Inhibició de l'agregació beta amiloide i deposició d'extracte aquós de Cistanche Tubulosa

1. Introducció

La demència és una de les malalties cròniques de l'envelliment més freqüents. El 2015, l'Informe Mundial d'Alzheimer estimava que uns 46,8 milions de persones patien demència, i s'espera que el nombre sigui de 74,7 milions el 2030 i de 131,5 milions el 2050. La població mundial de demència augmentarà any rere any i quedarà fora de control en el futur. . Les despeses sanitàries mundials per tractar la demència van ser de gairebé 604.000 milions de dòlars EUA el 2010 i s'espera que la quantitat sigui de 1.000.000 milions el 2030. Els pacients amb demència tenen un major risc de mort accidental i, per tant, necessiten més atenció mèdica. Aquesta és una gran càrrega per als cuidadors familiars dels pacients amb demència. L'impacte de la demència en els cuidadors, la família i la societat pot produir un gran estrès físic, psicològic, vital i econòmic. Hi ha dues formes principals de demència, la malaltia d'Alzheimer (MA) i la demència vascular. La MA és la demència més freqüent i és un trastorn neurodegeneratiu irreversible i progressiu. L'AD va ser la sisena causa de mort als Estats Units el 2015.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER PREVENIR AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Estudis recents donen suport que la toxicitat neuronal induïda per l'agregació del pèptid amiloide (A) (plaques) i la proteïna tau (embolics) està estretament relacionada amb la patogènesi de l'AD. L'acumulació d'A i proteïna tau al cervell pot provocar danys neuronals i pèrdua de memòria. Els oligòmers A insolubles s'agreguen a les plaques extracel·lulars i es va informar que condueixen a una disfunció sinàptica, toxicitat neuronal i mort cel·lular. Malauradament, fins ara no hi ha cap tractament efectiu disponible per netejar A i la proteïna tau, inhibir la formació o l'oligomerització d'A i suspendre o curar el dany neuronal irreversible. Els agents terapèutics actuals, com la galantamina i el donepezil, que són inhibidors de l'acetilcolinesterasa, només poden millorar temporalment la pèrdua de memòria augmentant el nivell de neurotransmissors. El 2012, cap fàrmac candidat va poder reduir l'efecte A en grans estudis clínics de pacients amb AD. Per tant, es necessita urgentment la recerca d'un nou tractament per suprimir la prevalença de la malaltia d'Alzheimer. Els ions metàl·lics es van considerar recentment un factor clau estretament relacionat amb l'agregació A. Els quelants metàl·lics considerats com a compostos potencials de plom proporcionen una estratègia completament nova per a l'enfocament anti-AD.

La tija seca de Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, és àmpliament collit al desert de Xhinjang, a la Xina. És una important medicina tradicional xinesa que pertany a la medicina tònica xinesa indexada a la Farmacopea de la Xina i utilitzada durant milers d'anys per al tractament de la debilitat física, la deficiència renal, la infertilitat, l'oblit, la impotència i el restrenyiment senil.extracte aquós de C. tubulosa (CTE)Les càpsules han estat aprovades com a fàrmac botànic per a la demència vascular a la Xina. Segons un assaig clínic de 18 pacients diagnosticats d'AD lleu a moderada, les càpsules CTE van donar als pacients una condició de memòria més estable en comparació amb els inhibidors de l'acetilcolinesterasa. En el nostre estudi anterior, el CTE va reduir la deposició de pèptid amiloide (A) i va millorar la pèrdua de memòria en rates semblants a la malaltia d'Alzheimer. Els glucòsids feniletanoides, l'equinacòsid (1), l'acteòsid (2) i l'isoacteòsid (3) es consideren els components principals del CTE. El compost 1 té activitat neuroprotectora contra la toxicitat de 1-metil-4-fenil{-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), 1-metil{{13 }}Ió fenilpiridini (MPP+) i 6-Hidroxidopamina ({6-OHDA). El nostre informe anterior va demostrar que 1 va suprimir l'oligomerització i la toxicitat d'A en un estudi in vitro i va inhibir la deposició d'A, va millorar la memòria deteriorada i la disfunció cognitiva en rates induïdes per A. Els compostos 2 i 3 van augmentar la degradació d'A i van disminuir l'oligomerització d'A in vitro. El compost 3 va disminuir la deposició d'A en rates induïdes per A. A partir d'aquests estudis, C. tubulosa ja ha demostrat que té el potencial per tractar la MA. CTE està estretament relacionat amb l'agregació i la deposició anti-A. Per entendre millor el mecanisme CTE, hem de disposar d'un mètode convenient i eficaç per identificar el component actiu, així com el contingut de les mostres de teixit cerebral. La majoria dels estudis es van dissenyar per a la determinació quantitativa deequinacòsid, acteòsid i isoacteòsid en herbeso aliments per cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC), però només dos estudis van ser per a la determinació en sèrum o teixits. Tanmateix, no hi ha cap informe sobre l'anàlisi simultània d'1-3 en teixits cerebrals després de l'administració oral de CTE. A més, encara no està clar dels estudis recents si els components actius del CTE o els seus metabòlits van passar amb èxit a través de la barrera hematoencefàlica i van actuar sobre les neurones cerebrals. Per tant, aquesta investigació proporciona un mètode avançat i sensible amb evidència convincent que il·lustra clarament el mecanisme subjacent de CTE contra l'agregació i la deposició d'A.

