Les cèl·lules humanes TH17 incorporen els porus de Gasdermin E per alliberar IL-1 a l'activació de l'inflamasoma NLRP3
Nov 30, 2023
S'ha demostrat que les respostes immunitàries innates poden adoptar propietats adaptatives com la memòria. Es desconeix si les cèl·lules T utilitzen vies de senyalització immunes innates per diversificar el seu repertori de funcions efectores. Gasdermin E (GSDME) és una molècula formadora de porus de membrana que s'ha demostrat que executa la mort de cèl·lules piroptòtiques i, per tant, serveix com a possible punt de control del càncer. En el present estudi, mostrem que les cèl·lules T humanes expressen GSDME i, sorprenentment, que aquesta expressió s'associa amb una viabilitat duradora i es reutilitza per a l'alliberament de la interleucina d'alarma (IL) -1 . Aquesta propietat es va limitar a un subconjunt de cèl·lules T humanes de tipus 17 amb especificitat per a Candida albicans i regulada per un inflammasoma NLRP3 intrínsec a les cèl·lules T i el seu compromís amb una cascada proteolítica de caspases successives-8, caspasa{{6 }}, i la divisió GSDME després de l'estimulació del receptor de cèl·lules T i la maduració de la calpaïna amb llicència de calci de la forma pro-IL-1. Els nostres resultats indiquen que la formació de porus GSDME a les cèl·lules T és un mecanisme d'alliberament de citocines no convencional. Aquesta troballa diversifica la nostra comprensió del repertori funcional i l'equip mecanicista de les cèl·lules T i té implicacions per a la immunitat antifúngica.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Les cèl·lules T auxiliars (cèl·lules TH) són actors importants de les respostes efectores específiques d'antigen mitjançant la seva secreció de citocines diferents. Les cèl·lules T auxiliars de tipus 17 (cèl·lules TH17), en particular, es reconeixen per les seves funcions antifúngiques a través de la secreció de la seva signatura citocina IL-17A, que està regulada pel receptor orfe relacionat amb el factor de transcripció RAR (ROR). t1. També són els principals culpables de la patogènesi de les malalties autoimmunes2. TH1S'han reconegut anteriorment 7 cèl·lules per mostrar heterogeneïtat funcional3. Les funcions pro o antiinflamatòries s'exerceixen mitjançant la coexpressió diferencial de IL-17 amb interferó (IFN)- o IL-10, respectivament4-7. En general, això ha donat forma al concepte de dualisme de cèl·lules TH17 i ha estimulat la investigació sobre els senyals i les dianes moleculars que controlen la dicotomia entre els dos resultats funcionals de les cèl·lules TH17 per a aplicacions terapèutiques3,4,8,9. No obstant això, una comprensió profunda de la identitat i la base mecànica de la destinació de cèl·lules TH17 patògenes versus immunoreguladores segueix sent difícil de trobar. Els mecanismes efectors addicionals, encara per trobar, que van més enllà de la producció d'IL-17, també poden funcionar a les cèl·lules TH17 amb especificitats antifúngiques o antibacterianes. Les citocines IL-1, de les quals IL-1 i IL{-1 representen els membres més destacats, exerceixen efectes inflamatoris profunds. En alliberar-se de les cèl·lules presentadores d'antigen (APC), no només indueixen respostes inflamatòries innates ràpides, sinó que també orquestren la immunitat adaptativa promovent la polarització de les cèl·lules TH17 i la patogenicitat de les cèl·lules T en unir-se al seu receptor IL-1R1 compartit4,10,11. . L'encebament de cèl·lules TH17 independent d'IL-1-, que també s'ha descrit anteriorment, dóna lloc a la producció de cèl·lules antiinflamatòries TH174. La IL-1 de fonts cel·lulars innates, per tant, serveix com a factor de canvi per a la dicotomia de la destinació de les cèl·lules TH17 pro versus antiinflamatòries. A diferència de la majoria de les altres citocines, les citocines IL-1 no tenen un pèptid senyal i, per tant, són secretades per un mecanisme no convencional, independent de Golgi del reticle endoplasmàtic (ER).
La pro-IL-1 requereix una escissió enzimàtica abans de l'alliberament a l'espai extracel·lular i la vinculació del seu receptor. L'inflamsoma NLRP3 és un complex de proteïnes citosòliques multimèriques que reuneix la infecció microbiana i el dany cel·lular i recluta la caspasa-1 per a la posterior divisió pro-IL-112. La sortida de IL-1 també requereix la divisió de gas dermina D (GSDMD) mediada per la caspasa-1- i la formació de porus en un procés anomenat piroptosi, una forma inflamatòria de mort cel·lular13,14. D'altra banda, es creu que IL-1 es processa independentment de l'inflamsoma NLRP3 a través de punts de control reguladors que encara són poc coneguts10. Malgrat aquestes vies completament diferents per a la maduració i l'alliberament d'IL-1 i IL{-1, ambdues citocines són produïdes conjuntament per cèl·lules del sistema immunitari innat, cosa que apunta a l'existència d'altres que encara no s'han identificat. vies de corregulació. En el present estudi, mostrem que un subconjunt de cèl·lules TH17 humanes implica una cascada de senyalització depenent de NLRP3-per induir la formació de porus de membrana per GSDME, que serveix per a l'alliberament autocrí d'IL-1 proinflamatòria. Aquesta troballa revela un mode no convencional de secreció de citocines per part de les cèl·lules T humanes i, per tant, diversifica el repertori funcional i mecanicista de les cèl·lules T.
Beneficis de cistanche per a homes enforteixen el sistema immunitari
Resultats
La producció d'IL-1 és una característica de les cèl·lules TH humanes
Per investigar l'heterogeneïtat del subconjunt de cèl·lules TH17 humanes i revelar funcions diferents i el seu control molecular, vam realitzar una seqüenciació d'ARN unicel·lular (scRNA-seq) de cèl·lules TH17 humanes activades, que havien estat aïllades ex vivo de sang perifèrica segons la seva expressió única de marcadors superficials del receptor de quimiocines15. L'anàlisi exploratòria mitjançant aproximació i projecció de varietat uniforme (UMAP) i l'agrupació de Leiden de totes les cèl·lules TH17 van identificar sis grups individuals (Fig. 1a). Una població diferent i rara (6%) de cèl·lules TH17 que expressaven IL1A es va enriquir selectivament al clúster 1 (Fig. 1a, b). La comparació de tots els gens del clúster 1 amb la resta de clústers va revelar que IL1A estava significativament regulat (taula suplementària 1). Això va ser inesperat atès que la IL-1 no es considera que pertanyi al repertori canònic de citocines efectores de les cèl·lules T, sinó que representa un senyal de perill innat16. IL1A no es trobava, però, entre els gens més expressats de manera diferencial (DEG) del clúster 1, la qual cosa va requerir una estratègia de cerca més profunda per desemmascarar la seva regulació significativa en una subpoblació de cèl·lules TH17 (figura suplementària 1). A nivell de proteïnes, els clons de cèl·lules TH17 també es van segregar en diferents IL-1 + i IL{-1 - clons de cèl·lules T, donant suport així a l'heterogeneïtat de l'expressió de proteïnes IL-1 a nivell unicel·lular. la població de cèl·lules TH17 (Fig. 1c). Per comparar l'expressió IL1A de cèl·lules TH17 amb la d'altres tipus de cèl·lules immunitàries, especialment els productors de bona fe d'IL-1 reportats anteriorment, vam interrogar diversos conjunts de dades de scRNA-seq públics de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica humana (PBMC). Sorprenentment, això no va revelar cap expressió IL1A en diversos tipus de cèl·lules immunitàries de PBMC en repòs, incloses les cèl·lules T, les cèl·lules B, les cèl·lules assassines naturals (NK), les cèl·lules NKT, els monòcits i les cèl·lules dendrítiques (figura suplementària 2a, b). Fins i tot els monòcits no mostraven cap expressió d'IL1A a nivell unicel·lular, tret que s'apliqués a aquestes cèl·lules un estímul específic que indueix IL1A, específicament lipopolisacàrid (LPS), (figura suplementària 2c, d), que va desenmascarar la seva capacitat de produir IL1A. i l'associació de l'expressió IL1A amb una resposta immune innata inflamatòria en curs (figura suplementària 2e). És interessant que una comparació transcriptòmica unicel·lular dels DEG entre cèl·lules IL1A+ i IL1A– de cèl·lules TH17 versus monòcits no demostrés gairebé cap solapament en la coexpressió gènica (IL1A i CCL3), cosa que suggereix altament un mode diferent de regulació d'IL1A en T. cèl·lules versus monòcits (Fig. 1d). En conjunt, aquests resultats revelen l'existència d'una subpoblació diferent de cèl·lules que expressen IL-1 -dins del subconjunt de cèl·lules TH17.
