Avaluació in vitro de les interaccions entre fàrmacs i fàrmacs mediades per P-gp mitjançant el model de cèl·lules renals humanes RPTEC/TERT1

edmund.chen@wecistanche.com

Introducció L'avaluació in vitro del potencial inhibidor de la glicoproteïna P (P-gp) és un tema important durant el procés de desenvolupament de fàrmacs, ja que permet la predicció d'interaccions fàrmacs (DDI) clínicament rellevants [1–3]. P-gp pertany a la superfamília del transportador de cassets d'unió a l'ATP (ABC) i està codificat pel gen de resistència a múltiples fàrmacs MDR1 (també conegut com ABCB1). Se sap que aquest transportador de membrana està sobreexpressat a les cèl·lules tumorals i causa resistència a molts fàrmacs anticancerígens [4]. Situat dins de totes les barreres fisiològiques, inclosos l'intestí, el fetge ironyons, P-gp protegeix contra els xenobiòtics limitant l'absorció d'aquests substrats del tracte digestiu i facilitant-ne l'eflux a la bilis i l'orina. Així, la P-gp té un paper notable en la farmacocinètica de diverses classes terapèutiques [5–7]. Se sap que una gran quantitat de fàrmacs com els agents anticancerígens, els antifúngics i els fàrmacs cardiovasculars són substrats i/o inhibidors de la P-gp, i molts d'ells estan implicats en interaccions clínicament rellevants [8–10]. Per tant, l'Administració d'Aliments i Medicaments dels Estats Units (FDA) imposa que el potencial inhibidor de la P-gp s'ha d'avaluar durant les primeres etapes del desenvolupament del fàrmac. Els assajos in vitro realitzats amb aquesta finalitat es basen habitualment en estudis de transport de fàrmacs utilitzant línies cel·lulars que expressen P-gp. Més precisament, les directrius de la FDA recomanen la determinació dels valors de la concentració inhibitòria mitja màxima in vitro (IC50) per avaluar el risc de DDI clínics derivats de la inhibició de la P-gp. Amb aquesta finalitat, s'han realitzat molts assajos experimentals, i la majoria d'ells s'han centrat en les interaccions farmacològiques relacionades amb l'absorció intestinal mitjançant els models Caco-2 o MDCK-MDR1 [11–13]

CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL

Des derenall'eliminació també és una via d'eliminació comuna per a diverses classes de fàrmacs, la secreció tubular activa mitjançant transportadors ABC també pot tenir un paper clau en aquestes interaccions [14]. No obstant això, dades in vitro sobrerenalEls DDI mediats per P-gp són limitats. Això es deu en part a la manca de desenvolupament i caracterització de models in vitro per a la predicció derenaltransport de drogues. Entre diverses línies cel·lulars humanes, el model RPTEC/TERT1 sembla prometedor per a l'avaluació derenalinteraccions farmacològiques. Aquesta línia cel·lular es deriva d'un donant humà sa i s'ha generat a partir de cèl·lules del túbul proximal immortalitzades. A més, s'ha demostrat l'expressió i la funcionalitat de P-gp utilitzant aquest model, confirmant així la seva capacitat de predirrenalefuxes de fàrmacs [15, 16]. En aquest context, el present estudi es va dissenyar per investigar el potencial inhibidor de P-gp mitjançant el model RPTEC/TERT1. En primer lloc, es va realitzar un assaig de cribratge d'acumulació de rodamina 123 (R123) per obtenir un perfil d'inhibició per a cada fàrmac provat. A partir d'aquest cribratge, es van seleccionar quatre fàrmacs per avaluar els seus efectes depenents de la concentració sobre l'acumulació intracel·lular de dos fàrmacs substrat de P-gp: apixaban i rivaroxaban.

Paraules clau:cèl·lula renal, model renal, fàrmac renal, eliminació renal, ronyons.

Materials i mètodes

ReactiusApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarina i dabigatran etexilat es van comprar a Alsachim (Illkirch, França). El verapamil, el ketoconazol, la simvastatina, l'amiodarona, la rodamina 123, la solució de sal equilibrada de Hank (HBSS) i la solució HEPES es van comprar a Sigma–Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, França).