2. Resultats

2.1. Aïllament i identificació de tres compostos principals (1–3)

Les tiges seques de C. tubulosa es van extreure amb EtOH al 75% a temperatura ambient. L'extracte condensat d'EtOH al 75% es va sotmetre a cromatografia de resina i columna C18 per proporcionar tres compostos principals, echinacòsid (1),acteòsid (2) i isoacteòsid(3). Les seves estructures es van dilucidar mitjançant l'anàlisi de l'espectroscòpia de RMN (Ressonància Magnètica Nuclear) i ESI-MS (massa d'ionització d'Electrospray) i per comparació amb dades de la literatura (Figura 1, Figures de materials suplementaris S3-S11).

2.2. L'assaig de contingut de glicòsids feniletanoides (1-3) de CTE

El mètode d'assaig es va validar per a l'anàlisi de glicòsids feniletanoides. Els compostos 1-3 (5.0 mg) es van pesar amb precisió i es van barrejar amb un 50% de metanol (40 ml). Les mescles es van sonicar durant 5 min. Es van barrejar tres dissolucions estàndard de glicòsids feniletanoides (1-3) com a solució estàndard (100 ug/mL). La solució d'estoc estàndard es va utilitzar per preparar cinc concentracions diferents (5, 10, 25, 50 i 100 ug/mL) de les solucions indicades, respectivament, mitjançant la dilució amb volums en sèrie de metanol al 50%. Les corbes de glicòsids de feniletanoides (1-3) es van establir mitjançant cromatografia líquida d'ultra rendiment (UPLC) de 5-100 ug/ml i eren lineals respectivament (1, r2= 0,9999; 2, r{{25} },9999; 3, r2= 0,9998). La precisió intradia i interdia [% RSD (desviació estàndard relativa) va ser del 0,1 al 1,8%] i la precisió (95,6-104,2%) van ser acceptables per UPLC durant 1-3. UPLC va quantificar els continguts 1, 2 i 3 de CTE en 254, 38 i 41 mg / g, respectivament (figura S2).

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER AL TRACTAMENT DE PACIENTS AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. Validació UPLC/MS/MS

Els glicòsids feniletanoides (1-3) es van barrejar i es van afegir amb homogeneïtat de teixit cerebral de rata i es van analitzar mitjançant un espectròmetre de masses en tàndem de cromatografia líquida d'ultra rendiment (UPLC/MS/MS) amb extracció en fase sòlida. El límit inferior de detecció (LLOQ) d'1-3 va ser de 0,2 ng/mL. La recuperació de glicòsids feniletanoides va augmentar amb homogeneïtat de teixit cerebral (10 ng/mL) al 91,39% per a 1, 89,54% per a 2 i 96,81% per a 3, respectivament (figura 2).