El subconjunt de cèl·lules TH17 que produeix IL-1 -és proinflamatori
Per explorar la rellevància fisiològica de l'expressió IL1A en cèl·lules TH17 humanes, vam realitzar una comparació transcriptòmica imparcial de cèl·lules IL1A + i IL1A-TH17 després de scRNA-seq. L'anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens (GSEA) per a gens coexpressats amb IL1A a les cèl·lules TH17, així com l'anàlisi d'enriquiment mitjançant DEG, van revelar una associació sorprenent d'IL1A amb l'activació i la proliferació de cèl·lules T després d'una interrogació imparcial de tots els termes d'ontologia gènica (GO) disponibles ( Fig. 2a i Fig. 3 suplementària). Aquesta troballa va desafiar el paper assignat anteriorment a IL-1 en la senescència i la mort cel·lular en el nou context de les cèl·lules T17. L'anàlisi d'enriquiment també va revelar una forta sobrerepresentació de diversos termes GO relacionats amb la "inflamació", cosa que suggereix que l'expressió IL1A per part de cèl·lules TH17 va contribuir a una identitat de cèl·lules T patògenes amb papers en malalties inflamatòries (Fig. 2a). Aquesta idea va ser recolzada per la regulació a l'alça dels gens anotats amb el terme GO "resposta cel·lular a la interleucina-1", tenint en compte l'efecte de canvi proinflamatori reportat anteriorment de IL-1 sobre la funcionalitat global de les cèl·lules TH174 i l'efecte supressor. d'IL-1 autòcrina a l'expressió IL-10 (Dades ampliades Fig. 1a–c). Una comparació directa de les cèl·lules IL1A+ versus IL1A-TH17 a tots els grups va demostrar que les cèl·lules IL1A+ TH17 mostraven signatures proinflamatòries significativament millorades, però reduïdes antiinflamatòries (Fig. 2b) 7. A més, el clúster 1, que es va enriquir per a cèl·lules IL1A+ TH17, va ser significativament més proinflamatori i menys antiinflamatori que els altres cinc grups, tal com indica GSEA (Fig. 2b). És d'interès que una comparació transcriptòmica massiva de subconjunts de cèl·lules TH17 pro versus antiinflamatòries va revelar que IL1A fins i tot es trobava entre els gens més alts del subconjunt de cèl·lules proinflamatòries TH17 (Fig. 2c, d i Dades ampliades Fig. 2). IL10, en canvi, estava molt regulada a la baixa, com s'esperava segons informes anteriors4,7. Aquesta correlació recíproca de l'expressió IL-1 i IL{-10 per part de cèl·lules TH17 també es va observar a nivell de proteïnes mitjançant citometria de flux (Fig. 2e). L'anàlisi d'enriquiment amb els DEG va demostrar la sobrerepresentació de les vies KEGG (Enciclopèdia de Kyoto de gens i genomes) per a malalties autoimmunes com "artritis reumatoide" i "malaltia inflamatòria intestinal" (Fig. 2f), que van donar suport a la naturalesa proinflamatòria del TH17 que expressa IL1A. subconjunt de cel·les. De fet, els pacients que pateixen d'artritis idiopàtica juvenil (AIJ), una forma altament inflamatòria d'artritis reumatoide en nens la patogènesi dels quals s'ha relacionat prèviament amb IL-1 i IL{-1 18,19, van revelar de manera significativa i forta. expressió IL-1 elevada per cèl·lules IL-17+ TH en comparació amb cèl·lules IL-17+ TH de sang de control sana (figura 2g). En canvi, no es va observar cap augment d'IFN a les cèl·lules IL-17+ TH de la sang de pacients amb JIA en comparació amb la sang del donant control, malgrat l'associació prèviament informada de l'IFN- amb la patogenicitat de les cèl·lules TH17 (Fig. 2g, panell dret) 4. A més, l'anàlisi del líquid sinovial coincident amb la sang va demostrar freqüències molt altes de cèl·lules IL-1 + TH, cosa que suggereix que les cèl·lules T, més enllà de les cèl·lules innates, també podrien representar una font cel·lular rellevant de la IL{{74} associada a la malaltia. } al lloc de la inflamació.
Beneficis de cistanche tubulosa-enfortir el sistema immunitari
L'expressió IL-1 està regulada per un programa TH17
Per investigar si l'expressió IL-1 és una propietat general de les cèl·lules T, vam enriquir subconjunts de cèl·lules TH individuals de les PBMC segons la seva expressió diferencial dels receptors de quimiocines (Figura 3 de dades ampliades) i vam comparar la seva IL-1 secreció. IL -1 va ser produït específicament pel subconjunt de cèl·lules TH17, però no pel subconjunt de cèl·lules TH1, el subconjunt de cèl·lules TH2 o les cèl·lules T reguladores (cèl·lules Treg) (Fig. 3a-c). Sorprenentment, el seu nivell de secreció en l'estimulació amb anticossos monoclonals anti-CD3 i anti-CD28 va coincidir amb el dels monòcits humans estimulats amb LPS i nigericina, cosa que indica que les cèl·lules humanes TH17, malgrat la seva identitat immune adaptativa, serveixen com a font principal del senyal de perill IL. -1 (Fig. 3a). L'expressió intracel·lular de la proteïna IL-1 estava absent a les cèl·lules TH en repòs acabades d'aïllar, però es podia induir a l'activació del receptor de cèl·lules T (TCR), amb un enriquiment significatiu a les cèl·lules TH17 en comparació amb les cèl·lules TH enriquides amb cèl·lules TH1, TH2 i Treg (Fig. 3b). ,c). Aquestes troballes semblen ser específiques del sistema immunitari humà perquè els informes anteriors excloïen la producció d'IL-1 per les cèl·lules T del ratolí16. L'associació única de IL-1 amb el subconjunt de cèl·lules TH17 ens va impulsar a disseccionar de manera mecànica la regulació d'aquesta citocina. És interessant que l'expressió IL-1 es va reduir en la inhibició específica de ROR-t, el factor de transcripció mestre de les cèl·lules TH17 (Fig. 3d, e) 1. Aquestes dades estan en línia amb la presència de llocs d'unió putatius per a ROR-t i ROR- a les regions promotores i potenciadores d'IL1A (Dades ampliades Fig. 4a, b). El destí d'un subconjunt de cèl·lules TH en particular està determinat pel microambient de citocines polaritzador diferent durant l'estimulació ingènua de cèl·lules T. Vam observar la més alta expressió i secreció intracel·lular d'IL-1 en l'amor de cèl·lules T ingènues en condicions de polarització de cèl·lules TH17 (IL-1 i factor de creixement transformant (TGF)-) (Fig. 3f, g). Els tractaments únics amb IL-1 o TGF- per si sols no van conduir, tanmateix, a una expressió significativa d'IL-1 en cèl·lules T ingènues, posant èmfasi en l'efecte sinèrgic de les citocines combinatòries de cebament de cèl·lules TH17 en la inducció de novo de IL-1 (figura suplementària 4). En canvi, les condicions d'activació cel·lular de TH1 (IL{-12) i TH2 (IL{-4) no van alterar significativament la secreció d'IL{-1 en comparació amb la que estava estimulada en absència de citocines polaritzants. En conjunt, aquestes troballes demostren que les cèl·lules T ingènues adquireixen la capacitat de produir IL-1 mitjançant citocines que polaritzan les cèl·lules TH17. Les cèl·lules TH de memòria també van mostrar una regulació addicional significativa de la seva citocina efectora IL-1 als microambients IL{-1 i TGF- (figura 3h).