Cultiu cel·lular  Les cèl·lules RPTEC/TERT1 es van obtenir de l'American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, França) i es van cultivar en un medi sense sèrum definit hormonalment que consistia en el medi F12 de Dulbecco (ATCC) complementat amb un kit de factor de creixement (ATCC) i un 1 per cent de mescla antibiòtica/antimicòtica (penicil·lina-estreptomicina, amfotericina B) a 37 graus i 5 per cent de CO 2. Per a tots els experiments, les cèl·lules es van sembrar en 96-plaques de pous a una densitat de 50,000 cèl·lules per pou i es van utilitzar per créixer després de 14 dies de cultiu. El medi es va renovar cada 2 dies i es van utilitzar cèl·lules del pas 27 al pas 34. També es van comprar cèl·lules de caco-2 a l'ATCC. Les cèl·lules es van mantenir en un medi de cultiu format per Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma–Aldrich, Missouri, EUA) complementat amb un 10% de FBS, un 1% d'aminoàcids no essencials i una barreja d'antibiòtics/antimicòtics de l'1% (penicil·lina-estreptomicina, amfotericina B). ) a 37 graus i 5 per cent de CO2. Les cèl·lules de caco-2 es van sembrar en plaques de 96-pous a una densitat de 5 × 10 3 cèl·lules per pou i es van utilitzar per créixer després de 14 dies de cultiu. Les cèl·lules epitelials tubulars proximals humanes (HPTEC) es van obtenir de BIOPREDIC (Rennes, França) i es van cultivar en DMEM/F12 suplementat amb hidrocortisona, EGF, insulina, transferrina i selenit de sodi. Les cèl·lules es van sembrar en plaques de cultiu 96-ben recobertes de col·lagen a una densitat de 6600 cèl·lules per pou i es van utilitzar per créixer després d'11 dies de cultiu.

Assaig de cribratge d'acumulació de rodamina 123  El potencial inhibidor de P-gp es va determinar mesurant l'acumulació intracel·lular de rodamina 123 a les cèl·lules RPTEC/TERT1 en presència i absència de diverses classes de fàrmacs. Entre els 14 fàrmacs provats, es van utilitzar com a inhibidors de P-gp ciclosporina A (10 µM), ketoconazol (50 µM), verapamil (100 µM) i amiodarona (50 µM). Apixaban, rivaroxaban i dabigatran etexilat (tres anticoagulants orals directes (DOAC)) es van utilitzar com a substrats de P-gp (10 µM). La warfarina (50 µM) es va utilitzar com a no inhibidor i es van utilitzar cinc fàrmacs anticancerígens com nilotinib, crizotinib, erlotinib i idelalisib sense conèixer els seus perfils d'inhibició a una concentració de 10 µM. Es van reproduir diverses condicions amb les cèl·lules Caco-2, que estan aprovades per la FDA per a estudis de transport de fàrmacs. D'aquesta manera, es va determinar la retenció intracel·lular de la rodamina 123 a les cèl·lules Caco-2 en presència i absència de verapamil (100 µM), ciclosporina A (10 µM), nilotinib (10 µM) i DOAC (10 µM). ). Breument, després de 14 dies de cultiu a 96-plaques de pous, les cèl·lules es van preincubar durant 10 min a 37 graus amb cada fàrmac dissolt en HBSS amb HEPES 10 mM (v/v). A continuació, les cèl·lules es van incubar amb 10 µM de rodamina 123 durant 45 minuts a 37 graus. Finalment, després de tres rentats en solució freda HBSS/HEPES, les cèl·lules es van lisar a temperatura ambient durant 45 min en una solució de dodecil sulfat de sodi (SDS) que contenia un 1% de borat de sodi. La quantitat d'intracel·lularrhodamine 123 es va quantificar mitjançant un nanoespectrofuoròmetre Infnite M (Life Sciences, TECAN, Suïssa), fixant les longituds d'ona a 485/535 nm. Les dades es van expressar com a percentatges de l'acumulació de rodamina 123 a les cèl·lules de control no exposades a cap inhibidor potencial de P-gp i es van establir arbitràriament al 100 per cent d'acumulació.

