapeig del genoma de les lectures netes. El nombre de lectures es va convertir en fragments per quilo-base del model d'exons per milió (FPKM) de lectures mapejades mitjançant Stringtie (versió 1.3.0) ​​i la mitjana retallada dels mètodes de valors M per estandarditzar l'expressió gènica. A continuació, es va calcular el canvi de plec en l'expressió gènica diferencial a partir del FPKM. Els gens amb un valor aq 0,05 i foldchange 2 es van considerar DEG. A DEG del grup corresponent amb eficàcia clínica, anàlisi d'enriquiment de funcions d'ontologia gènica (GO) i via de l'enciclopèdia de gens i genomes de Kyoto (KEGG)

s'ha aplicat l'anàlisi d'enriquiment. Després d'ajustar els criteris de variació, es van seleccionar els DEG de cada grup abans i després de l'assaig, que eren els loci del gen efecte delCistanche deserticolaextracte. Els gens seleccionats es van validar encara més mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa (RT-PCR).

RESULTATS

Condicions de finalització de la prova

A total of 86 PD patients were selected from the Third Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine between January 2017 and December 2017, 43 patients in each group. Finally, 72 patients completed the trial following the protocol, including 35 in the treatment group and 37 in the control group. The study flow diagram is presented in Figure 1. Between groups, no statistically significant difference was observed in age, disease stage, and H-Y stage (P>0.05, Taula 1).

Comparació de puntuacions UPDRS entre els dos grups

There was no significant difference between the two groups before treatment in UPDRS total score and subsection score (P>0.05). En comparació amb les puntuacions abans del tractament, la puntuació total UPDRS i la puntuació sub-Ⅱ es van reduir significativament en el grup de tractament després del tractament (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" updrs="" sub-ⅱ="" score="" was="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05). however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" updrs="" total="" score="" between="" the="" two="" groups="" after="" treatment="" (p="">0.05, Taula 2).

Comparació de puntuacions PDQ-39, puntuacions de síndrome CM i consum de drogues entre els dos grups

There was no significant difference between the two groups before treatment in PDQ-39 scores, CM syndrome scores, and drug dosage (P>0.05). En comparació amb abans del tractament, les puntuacions PDQ-39, la puntuació de la síndrome CM i el LED es van reduir significativament en el grup de tractament després del tractament (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" pdq-39="" score,="" cm="" symptom="" score="" and="" led="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05, table="">

Avaluació de seguretat

During the trial, 2 cases in the treatment group with adverse events were observed. Both adverse reactions were light in grade and occurred on day 4 after the start of the trial, with symptoms of internal heat, thirsty, and dryness heat. One of them was not willing to continue the trial and dropped out. One week after terminating the CM granules, the symptoms reduced and then disappeared. Regarding the other subject, after Paeoniae Rubra and Salvia Miltiorrhiza were added to the CSGs, symptoms reduced after 4 days and disappeared. No changes were observed in the clinical laboratory tests and ECG that were directly related to the trial. In addition, no statistically significant differences were observed between the two groups in any of the indices before and after the trial (P>0.05).

Comparació del genoma

De les sis mostres de cada grup, el rang del nombre de lectures del gen de referència va ser de 74452867–117774869. Les proporcions de mapeig de les seqüències del transcriptoma de la mostra eren del 87,30% al 96,14%.

Anàlisi funcional dels DEG GO Anàlisi dels DEG
Els DEG del grup de tractament abans i després de l'assaig es van agrupar en 47 grups funcionals (figura 2). A més, els DEG entre el grup de tractament i el grup control després de l'assaig es van agrupar en 35 grups funcionals (figura 3). Els DEG estaven relacionats principalment amb la regulació cel·lular i els processos de metabolisme.