Fig. 1|Un subconjunt diferent de cèl·lules TH17 humanes pot expressar IL-1.
La identitat dels subconjunts de cèl·lules TH també es caracteritza per diferents propietats de migració, que estan associades amb l'expressió diferencial dels receptors de quimiocines20. Vam observar que l'expressió IL-1 es va enriquir en cèl·lules CCR6+ però no en cèl·lules T CCR6- i es va reduir a les cèl·lules T CXCR3- en comparació amb les cèl·lules T CXCR3+, tot i que no hi havia cap diferència en Expressió IL-1 entre cèl·lules CCR4+ i CCR4-T (Fig. 3i). Aquestes dades demostren que les cèl·lules productores d'IL-1 -exhibeixen el patró de migració assignat anteriorment a les cèl·lules productores d'IL-17-15. En conjunt, aquestes dades mostren constantment que IL-1 és una funció única de les cèl·lules TH17 humanes.
Fig. 2|Les cèl·lules TH17 que produeixen IL-1 són proinflamatòries
Fig. 3|La producció d'IL-1 per les cèl·lules T està restringida al destí de les cèl·lules TH17
La calpaina és un requisit previ per a la secreció d'IL-1 per les cèl·lules TH17
Per explorar el mecanisme de secreció d'IL-1, vam tractar cèl·lules TH17 amb l'inhibidor d'exportació de proteïnes brefeldina A (BFA) i vam trobar que la secreció d'IL-1 no es va veure afectada, a diferència de la de les citocines convencionals, com ara com IL-17A (Dades ampliades Fig. 5a–c). Això dóna suport a l'existència d'una via no convencional independent de ER-Golgi per a la secreció d'IL-1 per les cèl·lules T i està en línia amb els informes anteriors per a tipus de cèl·lules innates21,22. Una propietat única que s'ha assignat prèviament a IL-1 és la seva localització simultània al citoplasma i a la membrana plasmàtica23. Vam trobar, però, que les cèl·lules TH17, a diferència dels monòcits, no mostraven IL-1 unida a la membrana (Figura 5d de dades ampliades). Encara que es requereix la divisió de pro-IL-1 per generar IL-1 extracel·lular bioactiva, se sap que la IL-1 s'allibera de manera passiva a la mort cel·lular i exerceix el seu potencial bioactiu després d'unir-se a IL{ {19}}RI en la seva forma no escindida o escindida24. Per determinar si la pro-IL-1 se sotmet a un processament intracel·lular per a l'alliberament controlat per part de cèl·lules T humanes, es van avaluar les formes madures i de longitud completa d'IL-1 en el sobrenedant de cèl·lules TH17 activades. Per excloure qualsevol monòcit contaminant com a font potencial d'IL-1 secretada, vam generar clons de cèl·lules TH17 durant un període de 2 setmanes i els vam reestimular amb anticossos monoclonals anti-CD3 i anti-CD28 durant 5 dies més abans de la immunoblot. En els sis clons de cèl·lules TH17 provats, vam trobar un enriquiment preferent de la forma escindida d'IL-1 als sobrenedants del cultiu (Fig. 4a). Els lisats de cèl·lules TH17, en canvi, van mostrar un enriquiment preferent de la forma pro-IL -1 no escindida, com s'esperava (figura suplementària 5a). Aquests resultats exclouen l'alliberament passiu de pro-IL-1 durant la necrosi cel·lular com a modalitat de sortida d'IL-1 predeterminada a les cèl·lules T i, en canvi, suggereixen que les cèl·lules TH17 humanes han de posseir maquinària molecular per a pro-IL{{ 46}} per permetre l'alliberament extracel·lular controlat d'aquesta potent molècula bioactiva per part de cèl·lules T viables, a diferència de les cèl·lules innates (figura suplementària 5b). Això, però, no exclou una contribució addicional de la necrosi de les cèl·lules T a l'alliberament de la proforma bioactiva de IL -1 (figura suplementària 5a). El processament de pro-IL-1 en diferents llocs d'escissió pot ser catalitzat per diverses proteases17,25,26. La calpaina és una cisteïna proteasa dependent del calci que pot donar lloc al fragment IL-1 p17 madur26, que hem identificat aquí. Hem detectat l'activitat de la calpaïna a les cèl·lules TH17. Va augmentar amb l'activació amb anticossos monoclonals anti-CD3 i anti-CD28 (Fig. 4b). La secreció d'IL-1 per part de les cèl·lules TH17 depenia de l'activitat de la calpaïna intrínseca de les cèl·lules T perquè la inhibició farmacològica de la calpaïna va reduir la secreció d'IL{-1 de les cèl·lules TH17 activades a l'espai extracel·lular d'una manera dependent de la dosi (Fig. 4c) . En conseqüència, la inhibició de la calpaïna va donar lloc a una acumulació intracel·lular de pro-IL -1 (Fig. 4d). Per corroborar la dependència de la secreció IL-1 de la calpaina, també vam eliminar genèticament la calpaina a les cèl·lules TH17 humanes mitjançant repeticions palindròmiques curtes intercalades regularment agrupades (CRISPR)-Cas9. Això va revelar un paper de CAPN2, però no de CAPN1, en la secreció d'IL-1 per les cèl·lules humanes TH17 (figura 4e). En canvi, la secreció IL-1 induïda per LPS/nigericina pels monòcits no depenia de la calpaina (figura 4f). Aquestes dades eren coherents amb l'expressió preferent de CAPN2 però no CAPN1 per subconjunts de cèl·lules T humanes en contrast amb les cèl·lules dendrítiques, que mostraven un patró d'expressió gènica de calpaina invertida (figura suplementària 6). La secreció d'IL-1 a les cèl·lules TH17 va augmentar amb l'acumulació intracel·lular de calci i la inhibició de la sarco-/ER Ca2+ ATPasa amb tapsigargina (Fig. 4g) i va disminuir amb la quelació de calci extracel·lular amb (etilenbis(oxinitrur) )tetraacetat (EGTA) (Fig. 4h), coherent amb la funció dependent del calci de la calpaïna i la secreció d'IL-1 dependent del TCR26. En conjunt, aquestes dades van demostrar que l'activitat proteolítica de la proteasa calpaïna dependent del calci és un requisit previ per a la secreció no convencional d'IL-1 per part de cèl·lules TH17 humanes activades per TCR.