2.4. Anàlisi de teixits cerebrals de rata similars a l'AD

Després de 14 dies d'administració oral de CTE (200 mg/kg/dia), es van recollir teixits cerebrals de rata similars a l'AD i es van dividir en dues parts, hipocamp i estriat, i tots dos es van homogeneïtzar. Com que els homogeneïtats d'hipocamp i estriat de cada rata eren massa escassos per carregar-los en l'extracció en fase sòlida i per evitar errors experimentals excessius, els homogeneïtats d'hipocamp i estriat de quatre rates individuals es van barrejar en una mostra analitzada per a UPLC/MS/MS utilitzant el sòlid. mètode d'extracció de fase (figura 3A, B). Els glicòsids feniletanoides (1-3) es van observar a l'hipocamp (figura 3A) i l'estriat (figura 3B). No hi va haver cap pic significatiu en els teixits cerebrals en blanc (figura 3C). A l'hipocamp, el contingut d'echinacòsids era d'11,97 ± 0,34 ng/mL, el contingut d'acteòsids era d'1,25 ± 0,16 ng/mL i el contingut d'isoacteòsids era d'1,38 ± 0,08 ng /mL. A l'estriat, el contingut d'echinacòsid era de 22,60 ± 1,69 ng/mL, el contingut d'acteòsids era de 2,03 ± 0,61 ng/mL i el contingut d'isoacteòsids era de 4,90 ± 0,64 ng/mL. Com es mostra a la figura 4, el CTE passaria a través de la barrera hematoencefàlica segons les quantitats detectables significatives d'1-3 a l'hipocamp i l'estriat. El contingut d'1 és molt superior a 2 i 3 en CTE per anàlisi UPLC (figura S2). Per tant, és raonable observar que 1 és el més alt en teixit cerebral després de l'administració oral de CTE.

2.5. Els glicòsids feniletanoides (1-3) Activitat quelant dels metalls

A la literatura, la determinació dels compostos lliures i del seu complex metàl·lic es va realitzar mitjançant HPLC. La mesura de l'activitat de quelació va ser analitzada per UPLC en aquest estudi. Les solucions de 50 µg/mL de cadascun dels glucòsids feniletanoides (1-3) es van afegir a una solució de 10 µg/mL de coure (Cu), calci (Ca), magnesi (Mg), zinc (Zn), ferro (Fe). ) o sèrum de rata respectivament. Cada compost amb cada solució metàl·lica o sèrum es va analitzar per UPLC. Els glicòsids feniletanoides (1-3) van mostrar activitat quelant metàl·lica amb ferro i sèrum (figura 5, materials suplementaris, figura S1).

2.6. Anàlisi d'echinacòsid (1) en sèrum de rata in vivo

Per entendre la distribució de l'echinacòsid al sèrum de rata, el sèrum es va recollir des del moment inicial fins als 720 min després de l'administració oral d'echinacòsid (1) (100 mg/kg) i es va analitzar per UPLC. La figura 6 mostra els perfils de concentració en funció del temps d'echinacòsid al sèrum de rata.

3. Discussió

La demència, especialment l'AD, és un envelliment irreversible i una malaltia crònica que condueix a un nus gordià de preguntes. Aquesta malaltia insuperable comporta greus problemes econòmics amb una càrrega financera enorme i creixent. A tot el món, els investigadors d'AD han fet molts esforços per investigarnous fàrmacs anti-ADperò va fracassar en diversos assaigs clínics grans dirigits a A l'any 2012. Excepte per dirigir-se directament a A , l'homeòstasi dels ions metàl·lics al cervell es considera la raó clau relacionada amb l'agregació i la deposició d'A que condueix a la formació d'AD. Per tant, els ions metàl·lics tenen un paper essencial en la patogènesi de l'AD, i la hipòtesi de la quelació metàl·lica s'ha convertit en una direcció de recerca important.

