Com afecta el factor de creixement B1 (TGFβ1) a la fibrosi renal

per a més information:ali.ma@wecistanche.com

La inhibició de la senyalització del factor de creixement transformador b1 en cèl·lules intersticials residents atenua l'expressió gènica profibrotica i preserva la producció d'eritropoietina durant la fibrosi renal experimental en ratolins

Michaela A.A. Fuchs, Katharina A.E. Broeker & et al.

Fibrosi renalEs caracteritza pel desenvolupament de miofibroblasts originaris de ronyons residents i cèl·lules immigrants. La formació de miofibroblasts i la producció de matriu extracel·lular durant el dany renal són provocades per diverses citocines. Entre aquests,Factor de creixement transformador B1(TGFβ1) es considera un detonant central perfibrosi renal. Trobem una expressió altament regulada de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)i els ARNm receptor TGFβ 2 (TGFβ-R2) en cèl·lules intersticials renals enfibrosi. Aquí, vam investigar l'aportació de TGFβ1.Factor de creixement transformador B1) senyalització en cèl·lules intersticials renals residents a fibrosi d'òrgans utilitzant els models de nefropatia induïda per adenina i oclusió urètera unilateral en ratolins. Per a això, la senyalització de TGFB1 es va interrompre per la supressió induïble del gen TGFβ-R2 en cèl·lules intersticials que expressen el marcador de fibroblasts derivat del factor de creixement de plaquetes receptor-B. L'expressió de gens profibrotics es va atenuar fins a un 50% en els ronyons que no tenien TGFβ-R2 en cèl·lules positives per al receptor del factor de creixement derivat de plaquetes-B. A més, l'eliminació de TGFβ-R2 va evitar la disminució de la producció d'eritropoietina en ronyons lligats amb urèter. En particular, l'expressió associada a la fibrosi de l'actina muscular x-llisa com a marcador de miofibroblasts i els dipòsits de col·lagen extracel·lulars no es van alterar en ratolins amb deleció dirigida de TGFβ-R2. Per tant, les nostres troballes suggereixen un efecte potenciador de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)senyalització en cèl·lules intersticials residents que contribueixen a l'expressió gènica profibrotica i la desregulació de la producció d'eritropoietina, però no al desenvolupament de miofibroblasts durantfibrosi renal.

Feu clic per cistanche en pols beneficis per a la salut per a la malaltia renal

El desenvolupament i la progressió defibrosi renalés un segell distintiu de la malaltia renal crònica. Es considera comunament com el resultat d'un augment de la producció i deposició de proteïnes de matriu extracel·lular (ECM) com col·lagens, fibronectines o tenascines. Contínuafibrosi renalcondueix a un declivi progressiu de la funció glomerular i tubular i també restringeix les funcions endocrines dels ronyons resultant en una producció insuficient d'eritropoietina (EPO) que condueix a l'anèmia.

Entre les citocines i els factors de senyalització que estan implicats en la malaltia renal ifibrosiprogressióFactor de creixement transformador β1(TGFβ1) s'ha estudiat en diversos models.6.0-1 TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)S'uneix al receptor TGFβ 2(TGFβ-R2). La formació d'un complex heteromèric amb el receptor TGFβ 1 és essencial per a l'activació intracel·lular de la cascada de senyalització SMAD. i.1-18 En els ronyons danyats, augment de l'expressió de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)s'ha reportat ARNm en diferents tipus de cèl·lules renals.1517,19-2lEl paper important de TGFβ1 aronyófibrositambé s'ha delineat a partir de les troballes que l'administració de TGFβ1 exògen(Factor de creixement transformador B1)pot induirfibrosi renali que TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)els anticossos poden atenuar experimentalmentfibrosi,10.22-24Aditionally, la deleció genètica de Smad2 o 3, els efeidors intracel·lulars de TGFβ-R2, han mostrat efectes positius en el desenvolupament defibrosi.1,1

L'expressió de TGFβ-R2 s'ha reportat en molts tipus cel·lulars, limitant així el valor informatiu precís de les troballes obtingudes amb interferència general del TGFβ1 global.(Factor de creixement transformador B1)Senyalització. Això també pot explicar alguns dels informes controvertits dels últims anys.1.1.2 TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)També s'ha informat per promoureronyó fibrosipotenciant la infiltració de macròfags, que poden transdiferenciar-se en miofibroblasts.