La secreció d'IL-1 per les cèl·lules TH17 està regulada per l'activació de l'inflamsoma NLRP3
Malgrat el paper essencial de la calpaina en la maduració de pro-IL-1, el mecanisme que conduïa a la sortida extracel·lular de la IL-1 escindida va romandre desconegut i, per tant, es va abordar a continuació. L'alliberament extracel·lular d'IL-1 per part de les cèl·lules mieloides s'ha associat prèviament amb l'activació de l'inflamsoma NLRP3, l'activitat no enzimàtica de la caspasa-1 i l'alliberament d'IL-1 16,27. Vam provar si les cèl·lules TH17 humanes posseïen la bastida molecular de l'inflamsoma NLRP3 i vam trobar l'expressió de proteïnes de NLRP3 i la molècula adaptadora, una proteïna semblant a una molla associada a l'apoptosi que conté una CARD (ASC), a les cèl·lules TH17 humanes (Dades ampliades Fig. 6a, b). Vam observar l'activació de l'inflamsoma en curs a les cèl·lules TH17 activades per TCR mitjançant la identificació de taques ASC mitjançant la tecnologia ImageStream (Fig. 5a, b) 28,29. Sorprenentment, l'augment de les freqüències de taques ASC es limitava exclusivament al subconjunt de cèl·lules TH17 (Fig. 5b, esquerra). Les cèl·lules TH17 fins i tot es van aproximar a la formació de molècules ASC dels macròfags estimulats per LPS i ATP (Fig. 5b, dreta). Els subconjunts de cèl·lules TH1 i TH2, en canvi, mostraven nivells de fons ASC-speck (Fig. 5b, esquerra). A més, la formació d'ASC-speck i NLRP3-speck es va abrogar completament en presència de l'inhibidor específic de l'inflamsoma NLRP3 MCC950, demostrant l'existència d'una activació contínua de l'inflamsoma NLRP3 a les cèl·lules TH17 (Fig. 5b, esquerra i Dades ampliades Fig. 6c). El compromís selectiu de l'inflamsoma NLRP3 per part de les cèl·lules TH17 es va recolzar encara més per la forta inducció de transcripcions de NLRP3 en l'estimulació de cèl·lules T en presència de les citocines IL-1 i TGF- que polaritzan les cèl·lules TH17 (Fig. 5c). És important destacar que la secreció d'IL-1 per les cèl·lules TH17 es va reduir significativament per la inhibició específica de l'inflamsoma NLRP3 amb MCC950 (Fig. 5d), demostrant així el paper crític de l'inflamsoma NLRP3 en la secreció d'IL-1 per cèl·lules TH17 humanes. La caspasa-1 és la proteïna efectora canònica del complex inflamasoma NLRP330. Vam observar l'expressió de pro-caspasa -1 en cèl·lules TH17 humanes activades (Fig. 5e). Tanmateix, a diferència de les troballes en monòcits estimulats per LPS i nigericina, no es va detectar cap caspasa escindida -1 en els lisats de cèl·lules TH17 humanes (Fig. 5e). Aquesta observació es va corroborar per l'absència de tinció de caspasa-1 FLICA a les cèl·lules TH17 que es van estimular en presència o absència d'IL{-1 estímuls de citocines que promouen (Dades ampliades Fig. 7a-e). A més, vam excloure l'alliberament extracel·lular de caspasa -1 mitjançant ELISA després de l'estimulació de cèl·lules TH17 amb anticossos monoclonals anti-CD3 i anti-CD28 durant 5 d (figura 5f). Fins i tot en presència de l'estímul IL-1 IL-1, la secreció de caspasa-1 no era induïble i es va mantenir tan baixa com la dels monòcits en repòs (figura 5f). La inhibició farmacològica de la caspasa-1 amb Ac-YVAD-CMK no va reduir la secreció d'IL-1 en presència o absència d'inducció d'IL{-1 per IL-1. Més aviat, vam observar una secreció IL-1 lleugerament elevada en la inhibició de la caspasa-1 (figura suplementària 7a, b). És important destacar que les cèl·lules TH17 no van mostrar cap alteració en la secreció d'IL-1 en l'esgotament de l'expressió CASP1 creat per CRISPR-Cas9- (figura 5g). D'acord amb l'absència de caspasa bioactiva-1, no vam observar cap secreció d'IL-1 per les cèl·lules TH17 humanes. Això va contrastar amb el cas dels monòcits, que van demostrar la secreció d'IL-1depenent de la caspasa{101}} en estimulació amb LPS i ATP (figura 7f de dades ampliades). A més, cap IL-1 intracel·lular no va ser detectable o induït per citocines polaritzadores d'IL-1 -en cèl·lules TH17 o clons de cèl·lules TH17 o detectable en cèl·lules TH17 activades mitjançant anàlisi de seq. de ARNc (Dades ampliades Fig. 7g, h, i). Això contrastava amb la troballa dels monòcits, que coexpressaven IL-1 i IL{-1 a nivell unicel·lular, d'acord amb el patró de secreció i corregulació putatiu suggerit anteriorment d'ambdues IL-1 citocines (Extended Data Fig. 7g)16,27. De manera acumulada, aquestes dades demostren que les cèl·lules TH17 humanes produeixen IL-1 independentment de la caspasa{-1 i IL{-1, a diferència dels monòcits i presumiblement altres cèl·lules immunitàries innates, malgrat la clara implicació de l'inflamsoma NLRP3.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity
【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
IL-1a surt de les cèl·lules TH17 a través dels porus GSDME
Les gasdermines pertanyen a una família de molècules efectores que formen porus identificades recentment que permeten l'alliberament de mediadors inflamatoris31. La nostra anàlisi del transcriptoma va revelar una regulació selectiva de l'expressió GSDME en el subconjunt de cèl·lules TH17 estimulades per IL-1 -proinflamatòria, però cap regulació de cap altre membre de la família de la gastrina (figura 6a). Això va ser sorprenent tenint en compte que l'expressió GSDME mai abans s'havia informat a les cèl·lules T primàries. En canvi, la GSDMD, que se sap que està regulada per l'inflamsoma NLRP3 i que és un objectiu de la caspasa -1 (ref. 31), no es va regular, donant suport a la idea de la senyalització no canònica de l'inflamsoma NLRP3. Anteriorment, s'ha demostrat que GSDME forma porus de membrana en cèl·lules immunitàries innates que poden servir com a conductes per a l'alliberament extracel·lular d'alarmes i iniciar la mort de cèl·lules piroptòtiques similar a GSDMD32. Per provar l'associació de GSDME amb el subconjunt de cèl·lules TH17, es va avaluar si les citocines polaritzadores de cèl·lules TH17 coregulan GSDME. Només la combinació de TGF- amb IL-1 (TH17), però no IL-12 (TH1) o IL{-4 (TH2), va augmentar els nivells de transcripció de GSDME tal com es va avaluar per transcripció inversa-quantitativa PCR (RT–qPCR) (Fig. 6b). Això va ser recolzat per l'existència de llocs d'unió putatius per als factors de transcripció associats a cèl·lules TH17 ROR- i BATF (factor de transcripció de cremallera de leucina bàsica, semblant a ATF) a les regions promotores de GSDME (Extended Data Fig. 8a, b)33. L'expressió GSDMD, en canvi, no estava regulada per les citocines polaritzadores de cèl·lules T (figura suplementària 8). Aquest resultat ens va impulsar a avaluar l'expressió de GSDME a nivell de proteïnes a les cèl·lules humanes TH17. La proforma GSDME es va inducir a l'activació de TCR. La inducció de proteïnes GSDME en resposta a aquest senyal immune adaptatiu va ser inesperada, però encara més recolzada per l'existència de llocs d'unió putatius de factors de transcripció sensibles a la senyalització de TCR com NFAT, FOS, JUN i RELA a les regions promotores de GSDME (Dades ampliades Fig. 8a). ,b). GSDME es va expressar tan aviat com 24 h després de l'estimulació policlonal. El GSDME de formació de porus N-terminal escindit es va detectar en moments tardans, 3-4 d després de l'estimulació TCR de cèl·lules TH17 (Fig. 6c). La GSDMD de longitud completa es va induir simultàniament a l'activació de cèl·lules T. En canvi, no es va observar cap escissió de GSDMD, tal com es va predir a partir de l'absència de secreció de caspasa-1 i IL{-1, deixant el paper de GSDMD a les cèl·lules TH17 obert per a una anàlisi posterior (Fig. 6c). A continuació, vam voler explorar si els porus GSDME serveixen com a conductes per a l'alliberament extracel·lular d'IL-1 a les cèl·lules TH17. Per tant, vam eliminar GSDME amb la tecnologia CRISPR-Cas9 i vam controlar l'alliberament d'IL-1 al sobrenedant al llarg del temps mitjançant ELISA. L'absència de GSDME, però no de GSDMD, va inhibir significativament l'alliberament d'IL-1 per part de les cèl·lules TH17 (figura 6d). Això demostra clarament que la formació de porus GSDME serveix com a mecanisme per alliberar IL-1 no convencional per les cèl·lules TH17 humanes.