Assaig d'acumulació intracel·lular de DOAC i determinació d'IC50 A partir de l'assaig de cribratge de rodamina 123 anterior, es van escollir quatre fàrmacs per investigar els seus efectes depenents de la concentració sobre l'acumulació intracel·lular d'apixaban i rivaroxaban (10 µM) a les cèl·lules RPTEC/TERT1. El ketoconazol, el crizotinib i el nilotinib es van seleccionar com a inhibidors de la P-gp i es va triar la warfarina com a no inhibidor. La ciclosporina A (10 µM) es va utilitzar com a inhibidor d'ampli espectre dels transportadors. Els estudis de les interaccions entre els DOAC i el nilotinib per determinar els valors d'IC50 es van reproduir a les cèl·lules Caco-2 per comparar els dos models cel·lulars. Tots els compostos es van diluir sols o amb l'inhibidor associat al tampó de transport HBSS complementat amb un 1% d'HEPES (v/v) i un 1% de DMSO (v/v). Abans de la incubació, totes les solucions es van escalfar prèviament a 37 graus i el pH es va ajustar a 7,4. Per als fàrmacs anticancerígens crizotinib i nilotinib, a causa de la seva poca solubilitat i potencial citotòxic, les concentracions van oscil·lar entre 0,1 i 25 µM. Per al ketoconazol i la warfarina, les concentracions van oscil·lar entre 0,1 i 100 µM. Breument, després de 14 dies de cultiu, tots els fàrmacs dissolts en HBSS amb un 1% d'HEPES (v/v) es van pre-incubar durant 10 minuts a 37 graus. A continuació, es van incubar les cèl·lules amb 10 µM d'apixaban o rivaroxaban durant 60 min a 37 graus. Finalment, després de tres rentats en solució freda d'HBSS/HEPES, les cèl·lules es van lisar a temperatura ambient durant 45 min en una solució al 0,2 per cent de Triton X-100. A continuació, es va quantificar la quantitat de DOAC intracel·lular mitjançant cromatografia líquida-espectrometria de masses (LC-MS). Les dades es van expressar com a augments percentuals de l'acumulació de DOAC i l'acumulació intracel·lular de DOAC es va establir arbitràriament al 100 per cent a les cèl·lules de control. Els valors IC50 per a la inhibició de l'activitat de P-gp, que corresponen als valors de concentració efectiva mitja màxima (EC50) per augmentar l'acumulació de DOAC, es van determinar a partir del modelatge de regressió de mínims quadrats no lineals no ponderats d'augment de l'acumulació amb la funció 'nls ()' a R programari, segons l'equació següent (Eq. 1):

Cromatografia líquida–Anàlisi d'espectrometria de massesLa quantificació d'apixaban (m/z 460.19793) i rivaroxaban (m/z 436.07285) es va realitzar mitjançant un Ultimate U300{{18 }} sistema de cromatografia líquida (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA) juntament amb un espectròmetre de masses Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Bremen, Alemanya). Les separacions LC es van aconseguir mitjançant una columna analítica Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, EUA) i un cabal de 0,6 ml/min . La fase mòbil A era aigua amb 0,1% d'àcid fòrmic (FA) i la fase mòbil B era acetonitril amb 0,1% FA. Per al rivaroxaban, el gradient va ser: 0–{0,3 min, 10 per cent de B; 0,3-1 min, lineal del 10% al 70% B; 1–1,5 min, 70 per cent B; 1,51 min, tornar a les condicions inicials fins als 3 min. Per a apixaban, el gradient va ser: 0–0,3 min, 10 per cent B; 0,3–0,7 min, lineal del 10 al 90 per cent de B; 0,7–1,5, 90 per cent B; 1,51 min, tornar a les condicions inicials fins als 3 min. La detecció es va realitzar en mode de monitorització de reaccions paral·leles (PRM) positiva amb electrospray amb una resolució de 35, 000 (a m/z 200). Els estàndards interns (IS) van ser [13C,2H7]-apixaban (m/z 468,2452) per a apixaban i [13C6]-rivaroxaban (m/z 442,09297) per a rivaroxaban. Per a cada fàrmac i el seu IS respectiu, es va controlar un ió objectiu (per a la quantificació) i un ió de confirmació. Per al rivaroxaban i el seu IS, l'ió objectiu era m/z 144,95125 i els ions de confrmència eren m/z 231,11280 i m/z 237,13298, respectivament. Per a l'apixaban i el seu IS, l'ió objectiu era m/z 199,08656 i els ions de confirmació eren m/z 282,12387 i m/z 241,06062, respectivament.