Segons els nostres estudis anteriors,El CTE va mostrar una activitat potencial contra la demència. Fins i tot en estudis clínics en humans, després d'1 any de tractament amb càpsules CTE per a pacients amb AD moderada, la puntuació de la subescala cognitiva de l'escala d'avaluació de la malaltia d'Alzheimer (ADAS-cog) no mostraria un deteriorament significatiu en comparació amb abans del tractament. CTE va mantenir estable la puntuació ADAS-cog dels pacients amb AD, però altres medicaments amb recepta no ho van fer. L'única opció de medicaments amb recepta autoritzadaTractament de la ADsón inhibidors de l'acetilcolinesterasa (AChEI) com el donepezil i la galantamina que milloren els símptomes de la MA a curt termini, però el deteriorament es produeix després d'1 any de tractament. Basat en estudis clínics, la CTE té l'oportunitat de ser un tractament potencial per al desenvolupament d'agents anti-AD. D'acord amb els nostres informes anteriors, l'echinacòsid (1), l'acteòsid (2) i l'isoacteòsid (3) protegirien les neurones del dany per A, disminuirien l'oligomerització d'A in vitro i millorarien significativament la disfunció cognitiva induïda per A in vivo. L'estudi in vitro va indicar que les dosis actives d'1-3 eren de fins a 5{{10}} µg/mL. Tanmateix, estudis anteriors consideraven que la biodisponibilitat oral d'1 i 2 era molt baixa (0,83% per a 1 i 0,12% per a 2) en rates. El compost 1 ni tan sols es va poder identificar en sèrum humà després de l'administració oral de pastilles d'equinàcia. Els estudis actuals mostren que 1-3 tenien una mala permeabilitat i absorció de la membrana a les cèl·lules intestinals i la majoria de l'1 es metabolitzarien als conductes gastrointestinals. El contingut del compost 2 en sèrum de rata només era d'uns 4,5 µg/ml després de 15 min d'injecció intravenosa amb una dosi de 10 mg/kg d'acteòsid. Tanmateix, aquest estudi mostra que es detectarien 1-3 a l'hipocamp i l'estriat dels teixits cerebrals de rata després de l'administració oral de CTE (figures 3 i 4). A més, la figura 6 va mostrar que el contingut del compost 1 en sèrum de rata va augmentar unes 5 vegades de 15 min a 720 min després de l'administració oral del compost 1 (100 mg/kg). Vam considerar que els glicòsids feniletanoides de CTE passarien a través de la barrera hematoencefàlica i hi hauria acció de quelació entre CTE i el metall. La quelació és una reacció química reversible. El ferro és un element essencial en el sèrum i el cervell [10,40]. La figura 5 mostra que tres glicòsids feniletanoides tindrien activitat quelant metàl·lica amb ferro i sèrum. El ferro i el sèrum canvien l'àrea del temps màxim de retenció de tres glucòsids feniletanoides. La quelació del ferro pot ser la raó crucial que condueix a la identificació errònia de la molt baixa biodisponibilitat dels glucòsids feniletanoides. Per tant, l'activitat quelant dels metalls s'ha de considerar en l'anàlisi del sèrum sanguini i del cervell dels tres glucòsids feniletanoides CTE per recuperar la biodisponibilitat i la farmacocinètica reals. A més, els resultats van indicar que tres glicòsids feniletanoides (1-3) passarien a través de la barrera hematoencefàlica i arribarien als teixits cerebrals mitjançant la circulació corporal. Aquest estudi va desenvolupar un mètode més ràpid i sensible per a l'anàlisi 1-3 mitjançant UPLC/MS/MS i va proporcionar proves poderoses per demostrar que els glicòsids feniletanoides (1-3) són els principals constituents bioactius del CTE.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER PREVENIR L'ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Materials i Mètodes

4.1. Material vegetal

Les tiges de C. tubulosa es van recollir el maig de 2016 a Hangzhou, Xina. La planta va ser identificada pels exemplars del Dr. Lin HC Voucher (núm. 20016CT) que s'han dipositat a Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Xina.