Fig. 4|La calpaina és un requisit previ per a l'alliberament d'IL-1 escindida per les cèl·lules TH17 humanes
Fig. 5|L'activació no convencional de l'inflamsoma NLRP3 regula la producció d'IL-1 per part de cèl·lules TH17 humanes
La cascada d'escissió de caspasa-8/3 GSDME permet la secreció d'IL-1 depenent de NLRP3-
A continuació, vam explorar la possibilitat d'una diafonia mecanicista entre l'activació de l'inflamsoma NLRP3 i la divisió GSDME a les cèl·lules TH17 humanes. Recentment s'ha demostrat que la caspasa-3 escinda GSDME, que al seu torn és un objectiu de la caspasa interactora inflammasoma NLRP3-8 (ref. 34, 35). De fet, es van detectar tant pro-caspasa-8 com pro-caspasa-3 a les cèl·lules TH17. Vam trobar que la divisió de les dues caspases es va produir a l'estimulació del TCR i va precedir la divisió GSDME (Fig. 6e). En canvi, no es van detectar productes escindits de caspasa-8 i caspasa-3 en monòcits estimulats per nigericina i LPS (figura 6e). Per establir un paper causant d'aquestes caspases en la ruptura de GSDME i la secreció d'IL-1 per les cèl·lules T, vam bloquejar farmacològicament l'activitat de la caspasa-3 o la caspasa-8 amb l'inhibidor Z-DEVD. -FMK o Z-IETD-FMK, respectivament. La inhibició de l'activitat de la caspasa-8 amb Z-IETD-FMK va abrogar la divisió de la caspasa objectiu aigües avall-3, en línia amb els informes anteriors sobre altres tipus de cèl·lules36. Tots dos tractaments van reduir la divisió de GSDME alhora que van abrogar la secreció IL-1 (Fig. 6f–i i Dades ampliades Fig. 9a, b). La inhibició de la caspasa -1, en canvi, no va afectar la caspasa-3 o la divisió GSDME (figura suplementària 9). Aquestes dades van demostrar clarament que l'eix caspasa-8-caspasa{-3-GSDME funcionava a les cèl·lules TH17 humanes amb l'activació de TCR i que regulava la secreció d'IL-1 en aquestes cèl·lules. Per finalment establir l'enllaç entre aquesta cascada d'escissió proteolítica i l'inflamsoma NLRP3, vam aplicar MCC950 a cèl·lules TH17 estimulades, que, de fet, van produir una reducció significativa de la divisió de caspasa -3 i GSDME el dia 5 (Fig. 6f, g). i Dades Ampliades Fig. 9c). Tanmateix, una reducció de la divisió de la caspasa-8 va ser menys pronunciada al mateix moment de l'anàlisi, que estava en línia amb la seva finestra de temps d'activació anterior (Fig. 6e, f). En resum, la inhibició dirigida de cada jugador molecular individual va establir la cascada NLRP3 inflamasoma-caspasa-8-caspasa{-3-GSDME com la via proteolítica implicada en l'alliberament extracel·lular d'IL-1 bioactiva per part humana. Cèl·lules TH17.
Fig. 6|La cascada d'escissió NLRP3–casp8/3 condueix als porus GSDME per alliberar IL-1
Les cèl·lules TH17 són resistents a la piroptosi malgrat els porus GSDME
La formació de porus de Gasdermin s'ha associat prèviament amb la mort de cèl·lules piroptòtiques en diversos tipus de cèl·lules13,14,37. Hem trobat l'expressió de la unitat N-GSDME que forma porus escindits a la membrana plasmàtica, però no el citosol, que donava suport a la funció de formació de porus de GSDME a les cèl·lules T (Fig. 7a). Sorprenentment, una comparació transcriptòmica de cèl·lules TH17 humanes a granel intactes amb GSDME i CRISPR-Cas9 editades amb el gen i deficients en GSDME per part de GSEA va excloure diferències en diverses formes de mort cel·lular; tanmateix, en particular, va revelar que els processos i vies afectats a les cèl·lules TH17 amb deficiència de GSDME estaven relacionats principalment amb gens que controlen el transport transmembrana, en línia amb els conductes formadors de porus formats per N-GSDME (Fig. 7b i Fig. 10 suplementària). . Una comparació transcriptòmica unicel·lular de cèl·lules TH17 individuals seleccionades per la presència versus l'absència d'expressió GSDME va donar suport a la viabilitat de les cèl·lules TH17 que expressen GSDME mitjançant l'enriquiment del seu conjunt de gens per a la proliferació (Fig. 7c). Finalment vam validar la resiliència de les cèl·lules TH17 humanes que expressen GSDME a la piroptosi demostrant l'absència de cap diferència en l'alliberament de lactat deshidrogenasa (LDH) a través de les cèl·lules TH17 editades amb el gen CRISPR-Cas9, deficients en GSDME i intactes amb GSDME en l'estimulació TCR (Fig. .7d). A continuació, vam comparar les cèl·lules IL-1 + i IL{-1 - TH17 pel que fa a la seva viabilitat i potencial de proliferació, perquè les cèl·lules TH17 no mostraven cap expressió superficial IL{-1 en contrast amb IL{{36 }}producció de cèl·lules d'altres llinatges cel·lulars, com els monòcits (Figura 5d de dades ampliades). Aquesta comparació de cèl·lules IL-1 + i IL{-1 - TH17 va necessitar l'establiment d'un assaig casolà de secreció IL-1 -, que permetia aïllar les cèl·lules TH17 IL-1 + -viables mitjançant la captura de secretades. IL-1 autocrina a la superfície cel·lular després de l'estimulació de l'acetat de forbol-12-mirstat-13- (PMA) i la ionomicina. No es va observar cap diferència en l'eficiència de clonació de cèl·lules TH17 que es van dipositar com a cèl·lules individuals després de classificar la presència o l'absència d'IL{48}} de superfície (figura suplementària 11). Aquesta troballa va excloure les diferències en la viabilitat i l'expansió de les cèl·lules IL-1 + i IL{-1 - TH17 a nivell unicel·lular. A més, vam reclonar els clons TH17 que es van examinar, basant-nos en diferents graus d'expressió intracel·lular d'IL-1 i vam controlar la seva eficiència de clonació respectiva. Si l'alliberament d'IL-1 activat per GSDME s'associava amb la mort de cèl·lules piroptòtiques, llavors una correlació inversa entre l'expressió IL-1 en clons de cèl·lules T i la freqüència de creixement de clons en la seva reclonació individual (eficiència de clonació) era ser esperat. No obstant això, l'eficiència de reclonació de cèl·lules T era independent dels nivells d'expressió IL-1 als clons de cèl·lules TH17 i, en canvi, era similar a la dels clons de cèl·lules T de control, seleccionats a partir de diferents nivells d'expressió d'IFN- en absència de coexpressió IL-1 (Fig. 7e). És important destacar que els clons de cèl·lules IL-1 + TH17 van continuar reexpressant IL-1 en cicles repetitius de reestimulació de TCR (figura 7f). Així, es va excloure una pèrdua associada a la mort cel·lular de cèl·lules productores d'IL-1 -de la seva respectiva població de cèl·lules T clonals en la reestimulació. En particular, aquesta troballa indica una memòria de citocines de cèl·lules T per a IL-1 inducible. Hem realitzat una comparació transcriptòmica entre cèl·lules IL-1 + i IL-1 - TH17 a granel i vam observar un enriquiment encara més gran dels conjunts de gens de proliferació a IL-1 + en comparació amb IL-1 - cèl·lula TH17 clons (Fig. 7g). La comparació transcriptòmica unicel·lular de cèl·lules IL1A + versus IL1A-TH17 va corroborar l'enriquiment transcriptòmic per a la proliferació. Aquest també va ser el cas de la comparació del clúster 1 de Leiden, que es va enriquir per a cèl·lules TH17 que expressaven IL1A i signatures inflamatòries, amb la resta de clústers (Fig. 7h). Les cèl·lules IL-1 + TH17 van mostrar una expressió Ki67 més alta segons l'anàlisi citomètrica de flux que les seves contraparts IL{-1 després de 5 d d'estimulació policlonal (Fig. 7i), donant suport de nou a la idea que a les cèl·lules TH17 humanes IL{-1 +. {96}} la sortida no s'associa amb la mort cel·lular, a diferència de les cèl·lules innates. Acumulativament, aquestes dades exclouen una associació de la producció d'IL-1 amb la mort cel·lular (piroptòtica) fins i tot a nivell d'una sola cèl·lula i demostren que les cèl·lules T humanes tenen una memòria de citocines per a la producció d'IL-1 en la reestimulació repetitiva de TCR. .