Resultats

Assaig de cribratge d'acumulació de rodamina 123L'assaig de cribratge d'acumulació de rodamina 123 es va realitzar en cèl·lules RPTEC/TERT1 amb 14 fàrmacs amb diferents perfils d'inhibició (Fig. 1). Com era d'esperar, l'acumulació intracel·lular de rodamina 123 en presència de ciclosporina A, un inhibidor d'ampli espectre, va ser una de les més altes, amb un augment de l'acumulació del 75 per cent en comparació amb les cèl·lules de control. La presència de verapamil, un inhibidor específic de la P-gp, va provocar un augment de l'acumulació de rodamina 123 del 57%, demostrant la implicació de la P-gp. De la mateixa manera, el ketoconazol, descrit com un fort inhibidor de la P-gp, va provocar un augment més gran (66 per cent) de l'acumulació intracel·lular de rodamina 123 en comparació amb el verapamil, confirmant el seu perfil d'inhibició. Per contra, l'addició d'amiodarona, caracteritzada com a inhibidor moderat de P-gp, va provocar un augment de l'acumulació del 59 per cent, que és similar a la causada pel verapamil. Es van observar diferents perfils d'inhibició per als agents anticancerígens nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib i idelalisib. L'addició de nilotinib va ​​provocar un fort augment en l'acumulació de rodamina 123 (71 per cent), cosa que suggereix un potencial inhibidor important, seguit d'axitinib, que va provocar un augment de la retenció del 57 per cent. D'altra banda, el crizotinib i l'erlotinib van demostrar potencials inhibidors moderats a baixos, amb augments de l'acumulació de rodamina 123 del 23% i del 16%, respectivament. Idelalisib no va afectar l'acumulació de rodamina 123; el mateix passava amb la warfarina, que era

triat com a no inhibidor. Entre els tres DOAC, l'apixaban i el rivaroxaban van provocar un lleuger augment de la retenció de rodamina 123: 33 per cent i 12 per cent, respectivament. Curiosament, el dabigatran etexilat, un profàrmac del dabigatran i un substrat conegut de la P-gp, va provocar un augment de la retenció de la rodamina 123 d'aproximadament un 50 per cent, tot i que no es descriu com un potencial inhibidor de la P-gp. Finalment, l'addició de simvastatina només va provocar un lleuger augment de l'acumulació del substrat fluorescent (32 per cent). A partir d'aquest cribratge, es van seleccionar quatre fàrmacs per avaluar els seus efectes dependents de la concentració sobre l'acumulació intracel·lular d'apixaban i rivaroxaban dins del model RPTEC/TERT1. El ketoconazol es va escollir com a condició de control positiu per a la inhibició de la P-gp i la warfarina es va seleccionar com a no inhibidor de la P-gp per a la condició de control negatiu. Nilotinib i crizotinib es van seleccionar com a inhibidors P-gp forts i moderats, respectivament. Es van reproduir diverses condicions amb el model de referència, Caco-2. L'acumulació intracel·lular de R123 a les cèl·lules es va determinar després de la combinació (o no) amb apixaban i rivaroxaban (10 µM), nilotinib (10 µM) i amb ciclosporina A (10 µM) i verapamil (100 µM) per a les condicions de control per a la inhibició. (Fig. 2A). Com era d'esperar, el verapamil i la ciclosporina A van provocar augments elevats de la retenció de R123 del 297% i del 275%, respectivament. De la mateixa manera, nilotinib va ​​provocar un augment elevat de l'acumulació intracel·lular de R123 (229 per cent), confirmant el seu potencial inhibidor. La combinació de R123 amb DOAC va provocar augments menors en l'acumulació de R123 (40-44 per cent) en comparació amb la resta de fàrmacs. A més, l'acumulació intracel·lular de rodamina 123 en absència i presència de ciclosporina A enrenalLes cèl·lules humanes primàries també es van investigar en aquest estudi per comprovar la fiabilitat dels resultats obtinguts amb cèl·lules RPTEC/TERT1 (Fig. 2B). Aquestes anàlisis van mostrar que la presència de ciclosporina A va augmentar la retenció de R123 en un 71 per cent. Aquest valor era proper al obtingut en les mateixes condicions amb les cèl·lules RPTEC/TERT1 (un augment del 75 per cent amb la ciclosporina A). Per tant, l'activitat de la glicoproteïna P era similar al model RPTEC/TERT1 i a les cèl·lules humanes primàries.