Anàlisi d'enriquiment KEGG de DEG
Anàlisi d'enriquiment de la via mitjançant la base de dades pública KEGG de DEG del grup corresponent amb significació estadística clínica de P<0.05 of="" the="" efficacy="" evaluation="" indices="" above="" suggested="" that pd-related="" degs="" were="" likely="" to="" be="" enriched="" in="" the="" following="" 4="" signaling="" pathways:="" (1)="" ribosome-related signaling="" pathways,="" (2)="" endocytosis-related="" signaling="" pathways,="" (3)="" foxo="" signaling="" pathways,="" and="" (4)="" were="" identified.="" moreover,="" 1="" up-regulated="" gene="" and="" 12="" down-regulated="" genes="" were="" identified="" in="" the="" control="" group.="" according="" to="" the="" quantitative="" analysis="" of="" degs,="" 13="" highly="" degs="" related="" to="" csgs="" had="" an="" effect="" in="" the="" pd="" patients="" screened,="" including="" aida,="" ankrd36bp2,="" bcl2a1,="" bcl2l11,="" fth1p2,="" gch1,="" hprt1,="" nfe2l2,="" rmrp,="" rps7,="" tgfbr1,="" wipf2,="" and="">

Anàlisi RT-PCR
Els gens esmentats anteriorment es van validar mitjançant l'anàlisi RT-PCR. Entre ells, AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7 i COX7B eren gens regulats a l'alça, mentre que TGFBR1 estava regulat a la baixa (apèndix 3). A més, no hi va haver cap diferència significativa en el canvi dels altres tres gens.

DISCUSSIÓ

Un total del 95 per cent dels pacients amb EP tenen entre 40 i 70 anys. L'edat d'inici és majoritàriament al voltant dels 50 anys i la incidència augmenta amb l'edat. En estudis anteriors, es va suggerir que els ingredients actius dels CSG reduïen el dany relacionat amb l'oxidació de la PD i disminuïen l'apoptosi de les neurones de dopamina. Els resultats d'aquest assaig van indicar que els CSG van reduir la dosi del medicament i van millorar la qualitat de vida dels pacients amb PD. En aquest estudi, un total de 72 de 86 subjectes van completar la prova. La taxa de finalització només va ser del 83,7 per cent, que era relativament baixa en comparació amb altres assaigs clínics similars. Els motius poden incloure els dos conjunts de proves exhaustives dels subjectes abans i després de l'assaig, qüestionaris complicats i un seguiment regular de 3-mes. - Visites per ajustar la dosi. Es requereixen més esforços per millorar el compliment dels subjectes i la taxa de finalització dels assaigs.

Tanmateix, hi ha més preguntes per respondre. Els CSG poden substituir medicaments, com ara la dopamina, en les primeres fases del tractament de la MP i retardar la ingesta de medicaments? A quina etapa de la MP els CSG tenen un efecte significatiu en la reducció de la dosi de medicació? Els CSG poden allargar el període efectiu de la medicació? Per abordar aquestes preguntes, calen esforços addicionals, inclosos estudis de casos addicionals, períodes de tractament més llargs, seguiment prolongat després del tractament, augment de la gravetat detallada i estratificació per edat i una anàlisi estadística més completa.

A partir de l'observació de l'eficàcia dels CSG en el tractament de pacients amb PD, en aquest estudi, hem investigat el possible mecanisme de l'eficàcia clínica dels CSG i gens relacionats mitjançant la tecnologia RNA-seq. Es van obtenir la transcripció, els resultats de l'anàlisi de la funció GO relacionats amb l'eficàcia clínica, els resultats de l'anàlisi de la via KEGG i els loci del gen actuant en el tractament amb CSG sobre la PD. No obstant això, caldran esforços addicionals per identificar la via primària implicada en l'activitat dels CSG, els ingredients actius i els monòmers dels CSG per al tractament de la MP i els símptomes corresponents dels loci genètics sobre els quals actuen els CSG. Futur
els estudis haurien de centrar-se a integrar les teories CM amb la bioinformàtica i la biologia molecular moderna per investigar els efectes i el mecanisme d'acció de la teràpia de reforç de Shen en el tractament de la MP.

En resum, els resultats van indicar que els CSG eren efectius per millorar la qualitat de vida, alleujar els símptomes de CM i reduir la dosi de fàrmacs en pacients amb PD amb síndrome de deficiència d'essència de Shen. No es va observar cap efecte secundari greu durant l'assaig. El nostre estudi va indicar que els CSG podrien ser un nou fàrmac potencial per al tractament de la MP. Tanmateix, es necessiten estudis multicèntrics i una mida de mostra més gran per confirmar aquestes troballes, que es troba dins del nostre pla de recerca futur.

Extret de: Eficàcia clínica i anàlisi transcriptòmica dels grànuls de Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) en pacients amb síndrome de deficiència d'essència de la malaltia de Parkinson de Shen (ronyó) per CHEN Shi-ya1 etc.

------Chin J Integr Med 2020 juny;26(6):412-419