IL-1 derivada de cèl·lules T contribueix a la defensa antifúngica de l'hoste
La nostra troballa que les cèl·lules TH17 humanes produeixen el senyal de perill innat IL-1 i reutilitza la maquinària de senyalització innata per al seu alliberament extracel·lular difumina la distinció de les respostes immunitàries adaptatives i innates i, per tant, amplia el repertori funcional general de les cèl·lules T. Una característica crítica que segueix sent característica de les respostes de memòria adaptativa és l'especificitat antigen dotada per TCR. Per tant, vam investigar si la capacitat de les cèl·lules humanes TH17 per produir IL-1 està restringida a especificitats específiques de l'antigen. Anteriorment s'ha demostrat que les cèl·lules TH17 estan molt enriquides dins de cèl·lules específiques dels antígens de C. albicans i Staphylococcus aureus15. És interessant que vam observar una expressió i secreció d'IL-1 significativament més grans per part de clons de cèl·lules TH17 específics de C. albicans que per clons de cèl·lules TH17 específics de S. aureus (Fig. 8a). A continuació, vam investigar si les cèl·lules T ingènues que reconeixen C. albicans en lloc de S. aureus estarien preparades pel seu antigen afin de produir selectivament IL-1. Les cèl·lules TH ingènues (CD45RA+ CCR7+) es van cocultivar amb monòcits autòlegs polsats amb antígens de C. albicans o S. aureus inactivats per calor o estimulats policlonalment amb anticossos monoclonals anti-CD3 i anti-CD28, i després es van clonar el dia 7. amb cèl·lules alimentadores al·logèniques. Tots els clons es van reestimular el dia 14 amb anticossos monoclonals anti-CD3 i anti-CD28 durant 5 d per a ELISA dels seus sobrenedants. Sorprenentment, vam trobar que C. albicans, però no S. aureus o l'activació del TCR policlonal, van induir la producció de novo IL-1 a les cèl·lules TH17 diferenciadores humanes (Fig. 8b). Per tant, el nostre enfocament combinat de record ex vivo i cebament in vitro estableix que la capacitat de produir IL-1 es limita a les cèl·lules T amb especificitat de TCR per C. albicans. Finalment vam provar si la capacitat distintiva de les cèl·lules TH17 específiques de C. albicans per produir IL-1 està associada amb un paper fisiològic en la defensa antifúngica de l'hoste. Per a això, vam cocultivar monòcits humans amb sobrenedants de cèl·lules TH17 humanes després de la seva reestimulació policlonal amb anticossos monoclonals anti-CD3 i anti-CD28 durant 5 d. Vam observar un augment significatiu de la fagocitosi de C. albicans marcat amb FITC per monòcits mitjançant citometria de flux. És important destacar que l'augment de la fagocitosi de C. albicans pels sobrenedants de cèl·lules TH17 depenia d'IL-1, tal com mostra l'abrogació significativa de la fagocitosi de C. albicans si els sobrenedants de cèl·lules TH17 no tenien IL-1 després de la immunoabsorció o CRISPR-Cas{ {46}}esgotament d'IL-1 dirigit a les cèl·lules TH17 (figura 8c). Les imatges in vitro de cèl·lules vives van corroborar encara més l'augment de l'absorció i eliminació de C. albicans per part dels monòcits en presència de sobrenedants de cèl·lules TH17 que contenen IL-1 - (figura 8d, dades de vídeo). En conjunt, aquestes troballes suggereixen fortament que les cèl·lules TH17 eliminen les infeccions per C. albicans no només mitjançant la seva producció d'IL-17, com es pensava anteriorment38, sinó també, en una mesura significativa, mitjançant la capacitat d'un subconjunt únic de cèl·lules TH17 de produir IL-1 . De manera acumulada, les troballes que identifiquen la formació de porus de GSDME a les cèl·lules T com a estratègia de sortida per a IL-1 proinflamatòria i la regulació de GSDME per l'eix NLRP3 inflammasoma-caspasa-8-caspasa{-3 revelen un nou eix manera de secreció de citocines de cèl·lules T que s'associa amb un subconjunt proinflamatori de cèl·lules TH17 amb especificitats antifúngiques de TCR. Això proporciona nous objectius terapèutics per a la modulació de cèl·lules TH17 humanes que són rellevants per a la defensa antifúngica de l'hoste i que també poden participar en la patogènesi de malalties inflamatòries cròniques.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
Discussió
En resum, les nostres troballes revelen una via biològica desconeguda prèviament i una modalitat de secreció de citocines a les cèl·lules T humanes que diversifica la funcionalitat global de la població de cèl·lules T. Vam trobar que l'expressió IL-1 es limitava exclusivament al destí de les cèl·lules TH17, com ho demostra la seva coexpressió amb IL-17A, regulació per ROR-t, inducció per les citocines IL{{ que desencadenen les cèl·lules TH17. 6}} i TGF- i pel seu perfil d'expressió del receptor de quimiocines associat a la cèl·lula TH17. Aquestes troballes són coherents amb l'existència de llocs d'unió per a ROR-t i ROR- a les regions potenciadores i promotores IL1Α tal com es descriu en el present estudi i amb els llocs d'unió ROR-t a la regió promotora de NLRP339. Vam observar, a més, que les citocines que desencadenen cèl·lules TH17 augmentaven l'expressió NLRP3 i GSDME. En conseqüència, els reguladors mestres del destí de les cèl·lules TH17, com ara ROR i BATF, així com múltiples factors de transcripció induïbles per TCR, van mostrar llocs d'unió putatius a les regions potenciadores de GSDME. Per tant, la polarització de les cèl·lules TH17 va promoure no només l'expressió IL-1 sinó també la seva sortida extracel·lular (Dades ampliades Fig. 10, resum gràfic). De manera inesperada, vam trobar que l'inflammasoma NLRP3 estava actiu i reutilitzat per a l'alliberament d'IL-1 en lloc d'IL-1 a les cèl·lules TH17 activades per TCR. A diferència de les cèl·lules innates, les cèl·lules T no estan especialitzades per a la detecció de perills innats, que se sap que desencadena el muntatge de components de l'inflamsoma NLRP3. Tanmateix, anteriorment s'ha demostrat que l'elevació del Ca2+ citoplasmàtic evita la senyalització de perill innat per a l'activació de l'inflamsoma NLRP316,40. Això és coherent amb la nostra troballa que l'activació del TCR, que va acompanyada de flux de calci, és un requisit per a l'alliberament d'IL-1 per part de cèl·lules TH17 humanes. Vam observar que les cèl·lules TH17 van implicar una cascada de senyalització aigües avall NLRP3 alternativa mitjançant la implicació de la caspasa -8. Això podria haver estat facilitat per l'absència d'escissió de caspasa-1 perquè el reclutament competitiu de caspasa{-1 versus caspasa-8 s'ha demostrat anteriorment34,41. També hem trobat pro-caspasa-1 i GSDMD sense escindir a les cèl·lules TH17 humanes, però no hi ha proves de la seva escissió regulada per l'inflamsoma NLRP3 ni de la producció d'IL-1. L'expressió dels seus precursors planteja la qüestió de si la senyalització clàssica de l'inflamsoma NLRP3 i l'alliberament d'IL-1 també podrien funcionar a les cèl·lules TH17 humanes si s'apliquen estímuls alternatius encara per identificar. Això implica que els mecanismes de contraregulació dependents de caspasa-8- versus caspasa-1-podrien controlar una dicotomia de la producció d'IL{{-1 versus IL{{-1 per les cèl·lules T, consolidant