4.2. Aïllament i purificació

La tija de C. tubulosa seca es va triturar en pols i després es va extreure cinc vegades amb EtOH al 75%. Després de l'evaporació del dissolvent a pressió reduïda, l'extracte brut es va sotmetre a cromatografia en columna de resina macroporosa AB-8 amb sistemes de dissolvents de gradient H2O/EtOH des del 20% d'EtOH fins al 100% d'EtOH. Segons la cromatografia en capa fina, es van recollir quatre fraccions (Fr.1 ~ Fr.4) per a una posterior separació. Fr. 2 es va sotmetre a cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) preparativa en una columna COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm × 20 mm id, 5 µm) utilitzant un 18% d'acetonitril com a sistema de fase mòbil. El cabal era de 15 ml/min. Es van recollir de manera selectiva tres grans pics d'interès. Les fraccions que contenien els compostos objectiu es van condensar encara més a sequedat i es van produir 1, 2 i 3, respectivament.

4.3. Anàlisi experimental

Els espectres de RMN 1H i 13C es van obtenir mitjançant espectròmetres Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, EUA) amb tetrametilsilà (TMS) com a estàndard intern. La HPLC preparativa es va realitzar mitjançant una columna de fase inversa (columna Cosmosil C18-AR-II, 250 mm × 20 mm id; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japó) en una sèrie Shimadzu LC-6AD aparell amb detectors Prominence HPLC UV-Vis (Kyoto, Japó).

Echinacòsid (1): pols blanca; ESI−MS m/z: 785 [M − H]−; 1H RMN (CD3OD, 500 MHz): δ 1.07 (1H, d, J {= 6,2 Hz, Rha-H{-6), 2,79 ( 2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha{-8), 3,79 (1H, m, H{-30), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H{-1), 4,38 (1H, d, J {{4{{ {80}}}},9 Hz, H-10), 5,{{100}}0 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40), 5,17 (1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H{-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8,1,2,0 Hz, H{-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H{-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H-500), 6,94 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H{-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H-200), δ 7,59 (1H, d, J {= 15,9 Hz, H{-700); 13C-RMN (CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C{-7), 62,6 (Glc-C{-6), 69,4 (C{{{{ 125}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C{-5), 71,5 (Glc-C{-4), 72,0 (Rha-C{-3) , 72,3 (C{-8), 72,4 (Rha-C{-2), 73,8 (Rha-C{-4), 74,7 (C{-50 ), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C{-20), 77,8 (Glc-C{-5), 77,9 (Glc-C{-3), 81,7 (C{-30) , 103,1 (Rha-C{-1), 104,2 (C{-10), 104,7 (Glc-C{-1), 114,7 (C{-200), 115,3 (C{{-1 189}} ), 116,3 (C{-500), 116,5 (C{-2), 117,1 (C{-5), 121,3 (C{-6), 123,3 (C{{-5 204}} ), 127,6 (C{-100), 131,5 (C{-1), 144,7 (C{-3), 146,1 (C{-4), 146,9 (C{{-3 219}} ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C{-300 ), 168,5 (C{-900 ) (figura S3–S5).

Acteòsid (2): pols blanca; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0,94 (3H, d, J =5,9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{-100 ), 4,70 (1H, t , J=9.{{{160}} Hz, H-400 ), 5.{{2{09}}1 (1H, s, H{{ 31}}), 6,18 (1H, d, J=15,9 Hz, H{-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J=7,1 Hz, H{-5), 6,73 (1H, d, J {= 2,0 Hz, H{{57} }), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz, H{-50 ), 6,97 (1H, d, J {= 8,1 Hz, H{-60 ) , 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H, d, J=15,8 Hz, H{-70); 13C RMN: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18,2 (C-6000), 35,1 (C{-7), 60,8 (C{-600), 68,8 (C{{{95}) } ), 69,2 (C{-400), 70,3 (C{-3000), 70,3 (C{-8), 70,4 (C{-2000), 70,6 (C{{{110} }), 71,7 (C{-500), 74,5 (C{-200), 79,2 (C{-300), 101,3 (C{-1000), 102,3 (C{{125} } ), 113,6 (C{-80), 114,7 (C{-20), 115,5 (C{-5), 115,8 (C{-50), 116,3 (C{{140} }), 119,6 (C{-6), 121,5 (C{-60), 125,6 (C{-10), 129,2 (C{-1), 143,6 (C{{{155} }), 145,0 (C{-3), 145,0 (C{-30), 145,6 (C{-70), 148,5 (C{-40), 165,7 (C{{{170} } ) (figures S6–S8). Isoacteòsid (3): pols blanca; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H RMN (DMSO-d6, 500 MHz): δ 1,07 (3H, d, J=6,1 Hz, H{-6000), 2,65 (2H, m, H{-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H{-100 ), 5,10 (1H, s, H{-1000 ), 6,27 (1H, d, J=15 ,9 Hz, H-80 ), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{-6), 6,58 (1H, d, J=8 ,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H{-2), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H{-60), 7,04 (1H, s, H{-20), 7,46 ( 1H, d, J=15.8 Hz, H{-70); 13C RMN (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17,9 (C-6000), 35,2 (C{-7), 63,5 (C{-600), 68,2 (C{-5000 ), 70,4 (C{-400), 70,6 (C{-3000), 71,7 (C{-8), 72,1 (C{-2000), 73,7 (C{-4000 ), 74,1 (C{-500), 74,5 (C{-200), 80,9 (C{-300), 100,7 (C{-1000), 102,7 (C{-100 ), 113,9 (C{-20), 114,9 (C{-80), 115,5 (C{-5), 115,8 (C{-50), 116,3 (C{-2 ), 119,6 (C{-6), 121,5 (C{-60), 125,5 (C{-10), 129,2 (C{-1), 143,5 (C{-4 ), 145,0 (C{-3), 145,3 (C{-30), 145,6 (C{-70), 148,5 (C{-40), 165,6 (C{-90 ) (Figures S9–S11).