Assaig d'acumulació intracel·lular de DOAC: determinació de la relació IC50 i I1/IC50 Es van realitzar estudis d'acumulació intracel·lular per avaluar el transport d'apixaban i rivaroxaban mediat per P-gp a una concentració constant d'10 µM en cèl·lules RPTEC/TERT1 in vitro i en presència de concentracions creixents de nilotinib, crizotinib, ketoconazol. , i warfarina (Figs. 2, 3). Es va avaluar el modelatge de l'augment de la retenció d'apixaban i rivaroxaban per determinar els valors d'IC50. La combinació de DOAC amb nilotinib va ​​provocar els valors d'IC50 més baixos: 0,85 µM i 1,37 µM per a rivaroxaban i apixaban, respectivament (Figs. 4, 5). La combinació amb crizotinib va ​​donar valors IC50 de 10,1 µM i 12,2 µM per a rivaroxaban i apixaban, respectivament. Sorprenentment, la combinació de DOAC amb cetoconazol no va produir els valors IC50 més baixos (16,5 µM i 16,9 µM per a rivaroxaban i apixaban, respectivament). Finalment, com era d'esperar, combinació amb warfarina, que era

triat com a no inhibidor, no va afectar les retencions intracel·lulars dels dos DOAC. Per tant, es va investigar l'acumulació intracel·lular tant d'apixaban com de rivaroxaban a les cèl·lules Caco-2 en presència de concentracions creixents de nilotinib per comparar-les amb els models cel·lulars. Curiosament, com s'ha observat amb el model RPTEC/TERT1, el valor IC50 de rivaroxaban (4,16 µM) va ser inferior a l'obtingut per a apixaban (9,35 µM). També és interessant observar que els valors d'IC50 observats a les cèl·lules Caco-2 eren superiors als obtinguts a les cèl·lules RPTEC/TERT1 per al mateix inhibidor. La rellevància clínica dels DDI es pot predir a partir de dades in vitro. Segons les directrius de la FDA, es van calcular les proporcions [I1]/IC50 per a cada combinació de fàrmacs. Aquesta relació permet comparar les concentracions in vivo amb les que se sap que produeixen un efecte rellevant in vitro. Per a l'apixaban a les cèl·lules RPTEC/TERT1, les proporcions van ser de 3,1, 0,06 i 17,4 amb nilotinib, crizotinib i ketoconazol, respectivament (taula 1). A les cèl·lules Caco-2, la relació [I1]/IC50 va ser de 0,46 per a la interacció entre apixaban i nilotinib (taula 1). Per a rivaroxaban, les proporcions van ser lleugerament superiors a les obtingudes per a apixaban a les cèl·lules RPTEC/TERT1: 5,1, 0,08 i 17,7, respectivament, per a nilotinib, crizotinib i ketoconazol (taula 2). De la mateixa manera, la relació [I1]/IC50 observada per a la interacció entre rivaroxaban i nilotinib a les cèl·lules Caco-2 va ser d'1,03, que va ser superior a la obtinguda per a apixaban (taula 2).