els rols suggerits anteriorment per a l'inflamsoma NLRP3 en l'alliberament d'IL-1 en cèl·lules TH1 humanes42 i cèl·lules TH17 murines43. Una observació intrigant del nostre estudi va ser la identificació de l'expressió i l'escissió de GSDME a les cèl·lules T. Això va revelar que la secreció no convencional de citocines a través dels porus de la membrana es pot produir a les cèl·lules T. Diverses de les funcions assignades recentment a GSDME s'han associat amb la piroptosi i la millora posterior de la mort de cèl·lules tumorals i un microambient inflamatori 32,44. Sorprenentment, vam trobar que les cèl·lules TH17 que expressaven GSDME mostraven una viabilitat preservada i una proliferació continuada en l'estimulació repetitiva de TCR en comparació amb les cèl·lules T amb deficiència de GSDME. Es van observar els mateixos resultats per IL-1 + en comparació amb IL-1 - cèl·lules T. Aquestes troballes van ser inesperades, tenint en compte que la producció d'IL-1 fins ara s'ha considerat un segell distintiu de la senescència i, per tant, de les cèl·lules aturades per la replicació o que moren45. Això evoca la idea que el senyal de perill IL-1 pot formar part d'una memòria de citocines associada a cèl·lules T que és reexcitable en el reconeixement d'antigens afins46. A més, els porus GSDME poden tenir una funció fisiològica per permetre que les cèl·lules TH17 alliberin molècules addicionals encara no identificades més enllà de IL-1 que es defineixen per la seva mida o càrrega47. Això seria coherent amb els resultats de la nostra comparació transcriptòmica imparcial de cèl·lules TH17 intactes amb GSDME o CRISPR-Cas9-dissenyades amb deficiència de GSDME, que van revelar múltiples papers per a GSDME en el transport transmembrana, però no en la mort cel·lular. El mecanisme pel qual es preserva la viabilitat i la memòria de citocines IL-1 a llarg termini a les cèl·lules T amb porus GSDME, encara s'ha d'explorar en el futur. La disponibilitat d'IL-1 de diferents fonts cel·lulars, especialment d'APC innats, planteja la qüestió de la contribució relativa de la IL-1 derivada de les cèl·lules T a la salut i la malaltia humanes. Tot i que les cèl·lules T IL-1 + constitueixen només un petit subconjunt dins del llinatge de cèl·lules T, la seva capacitat de produir IL-1 era quantitativament comparable a la dels monòcits estimulats per LPS, donant suport al nou concepte que les cèl·lules T poden servir. com a font rellevant d'IL inflamatòria-1 . Les nostres troballes d'anàlisis transcriptòmiques i funcionals revelen que la IL{100}} està associada amb el destí proinflamatori de les cèl·lules TH17. La subpoblació IL-1 + de cèl·lules humanes TH17 mostrava signatures transcriptòmiques de patogenicitat inflamatòria millorada i associacions amb malalties inflamatòries cròniques. L'expressió significativament millorada d'IL-1 mitjançant la circulació de cèl·lules TH17 de pacients amb JIA i la seva abundant localització al líquid sinovial inflamat donen suport a aquest potencial patogènic del subconjunt IL-1 + de cèl·lules TH17. Encara queda per establir una relació causal rigorosa entre les cèl·lules TH17 productores d'IL-1 -i la patogènesi de l'AIJ i l'impacte relatiu de les cèl·lules IL-1 + TH17 validat en assajos clínics futurs. Una observació sorprenent va ser que la producció d'IL-1 per part de les cèl·lules T està connectada mitjançant la seva especificitat TCR. Tot i que la producció d'IL-1 per fonts cel·lulars innates es desencadena per estímuls d'estrès inespecífics16, hem trobat que la producció d'IL-1 per part de cèl·lules TH17 humanes està associada amb una especificitat de TCR per a C. albicans. Les cèl·lules TH17 específiques de S. aureus, en canvi, van mostrar una producció d'IL-1 significativament reduïda. Aquestes troballes són coherents amb el requisit diferencial d'IL-1 per a la generació de cèl·lules TH17 específiques de C. albicans, però no de S. aureus, com s'ha informat anteriorment4 i, en conseqüència, amb el paper crític de la IL{{126} } per a la inducció de l'expressió IL-1, tal com s'informa aquí. A més, vam trobar que la secreció d'IL-1 depenia de l'estimulació del TCR i dels senyals de calci, destacant la seva estreta associació amb la senyalització immune adaptativa específica a través del TCR. Se sap que les cèl·lules TH17 són les protagonistes en l'eliminació de les infeccions per C. albicans mitjançant la seva secreció d'IL-17, que s'exemplifica amb la disbiosi de C. albicans en situacions de deficiències genètiques o terapèutiques d'IL-1738. Hem trobat que el producte de cèl·lules TH17 IL-1 estava implicat en l'eliminació de C. albicans perquè la seva absència en els sobrenedants de cèl·lules TH17 va reduir significativament la fagocitosi de C. albicans per part dels monòcits. Això suggereix que les funcions efectores de cèl·lules antifúngiques TH17 s'exerceixen no només mitjançant IL-17A/F, com es va suggerir anteriorment, sinó també mitjançant IL-1 d'una manera específica de TCR. Per tant, caldrà provar en el futur si la regulació aberrant de la via molecular que condueix a la producció d'IL-1 per part de les cèl·lules TH17 podria predisposar a una defensa de l'hoste antifúngic compromesa. De manera acumulada, els nostres resultats obren el camí per a una investigació sistemàtica de les contribucions de les cèl·lules TH17 que produeixen IL{142}}en diverses malalties inflamatòries i la defensa antifúngica de l'hoste. L'eix TCR-NLRP3 inflammasoma-caspasa-8-caspasa{-3-GSDME no només representa un mode de senyalització immune i d'instrucció del destí abans passat per alt a les cèl·lules TH, sinó que també proporciona objectius moleculars per alterar una cèl·lula TH17 patògena. identitat o aprofitar-la per a la defensa de l'amfitrió.
Fig. 7|Les cèl·lules TH17 són resistents a la piroptosi malgrat els porus de la membrana plasmàtica GSDME.
Fig. 8|L'especificitat de TCR controla la producció d'IL-1 contribuint a l'eliminació de C. albicans
Referències
1. Ivanov, II et al. El receptor nuclear orfe RORgammat dirigeix el programa de diferenciació de les cèl·lules T auxiliars IL-17+ proinflamatòries. Cel·la 126, 1121–1133 (2006).
2. Zwicky, P., Unger, S. i Becher, B. Orientar la interleucina-17 a la malaltia inflamatòria crònica: una perspectiva clínica. J. Exp. Med. 217, e20191123 (2020).
3. Stockinger, B. & Omenetti, S. La naturalesa dicotòmica de les cèl·lules T helper 17. Nat. Reverent Immunol. 17, 535–544 (2017).
4. Zielinski, CE et al. Les cèl·lules TH17 humanes induïdes per patògens produeixen IFN-gamma o IL-10 i estan regulades per IL-1beta. Nature 484, 514–518 (2012).
5. Ghoreschi, K. et al. Generació de cèl·lules TH17 patògenes en absència de senyalització TGF-beta. Nature 467, 967–971 (2010).
6. Noster, R. et al. Desregulació de les funcionalitats de les cèl·lules TH17 humanes proinflamatòries versus antiinflamatòries en la síndrome de Schnitzler autoinflamatòria. J. Al·lèrgia Clin. Immunol. 138, 1161–1169.e1166 (2016).
7. Aschenbrenner, D. et al. Un programa immunoregulador i de residència de teixits modulat per c-MAF en cèl·lules TH17 humanes. Nat. Immunol. 19, 1126–1136 (2018).