4.4. Preparació d'extracte aquós de C. Tubulosa (CTE)

La pols de la tija de C. tubulosa es va extreure dues vegades a reflux amb aigua durant 1,5 h i es va filtrar la solució d'extracte. L'extracte aquós filtrat (CTE) es va emmagatzemar a 4 ◦ C abans del seu ús.

4.5. Model animal i programa experimental

El model de rata semblant a l'AD i el calendari experimental utilitzats en aquest estudi eren els prescrits en el nostre estudi anterior [19]. Després d'infusionar A 1–42 (300 pmol/dia) al ventricle cerebral durant almenys dues setmanes o més, les rates semblants a l'AD van rebre CTE (200 mg/mL) per administració oral l'endemà. Després de 14 dies d'administració, es van sacrificar rates per recollir els teixits cerebrals. Per evitar errors experimentals excessius, es van combinar mostres de quatre rates individuals en una mostra. Hi havia tres mostres per a cada grup.

4.6. Productes químics i reactius

El metanol (grau HPLC) es va comprar a Merck (Darmstadt, Alemanya). L'àcid fòrmic (98% per a anàlisi, ACS) es va comprar a Panreac (Barcelona, ​​Espanya). L'acetonitril (grau HPLC) es va comprar a JT Baker (Phillipsburg, NJ, EUA). L'aigua pura es va preparar mitjançant el sistema ELGA (Woodridge, Regne Unit). L'hesperidina es va comprar a Chromadex i es va utilitzar com a estàndard intern (IS) per a l'anàlisi UPLC.

4.7. Aparell UPLC/MS/MS

Per a l'anàlisi UPLC/MS/MS es va utilitzar el sistema Waters Acquity TQD de cromatografia líquida d'ultra-rendiment (UPLC)/MS/MS (Milford, MA, EUA). Els experiments cromatogràfics es van realitzar en una columna Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm, Waters) amb elució en gradient a un cabal de 0,4 ml/min. La fase mòbil estava formada per àcid fòrmic-aigua (1: 1000, v/v) (A) i àcid fòrmic-acetonitril (1: 1000, v/v) (B). El programa de temps era el següent: 0–5 min, A–B (92:8, v/v) canviat a A–B (62:38, v/v); 5–7 min, AB (62:38, v/v); 7-7,1 min, AB (62:38, v/v) canviat a A–B (92: 8, v/v); 7,1–9 min, (92: 8, v/v). El volum d'injecció era de 5 µL al sistema UPLC/MS/MS amb una font d'ions d'ionització electrospray negativa (ESI). Els cromatogrames d'ions totals (TIC) per a 1-3 es van realitzar mitjançant el mode de monitorització de reaccions múltiples (MRM). Els paràmetres de massa es van optimitzar per obtenir els senyals més clars i d'alta intensitat. La millor opció de paràmetres es va descriure com a tensió capil·lar de 3000 V, voltatge de con de 20 V, temperatura de font de 125 ◦C, temperatura de desolvació de 400 ◦C, flux de gas de con 50 L/h, flux de gas de desolvació de 900 L/h i col·lisió de 38 eV. energia. Les dades van ser processades pel programari MassLynx 4.1 (Milford, MA, EUA).