Discussió

Nombrosos estudis realitzats en les últimes dècades han informat d'un paper notable de la P-gp en la farmacocinètica dels fàrmacs [17–19]. Tenint en compte l'interès regulador creixent en les interaccions farmacològiques mediades per P-gp, els assajos in vitro per investigar el potencial inhibidor dels fàrmacs són un aspecte important del desenvolupament de fàrmacs i de la pràctica clínica. Amb aquesta finalitat, s'han realitzat molts assajos in vitro i la majoria de les dades associades sobre l'absorció intestinal prevista s'han generat a partir de les línies cel·lulars Caco-2 i MDCK-MDR1 [20–22]. Tanmateix, hi ha poques dades disponibles sobre la secreció tubular activa de fàrmacs, que també té un paper clau en la disposició dels fàrmacs i depèn de la presència de transportadors ABC. Aquesta observació està clarament lligada a la manca de caracteritzaciórenallínies cel·lulars per predir fàrmacsrenalefux. Aquest objectiu requereix un in vitrorenalmodel que imita de prop la barrera fisiològica. La línia cel·lular humana RPTEC/TERT1, que expressa diversos transportadors ABC (especialment P-gp), sembla ser una bona alternativa, com es va demostrar en un estudi anterior [16]. En aquest context, el present treball va investigar l'aplicació del model RPTEC/TERT1 per avaluar el potencial inhibidor de la P-gp. Segons el que sabem, aquest treball és el primer que proporciona dades d'estudis d'inhibició de P-gp utilitzant humans.renalcèl · lules.

Els assajos in vitro per determinar el potencial inhibidor de la P-gp es basen habitualment en l'ús d'un substrat de referència de P-gp específic, com ara la digoxina o la rodamina 123 [23–25]. A causa de la seva facilitat d'ús, les sondes fluorescents són avantatjoses per a assaigs d'alt rendiment. A més, la rodamina 123 s'ha aplicat àmpliament a la detecció de l'activitat de P-gp en una àmplia gamma d'estudis [26–28]. D'aquesta manera, en aquest estudi es van realitzar assajos d'acumulació de rodamina 123 a cèl·lules RPTEC/TERT1 per identificar els perfils d'inhibició de 14 fàrmacs. Entre aquests fàrmacs, es van escollir la ciclosporina A, el ketoconazol i el verapamil com a inhibidors potents de P-gp. Aquests inhibidors s'han caracteritzat àmpliament pel seu important potencial inhibidor de P-gp, que condueix a la modulació tant del transport de digoxina com de rodamina 123 [27, 29, 30]. Com era d'esperar, aquests fàrmacs van provocar les retencions de rodamina 123 més altes a les cèl·lules RPTEC/TERT1. En canvi, no es va observar cap augment de la retenció de R123 amb la warfarina, que es va utilitzar com a control negatiu, confirmant la fiabilitat del model RPTEC/TERT1. Curiosament, entre tots els fàrmacs provats, els DOAC, inclosos el dabigatran etexilat, l'apixaban i el rivaroxaban, van provocar diferents augments en la retenció de R123, tot i que anteriorment no es caracteritzaven com a inhibidors, només els substrats de P-gp [31, 32]. Aquesta observació pot ser deguda a l'existència de l'anomenada inhibició "competitiva", on els fàrmacs poden interactuar amb els mateixos llocs d'unió a P-gp. Els llocs més ben caracteritzats per a P-gp són el lloc H (per unir Hoechst 33342) i el lloc R (per unir la rodamina 123). Tanmateix, molts altres llocs d'unió a fàrmacs desconeguts podrien tenir un paper en aquestes interaccions, cosa que podria explicar els diferents efectes dels DOAC sobre l'acumulació de R123 [33, 34]. Per tant, la inhibició de P-gp observada per a un determinat fàrmac depèn del substrat utilitzat durant els estudis in vitro [28, 35]. Per tant, s'ha de considerar l'ús de diferents substrats de P-gp que interactuen amb diferents llocs d'unió a fàrmacs per descriure amb precisió les putatives potències inhibidores de la P-gp dels fàrmacs. També és interessant assenyalar que també es van realitzar diverses condicions del cribratge de la rodamina 123 en cèl·lules Caco-2 per comparar les cèl·lules RPTEC/TERT1 amb un model de referència en estudis de transport de fàrmacs. Com era d'esperar, la ciclosporina A, el verapamil i el nilotinib van provocar els augments més alts de la retenció de rodamina. Es van observar els mateixos perfils d'inhibició tant amb cèl·lules Caco-2 com RPTEC/TERT1. Tanmateix, els augments de la retenció de rodamina 123 generats per les interaccions en el model Caco-2 van ser més grans que els observats a les cèl·lules RPTEC/TERT1, cosa que suggereix una diferència potencial en l'expressió de la glicoproteïna P entre els models. Per tant, en el present estudi, es va utilitzar un segon mètode per avaluar i confirmar la possible inhibició de la P-gp per fàrmacs.