8. Wu, C. et al. Inducció de cèl·lules TH17 patògenes per part de la cinasa sensora de sal inducible SGK1. Nature 496, 513–517 (2013).
9. Matthias, J. et al. La sal genera cèl·lules Th17 antiinflamatòries però amplifica la patogenicitat en microambients de citocines proinflamatòries. J. Clin. Invertir. 130, 4587–4600 (2020).
10. Cavalli, G. et al. Interleucina 1alfa: una revisió exhaustiva sobre el paper de la IL-1alfa en la patogènesi i el tractament de malalties autoimmunes i inflamatòries. Autoimmune. Rev. 20, 102763 (2021).
11. Acosta-Rodriguez, EV, Napolitani, G., Lanzavecchia, A. i Sallusto, F. Les interleucines 1beta i 6 però no el factor de creixement beta transformador són essencials per a la diferenciació de les cèl·lules T helper humanes que produeixen interleucina 17- . Nat. Immunol. 8, 942–949 (2007).
12. Latz, E., Xiao, TS i Stutz, A. Activació i regulació dels inflamasomes. Nat. Reverent Immunol. 13, 397–411 (2013).
13. Shi, J. et al. La divisió de GSDMD per caspases inflamatòries determina la mort de les cèl·lules piroptòtiques. Nature 526, 660–665 (2015).
14. Liu, X. et al. La dermina D del gas activat per l'inflamasoma causa piroptosi formant porus de membrana. Nature 535, 153–158 (2016).
15. Acosta-Rodriguez, EV et al. Fenotip superficial i especificitat antigènica de cèl·lules de memòria T helper que produeixen interleucina humana 17-. Nat. Immunol. 8, 639–646 (2007).
16. Gross, O. et al. Els activadors de l'inflamasoma indueixen la secreció d'interleucina- 1alfa per vies diferents amb diferents requisits per a la funció de proteasa de la caspasa-1. Immunitat 36, 388–400 (2012).
17. Malik, A. i Kanneganti, TD Funció i regulació de la IL-1alfa en malalties inflamatòries i càncer. Immunol. Rev. 281, 124–137 (2018).
18. Cimaz, R. Artritis idiopàtica juvenil d'inici sistèmic. Autoimmune. Rev. 15, 931–934 (2016).
19. Fong, KY, Boey, ML, Koh, WH i Feng, PH Concentracions de citocines al líquid sinovial i al plasma de pacients amb artritis reumatoide: correlació amb erosions òssies. Clin. Exp. Reumatol. 12, 55–58 (1994).
20. Eyerich, S. & Zielinski, CE Definició de subconjunts de cèl·lules Th d'una manera clàssica i específica de teixit: exemples de la pell. Eur. J. Immunol. 44, 3475–3483 (2014).
21. Monteleone, M., Stow, JL i Schroder, K. Mecanismes de secreció no convencional de citocines de la família IL-1. Citocina 74, 213–218 (2015).
22. Keller, M., Ruegg, A., Werner, S. i Beer, HD La caspasa activa-1 és un regulador de la secreció de proteïnes no convencionals. Cel·la 132, 818–831 (2008).
23. Kurt-Jones, EA, Beller, DI, Mizel, SB i Unanue, ER Identificació d'una interleucina 1 associada a membrana en macròfags. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 82, 1204–1208 (1985).
24. Mosley, B. et al. El receptor d'interleucina-1 s'uneix al precursor alfa de la interleucina-1 humana però no al precursor de la interleucina-1 beta. J. Biol. Chem. 262, 2941–2944 (1987).
25. Carruth, LM, Demczuk, S. i Mizel, SB Implicació d'una proteasa semblant a la calpaïna en el processament del precursor de la interleucina 1alfa murina. J. Biol. Chem. 266, 12162–12167 (1991).
26. Kobayashi, Y. et al. Identificació de la proteasa neutral activada per calci com a enzim de processament de la interleucina 1 alfa humana. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 87, 5548–5552 (1990).
27. Fettelschoss, A. et al. Activació de l'inflamasoma i IL-1beta objectiu IL-1alfa per a la secreció en lloc de l'expressió superficial. Proc. Natl Acad. Ciència. EUA 108, 18055–18060 (2011).
28. Franklin, BS, Latz, E. & Schmidt, FI Les funcions intracel·lulars i extracel·lulars de les taques ASC. Immunol. Rev. 281, 74–87 (2018).
29. Nagar, A., DeMarco, RA i Harton, JA Caracterització i avaluació de l'activitat de l'inflamasoma i la caspasa-1: una detecció i avaluació basada en citòmetres de flux d'imatge de taques d'inflamsoma i activació de caspasa-1. J. Immunol. 202, 1003–1015 (2019).
30. Rathinam, VA i Fitzgerald, KA Complexos inflamasomes: mecanismes emergents i funcions efectores. Cel·la 165, 792–800 (2016).
31. Broz, P., Pelegrin, P. i Shao, F. El cervell és una família de proteïnes que executa la mort i la inflamació cel·lular. Nat. Reverent Immunol. 20, 143–157 (2020).
32. Zhang, Z. et al. Gasdermin E suprimeix el creixement del tumor activant la immunitat antitumoral. Nature 579, 415–420 (2020).
33. Schraml, BU et al. El factor de transcripció AP-1 BATF controla la diferenciació de TH17. Nature 460, 405–409 (2009).
34. Antonopoulos, C. et al. Caspasa-8 com a efector i regulador de la senyalització de l'inflamsoma NLRP3. J. Biol. Chem. 290, 20167–20184 (2015).
35. Vajjhala, PR et al. L'adaptador d'inflamsoma ASC indueix filaments del domini efector de mort de procaspasa-8. J. Biol. Chem. 290, 29217–29230 (2015).
36. Stennicke, HR et al. La pro-caspasa-3 és un objectiu fisiològic important de la caspasa-8. J. Biol. Chem. 273, 27084–27090 (1998).
37. Deng, W. et al. L'exotoxina B pirogènica estreptocòcica escinda GSDMA i desencadena la piroptosi. Nature 602, 496–502 (2022).
38. Puel, A. et al. Candidiasi mucocutània crònica en humans amb errors innats de la immunitat interleucina-17. Science 332, 65–68 (2011).
39. Billon, C., Murray, MH, Avdagic, A. & Burris, TP RORgamma regula l'inflamsoma NLRP3. J. Biol. Chem. 294, 10–19 (2019).
40. Lee, GS et al. El receptor sensor de calci regula l'inflamsoma NLRP3 mitjançant Ca2+ i cAMP. Nature 492, 123–127 (2012).
41. Gao, Y. et al. El perfil transcripcional identifica la caspasa-1 com a regulador intrínsec de les cèl·lules T de la diferenciació Th17. J. Exp. Med. 217, e20190476 (2020).
42. Arbore, G. et al. La immunitat T helper 1 requereix l'activitat inflamasoma NLRP3 impulsada pel complement a les cèl·lules T CD4+. Science 352, aad1210 (2016).
43. Martin, BN et al. L'ASC intrínsec de cèl·lules T promou críticament l'encefalomielitis autoimmune experimental mediada per TH17-. Nat. Immunol. 17, 583–592 (2016).
44. Wang, Y. et al. Els fàrmacs de quimioteràpia indueixen la piroptosi a través de la divisió de la caspasa-3 d'un cervell. Nature 547, 99–103 (2017).
45. Wiggins, KA et al. La divisió IL-1 per caspases inflamatòries de l'inflamsoma no canònic controla el fenotip secretor associat a la senescència. Aging Cell 18, e12946–e12946 (2019).
46. Helmstetter, C. et al. Les cèl·lules T auxiliars individuals tenen una memòria quantitativa de citocines. Immunitat 42, 108–122 (2015).
47. Xia, S. et al. L'estructura del porus de Gasdermin D revela un alliberament preferent d'interleucina madura-1. Nature 593, 607–611 (2021).