No obstant això, el paper central de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)dinsronyófibrosiRecentment s'ha vist impugnat per la constatació queronyófibrosino es redueix bloquejant TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)senyalització en cèl·lules que produeixen activament proteïnes matricials. Està ben establert que l'augment de la producció de proteïnes matricials es deriva principalment de miofibroblasts, que poden transdiferenciar-se de diversos tipus cel·lulars, inclosos fibroblasts, monòcits, pericytes i cèl·lules tubulars i endotelials.6,10,2-32 La contribució relativa d'aquests tipus cel·lulars a la població de miofibroblasts pot variar en funció del model experimental. No obstant això, el consens creixent és que els fibroblasts residents, els pericits i les cèl·lules derivades de la medul·la òssia són els principals precursors dels miofibroblasts al ronyó i contribueixen aronyófibrosien una proporció similar. 102933-35 Els fibroblasts i pericites residents expressen el receptor del factor de creixement derivat de plaquetes β (PDGFR-β) i són un dels més,31,36。 Un estudi recent també nombrosos tipus cel·lulars en el ronyó. les cèl·lules PDGFR-βf confirmades com els principals precursors dels miofibroblasts en els ronyons humans. Aquestes cèl·lules PDGFR-βf també inclouen totes les cèl·lules renals capaces de produir EPOs,-9

Ronyó fibrosiS'associa amb una capacitat reduïda dels ronyons per produir EPO.-,3,0 Encara que les raons d'això no s'han de resoldre clarament, es creu que la transformació de cèl·lules intersticials PDGFR-β+ en miofibroblasts va de la mà de la pèrdua de la seva capacitat per produir EPO. En vista del paper important de les cèl·lules PDGFR-B intersticials com a productors nadius d'EPO i com a precursors dels miofibroblasts, ens interessava definir el paper de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)senyalització en aquesta població cel·lular.

Amb aquest objectiu, hem generat un model de ratolí amb deleció induïble de tamoxifè de TGFβ-R2 en cèl·lules PDGFR-β+ (PDGFR-βCeERT7+ TGFβ-R2/, d'ara endavant anomenats ratolins TGFβ-R2ko). Després de l'eliminació del TGFβ(Transformant el factor de creixement)-R2 en cèl·lules PDGFR-β+en ratolins adults, es van estudiar animals en 2 models d'experimentalsronyófibrosi: oclusió ureteral unilateral (UUO) i nefropatia induïda per adenina (AN). La nefropatia induïda per l'adenina és un model de dany crònic amb forts paral·lelismes amb patologies induïdes per cristalls humans, mentre que la UUO és un model de dany agut per a l'estrès mecànic.2933,42- L'ús del mètode d'hibridació in situ altament específic de l'ARN va permetre la colocalització dels ARNm d'objectiu i marcador fins a una resolució d'una sola cèl·lula. En aquests models patològics, es van examinar els efectes de la deleció de TGFB-R2 en les cèl·lules PDGFR-βfcells sobre l'expressió de l'actina muscular d-llisa(a-SMA) com a marcador per a la formació de miofibroblasts. A més, vam investigar l'expressió i deposició gènica profibètica de l'ECM. La capacitat dels ronyons per produir EPO en estats d'experimentacióronyó fibrosies va avaluar mitjançant mesures dels nivells d'EPO plasmàtics i el nombre i localització de cèl·lules que expressen ARNm EPO en ronyons danyats.

MÈTODES

Animals

Els ratolins TGFβ-R2lo van ser generats per ratolins PDGFR-βcexr2 creuats (expressió cre recombinasa induïble per tamoxifen sota el control del promotor PDGFR-β; Estoc JAX #029684) i micròfon amb al·lels TGF6-R2 franquejats amb loxP (IAX stock #012603)en un fons mixt C57BJ/6 i 129S1/SvmJ". Per al traçat del llinatge, un reporter doble fluorescent va interpretar mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute.IGFLm/; L'estoc de JAX #007676) es va criar en ratolins TGFβ-R2ko. El genotiatge es va realitzar utilitzant els imprimacions enumerats a la taula 1. Les escombraries negatives per a Cre es van utilitzar com a animals de control. Els animals es van mantenir en el chow de rosegadors estàndard (0,6% NaCl; Ssniff) amb accés gratuït a l'aigua de l'aixeta. Tots els experiments amb animals es van dur a terme d'acord amb la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori publicada pels Instituts Nacionals de Salut dels Estats Units i aprovada pel comitè d'ètica local.

Tractament de tamoxifè

La recombinació de cres va ser induïda per l'alimentació d'una dieta que contenia 400 mg de citrat de tamoxifè per quilogram (A115T00404, Sniff) durant 4 setmanes seguit d'un període de 3 setmanes amb chow estàndard. L'extirpació del gen TGF-R2 es va confirmar per reacció en cadena de la polimerasa,

Nefropatia induïda per l'adenina

Induït per l'adeninafibrosies va generar en ratolins adults. Després del tractament amb tamoxifè i el següent període de descans, els ratolins mascles van ser alimentats amb una dieta que conté adenina (0,2%) contínuament durant 3 setmanes. Els experiments es van realitzar després d'exactament 3 setmanes (3 setmanes d'adenina).