CISTANCHE MILLORARÀ LA DIÀLISI RENAL/RENAL

A partir de l'assaig d'acumulació de rodamina 123, es van escollir quatre fàrmacs per determinar els seus efectes dependents de la concentració sobre l'acumulació intracel·lular d'apixaban i rivaroxaban. S'ha demostrat que la P-gp té un paper principal en l'efux d'apixaban i rivaroxaban [32, 36]. Per tant, es van avaluar els valors IC50 de nilotinib, crizotinib i ketoconazol, amb els DOAC seleccionats com a fàrmacs "víctimes". Segons el que sabem, aquest estudi és el primer que realitza estudis d'acumulació intracel·lular amb DOAC en humans.renalcèl · lules. Els valors d'IC50 obtinguts per a nilotinib i crizotinib estaven d'acord amb els seus perfils d'inhibició obtinguts a partir de l'assaig d'acumulació de rodamina 123. Nilotinib, que va provocar un fort augment de la retenció de R123, va presentar el valor IC50 més baix per als dos DOAC, confirmant el seu alt potencial d'inhibició. Aquest resultat també està d'acord amb un estudi anterior que va mostrar un augment depenent de la concentració de l'acumulació intracel·lular de [3H]-paclitaxel a les cèl·lules transfectades MDR1-, cosa que suggereix que té un perfil inhibidor [37]. Per al crizotinib, l'assaig R123 va mostrar un potencial inhibidor moderat, amb menys augment de la retenció de R123 que el causat per nilotinib. Aquesta observació està recolzada per un estudi anterior on el crizotinib va ​​augmentar l'acumulació intracel·lular de R123 i doxorubicina a les cèl·lules transfectades MDR1-[38]. Aquest resultat també està d'acord amb els valors d'IC50 determinats amb els DOAC, que eren superiors als valors corresponents de nilotinib, confirmant el seu perfil d'inhibició moderat. Tanmateix, és interessant assenyalar que una concentració de 10 µM de nilotinib o crizotinib no va provocar els mateixos augments en la retenció de rodamina 123 i DOAC. En el cribratge de rodamina, el nilotinib va ​​augmentar la retenció del substrat al voltant d'un 71 per cent, mentre que era d'un 40 per cent per als DOAC. En canvi, el crizotinib va ​​provocar un petit augment en la retenció de rodamina (23 per cent), però augments més grans en la retenció de DOAC (al voltant del 50 per cent) a la mateixa concentració. Com s'ha comentat anteriorment, aquesta observació es podria explicar per diferències en els llocs d'unió a P-gp. Se sap que molts fàrmacs interaccionen i competeixen amb el lloc d'unió H en lloc del lloc d'unió R (que és on s'uneix la rodamina 123), i viceversa [39]. Curiosament, el ketoconazol, que se sap que és un fort inhibidor de P-gp, va provocar un augment lleugerament menor de la retenció de rodamina 123 que el nilotinib (66 per cent enfront del 71 per cent, respectivament). No obstant això, es va observar un valor similar amb les cèl·lules Caco-2, on la presència de ketoconazol va provocar un augment del 60 per cent en l'acumulació de R123 [40]. L'acumulació intracel·lular de DOAC per determinar els valors d'IC50 també va mostrar valors més alts en comparació amb nilotinib i crizotinib. Curiosament, la majoria dels valors IC50 trobats als models LLC-PK1 o Caco-2 que utilitzaven digoxina com a substrat de P-gp estaven entre 3 i 4 µM per al ketoconazol [41, 42]. Aquests valors són força diferents dels trobats en el present estudi (16,5 µM i 16,9 µM amb apixaban i rivaroxaban, respectivament). Aquesta observació confirma que les eleccions del substrat i el model utilitzat són influències crucials a l'hora de determinar el potencial inhibidor de la P-gp. A més, un estudi recent va informar que els nivells d'expressió dels transportadors ABC en models cel·lulars in vitro tenen un impacte en els assajos de transport de fàrmacs i, per tant, en l'avaluació dels DDI relacionats amb P-gp [43]. De fet, la determinació dels valors IC50 per al verapamil utilitzant rivaroxaban com a substrat P-gp va revelar una heterogeneïtat entre els models de cèl·lules MDCKMDR1 i Caco-2, amb valors IC50 de 6, 94 µM i 21, 2 µM, respectivament [43]. A més, en aquest estudi també es va investigar l'efecte depenent de la concentració del nilotinib sobre l'acumulació intracel·lular d'apixaban i rivaroxaban a les cèl·lules Caco-2. Curiosament, els valors d'IC50 per a nilotinib eren significativament més alts a les cèl·lules Caco-2 que a les cèl·lules RPTEC/TERT1. Aquesta observació es pot explicar per la diferència en l'expressió P-gp entre aquests models. A més, se sap que la distribució de P-gp depèn del teixit considerat. Fallon et al. va demostrar que el nivell de P-gp era més alt enronyóque en el teixit hepàtic en humans [45]. D'altra banda, el nivell d'expressió de P-gp sembla ser més alt a l'intestí que a l'intestíronyóteixit [46]. Per tant, l'ús de cèl·lules humanes com el model RPTEC/TERT1, que no sobreexpressen transportadors, podria proporcionar dades addicionals. Aquestes dades es podrien utilitzar i imputar en el modelatge farmacocinètic de base fisiològica (PBPK) integrant diversos paràmetres, com ara la quantitat de P-gp en un teixit o model in vitro o valors IC50.