4.8. Preparació de la mostra

El teixit cerebral de rata va utilitzar 50% de metanol per a l'homogeneïtzació (1 g de teixit per 5 ml de metanol). L'homogeneïtat es va centrifugar a 10,000 rpm a 4 ◦C durant 10 min. El sobrenedant (50 µL) amb 10 µL IS (100 µg/mL) va afegir aigua pura a 1 mL. La mescla es va carregar amb cura al cartutx Oasis HLB (equilibri hidròfil-lipòfil) (Waters, Milford, MA, EUA), que ja s'havia eluït amb 1 ml de metanol i després s'havia equilibrat amb 1 ml d'aigua en condicions de buit. Després d'utilitzar 1 mL de metanol al 10% per rentar el cartutx, es va utilitzar 1 mL de metanol per eluir per obtenir la mostra analitzada que es va transferir a un altre tub Eppendorf d'1,5 mL amb 10 µL de solució d'àcid ascòrbic a l'1% i es va assecar per evaporació. Finalment, el residu de la mostra analitzada es va dissoldre en 200 µL de metanol al 50% per a l'anàlisi.

4.9. Preparació de la corba estàndard de calibració

Els compostos 1-3 es van utilitzar per preparar estàndards de calibratge afegits respectivament a l'homogeneïtat de teixit cerebral i l'hesperidina com a estàndard intern per obtenir les concentracions finals dels estàndards de calibratge que eren 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50,0 i 100,0 ng/mL.

4.10. Validació

La corba estàndard de calibració es va obtenir mitjançant la prova de linealitat utilitzant cinc concentracions diferents d'1 a 3, en els intervals 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 i 100,0 ng/mL, respectivament, i es va considerar lineal amb un coeficient de determinació superior a 0,99 (R quadrat). El límit inferior de detecció (LLOQ), definit com ± 20% de la concentració d'una mostra de prova, va produir un pic de senyal en lloc de soroll. La credibilitat i la precisió del mètode d'anàlisi es van avaluar mitjançant una prova de recuperació a 10 ng/mL d'1-3.

4.11. Assaig d'activitat quelant metàl·lica

UPLC es va utilitzar per analitzar l'efecte quelant metàl·lic mitjançant la solució de 50 µg/mL de glicòsids feniletanoides CTE 1-3 que contenia 10 µg/mL d'una solució metàl·lica de coure, calci, magnesi, zinc, ferro o sèrum de rata. Cada compost amb cada solució metàl·lica o sèrum es va analitzar per UPLC. L'efecte quelant del metall canviaria el temps de retenció d'1 a 3 en cromatografia líquida. El percentatge d'efecte quelant dels metalls es va calcular com a continuació i les dades representaven la mitjana ± SD (n=3).

5. Conclusions

Aquest estudi va demostrar que 1-3 són els components actius de CTE per a l'activitat anti-AD. La quelació del ferro s'ha convertit en el nou concepte per dissenyar una nova generació de fàrmacs per al tractament de la MA.CTE és una medicina botànica potencial xinesa anti-ADdirigida a l'agregació i la deposició A induïda per la quelació del ferro. A més, vam demostrar més que 1-3 arribarien al cervell a través de la sang, la barrera hematoencefàlica (BBB). Els components actius i la confirmació del mecanisme subjacent del CTE ajudaran molt al control de qualitat i a la biodisponibilitat dels estudis de producte en el futur. Al mateix temps, el mètode d'anàlisi avançat i eficient que es presenta serà útil per determinar 1-3 en plantes, aliments, sang i teixits cerebrals per a la investigació farmacocinètica i d'empremtes digitals químiques.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER AL TRACTAMENT DE LA MALALTIA D'ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%