Hibridació in situ mitjançant RNAscope

La localització de l'expressió de l'ARNm es va estudiar amb el kit RNAscope Multiplex Fluorescent v2(Advanced Cell Diagnostics ACD)segons les instruccions del fabricant. Els ronyons es van fixar en la perfusió amb una solució de formalina amortidora 10% neutra, deshidratada en una sèrie d'etanol i incrustada en parafina. Els senyals d'hibridació es van detectar en sedicions de teixit de 5-μm utilitzant els fluoròfors TSA Plus Cy3 i Cy5 (PerkinElmer). Les llesques es van muntar amb prolong gold antifade mountant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i es van veure amb un microscopi Axio Observer Z1 (Zeiss). Els controls positius i negatius estaven tancats rutinàriament. Les sondes RNAsape s'enumeren a la taula 2

Taula 1 | Seqüències d'imprimació utilitzades per al genonotyping de ratolins

RESULTATS

TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)i TGFβ(Transformant el factor de creixement)-L'expressió de R2 en cèl·lules intersticials es millora durant la malaltia renal experimental

Localització de l'expressió d'ARNm TGFB1 i TGFB-R2 en el ronyó en condicions basals i durant l'experimentaciófibrosies va realitzar mitjançant hibridació in situ de RNAscope. En condicions basals, l'expressió de tGFB-R2 mRNA es va detectar en cèl·lules tubulointersticials PDGFR-B en totes les zones infantils i en cèl·lules mesangials glomerulars (Figura 1, esquerra). TGFβ-R2 també es va detectar en túbuls proximals; l'expressió en altres segments tubulars era menor(Figures suplementàries S1 i S2).

Taula 2 | Sondes RNAscope utilitzades per a la hibridació in situ

TGFb1(Factor de creixement transformador B1)L'ARNm es va localitzar en cèl·lules intersticials PDGFR-bþ en totes les zones renals i en cèl·lules mesangials glomerulars (Figura 1). Els túbuls van aparèixer negatius per a l'ARNm TGFb1. Això implica les cel·les PDGFR-β+ com a lloc d'expressió principal per a TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)en el ronyó en condicions basals.

Taula 3 | Seqüències d'imprimació utilitzades per a una reacció quantitativa de la polimerasa en cadena

Després de 3 setmanes en una dieta d'adenina (AN) o UUO de 5 dies, TGFβ1 renal(Factor de creixement transformador B1)i els nivells d'expressió d'ARNm TGFβ-R2 es van incrementar fortament en ratolins de control(Figura 2).

Augment de l'expressió de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)i TGFβ-R2 després d'AN o UUO va ser localitzat per RNAscope. Mitjançant la colocalització de marcadors específics de tipus cel·lular, podríem identificar els tipus de cèl·lules renals que mostren la regulació de TGFβ-R2 durant el dany renal (Figura 3; Figures complementàries S2 i S3). En AN, l'expressió de TGFβ-R2 mRNA va augmentar fortament en les cèl·lules intersticials PDGFR-β+ en àrees fibròtiques(Figura 3a). Els túbuls danyats amb expressió elevada de TGFβ-R2 van aparèixer amb epitelial aplanat i estaven envoltats per cèl·lules PDGFR-β+ amb fortes cèl·lules TGFβ-R2 i TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)senyals d'ARNm(Figura 3a i c, fletxes; Figura complementària S2). Túbuls amb senyals TGFβ-R2 augmentats mostrats de novo TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)expressió d'ARNm (Figura 3c; Figura complementària S3).

En els ronyons UUO, els senyals augmentats per a l'ARNm TGFβ-R2 es van detectar en cèl·lules intersticials de la medul·la externa restant (Figura 3b) i còrtex (Figura suplementària S2). Aquestes cèl·lules PDGFR-β+ també van mostrar un augment dels senyals de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)(Figura 3d).

En resum, aquestes troballes suggereixen una activació robusta de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)senyalització entre cèl·lules intersticials PDGFR-β+ i túbuls danyats durant el dany renal experimental.

Figura 1 | Expressió basal de l'ARNm del factor de creixement (esquerra) transformador del receptor B 2 (TGFb-R2) i (dreta) del factor de creixement transformador b1 (TGFb1) en seccions renals de ratolins de tipus salvatge.