Tot i que els valors IC50 trobats per al ketoconazol al model RPTEC/TERT1 eren més alts que els observats a la literatura, la relació [I1]/IC50, validada com a predictor de potencials DDI clínicament rellevants per a fàrmacs administrats per via oral, va mostrar valors alts que estaven per sobre del llindar de 0,1 definit per la FDA. Aquest resultat està d'acord amb un estudi clínic que va mostrar un augment del doble de l'exposició a apixaban amb la coadministració de ketoconazol [44]. En conjunt, tots aquests resultats demostren que el model RPTEC/TERT1 és una eina prometedora per avaluar el potencial inhibidor de P-gp.

CISTANCHE MILLORARÀ EL DOLOR RENAL/RENAL

Conclusió

El nostre estudi va demostrar que l'aplicació del model RPTEC/TERT1 és convenient per avaluar els potencials inhibidors de P-gp de diverses classes de fàrmacs. Els assajos d'acumulació de rodamina 123 van permetre realitzar un cribratge inicial de fàrmacs. Tanmateix, també s'han d'investigar els potencials inhibidors de P-gp dels fàrmacs que no interaccionen amb el lloc R de P-gp utilitzant substrats addicionals per confirmar les prediccions. Els valors d'IC50 determinats a partir de l'acumulació intracel·lular d'apixaban i rivaroxaban estan d'acord amb els perfils d'inhibició observats amb la rodamina 123. A més, l'ús de ketoconazol i warfarina com a inhibidor fort i no inhibidor de P-gp, respectivament, va confirmar la fiabilitat del model RPTEC/TER1 quan s'utilitza per obtenir dades in vitro sobre els potencials inhibidors dels fàrmacs cap a la P-gp. Finalment, la comparació dels resultats obtinguts mitjançant el model RPTEC/TERT1 amb els obtinguts amb cèl·lules Caco-2 va posar de manifest la importància de realitzar estudis in vitro en diferents models cel·lulars per confirmar el perfil inhibitori d'un determinat fàrmac.