La deleció induïble de TGFβ-R2 en cèl·lules PDGFR-β+, atenua l'expressió gènica profibrotica durant la malaltia renal experimental

Per analitzar la rellevància de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)senyalització per a la funció de les cèl·lules PDGFR-β+, vam examinar ratolins adults TGFβ-R2ko. Expressió basal de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)no va canviar després de l'eliminació de TGFβ-R2 en cèl·lules intersticials del ronyó (Figura 2). L'expressió de l'ARNm TGFβ-R2 es va reduir significativament en animals knockout(Figura2). L'expressió residual es va deure a l'expressió tubular de TGFβ-R2 (Figura 1). La morfologia renal no va ser diferent en ratolins TGFβ-R2ko fins a 8 setmanes després de l'eliminació de TGFβ-R2.

L'augment observat en l'expressió de TGFβ-R2 durant AN i UUO es va reduir significativament en els ronyons TGFβ-R2ko en comparació amb els ronyons de control (Figura 2). TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)L'expressió es va reduir significativament només després d'AN.

Un estudi histològic de SMAD3 fosforilat va mostrar una reducció de la translocació del factor de transcripció al nucli de cèl·lules intersticials a-SMAþ en animals TGFb-R2ko, indicant la senyalització TGFb1 interrompuda després de l'eliminació cremediada reeixida de TGFb-R2 (Figura 4).

Figura 2 | Transformació del factor de creixement b1 (TGFb1) i TGFb receptor 2 (TGFb-R2) abundància d'ARNm en ronyons i ronyons de control amb deleció induïble de tamoxifè de TGFb-R2 en receptor b-positiu del factor de creixement derivat de plaquetes (TGFb-R2ko) en condicions basals i patològiques.

La deleció induïble de TGFb-R2 en cèl·lules PDGFR-bD atenua l'expressió gènica profibrotica durant la malaltia renal experimental

Durantfibrosi, es millora la producció de components matricials, donant lloc a una àmplia deposició d'ECM i formació de cicatrius. Avaluar el possible paper de TGFβ1(Factor de creixement transformador B1)senyalització en cèl·lules residents PDGFR-Bf per a la producció de matrius, vam comparar l'expressió gènica de marcadors fibròtics entre el control i els ratolins TGFβ-R2ko.

L'alimentació d'adenina i UUO va conduir a augments de ~ 25 vegades de l'ARNm collal en els ronyons de control. Mentre que en els ronyons TGFβ-R2ko, els augments d'ARNm de collar es van reduir en ~ 50% en comparació amb els controls (Figura 5). L'alimentació per adenina i UUO també va conduir a marcats augments de l'ARNl 3al i fibronectina. Els augments d'ambdós ARNm també es van atenuar significativament en els ronyons TGFβ-R2ko.

CLIQUEU AQUÍ PER VEURE LA SEGONA PART.

REFERÈNCIES

1. Schimdf C. Duffield JS. Mecanismes defibrosi: el roke del pericit. Curr Opin Nephrol Hoertens.2011:20297-305.

2. Neelisetty S, Aford C Reynalds K, et aL. Renalfibrosino es redueix bloquejant la senyalització de factors de creixement β en les cèl·lules intersticials productores de matrius. Int. Renal 201588:503-514.

3. Bülow RD, Boor P.Extracel·lularmatrix enfibrosi renalMolt més que una bastida. J Histochem Cytochem. 2019;67643-661.

4. Humphreys BD. Mecanismes de fibrosi renal. Annu Rey FisioL201880: 309-326.

5. Maxwell PH, Ferguson DJP, Nicholls LG, et al. La resposta intersticial a les cèl·lules semblants a fibroblasts de lesió renal mostren canvis fenotípics i han reduït el potencial d'expressió eritropoietina. Int. Renal 1997;52.715-724.

6. Souma T, Yamazaki S, MoriguchiT, et alLPlasticitat de l'eritropoietina renal- cèl·lula productora governafibrosi. J Am Soc Nefrol, 2013;24:1599-1616.

7. Babit 儿L, Lin HY. Mecanismes d'anèmia en CKD. JAm Soc Nefrol. 2012:23:1631-1634.

8. Eschbach JW, Adamson JW. Anèmia de la malaltia renal en fase final (ESRD). Int. Ronyó 1985;28:1-5.

9. Broeker KAE, Fuchs MAA, Schrank J, et al Diferents subpoblacions de cèl·lules intersticials renals produeixen eritropoietina i factors que donen suport a l'oxigenació tissular en resposta a la hipòxia in Vivo.Kidney Int. 2020;98:918-931.

10. Falke LL, Gholizadeh S, Goldschmedinq R et al Diversos orígens del miofibroblast— implicacions per afibrosi renal. Nat Rey Nefrrol. 2015;11:233-244.

Nota: l'anterior no és una llista de referències completa