MiR-214 millora la lesió renal aguda induïda per la sèpsia mitjançant l'autofàgia regulada per PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
Resum. Estudis anteriors han suggerit que l'estrès oxidatiu i l'autofàgia són agutslesió renal (AKI) durant la sèpsia i el microARN (miR)-214 té un paper vital en la protecció deronyonssotmesos a estrès oxidatiu. El present estudi pretenia provar si la renoprotecció de miR-214 està relacionada amb l'autofàgia en la sèpsia. El paper de l'autofàgia es va investigar en un model de ratolí de lligadura i punció cecal (CLP). Es va utilitzar la reacció en cadena de la polimerasa quantitativa de transcripció inversa (RT-qPCR) per analitzar l'expressió de miR-214. L'estructura i funció deronyonses van avaluar els recollits dels ratolins.RonyóEls nivells d'autofàgia es van detectar amb immunohistoquímica, immunofluorescent i western blot. Es va trobar que miR-214 podria alleujar l'AKI en ratolins sèptics mitjançant la inhibició del nivell deronyóautofàgia. A més, el miR-214 va inhibir l'autofàgia silenciant l'expressió de PTEN alronyóteixits de ratolins sèptics. Aquestes troballes van indicar que miR-214 va millorar l'AKI induïda per CLP reduint l'estrès oxidatiu i inhibint l'autofàgia mitjançant la regulació de la via PTEN/AKT/mTOR.
Paraules clau:microRNA-214, sèpsia, lesió renal aguda, autofàgia, renal
Introducció Agutlesió renal(AKI) és una de les complicacions més comunes de la sèpsia i es produeix en el 40-50% dels pacients sèptics, amb una taxa de mortalitat de fins al 60% (1). Tanmateix, la patogènesi de l'AKI induïda per la sèpsia no està clara. S'ha informat que l'autofàgia té un paper clau en l'AKI induïda per la sèpsia i la inhibició de l'autofàgia dóna lloc al desenvolupament d'AKI durant la sèpsia (2, 3). Estudis anteriors (4,5) han confirmat que la sèpsia desencadena l'autofàgia en múltiples òrgans, inclòs elronyó(6) i els processos autofàgics estan implicats en l'eliminació de mitocondris danyats i l'estrès oxidatiu (7). Tanmateix, l'autofàgia excessiva pot causar mort cel·lular no desitjada i perjudicial (8). Per tant, un nivell moderat d'autofàgia és la clau per reduir l'AKI induïda per la sèpsia. Estudis anteriors han informat que miR-214 millora l'AKI induïda per isquèmia-reperfusió mitjançant la inhibició de l'apoptosi (9) i miR-214 suprimeix l'estrès oxidatiu en la nefropatia diabètica mitjançant la via de senyalització de les espècies reactives d'oxigen (ROS) / AKT / mTOR (10). El present estudi va trobar que miR-214 pot atenuar la disfunció miocàrdica induïda per la sèpsia en ratolins mitjançant la inhibició de l'autofàgia (11). Tanmateix, encara s'ha d'aclarir si miR-214 pot millorar l'AKI induïda per la sèpsia. En el present estudi, es va plantejar la hipòtesi que miR-214 atenua l'AKI induïda per CLP reduint l'estrès oxidatiu i inhibint l'autofàgia mitjançant la regulació de la via PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL
Materials i mètodes
Animals.En el present estudi es van utilitzar un total de 100 ratolins mascles Kunming (pes, 20,40 ± 2,92 g; edat, 6-8 setmanes) subministrats pel Medical Laboratory Animal Center de la Hebei Medical University (Shijiazhuang, Xina). Tots els ratolins es van aclimatar a un cicle de llum/foscor de 12 hores a 24 ˚C amb un 50 per cent d'humitat i se'ls va donar accés gratuït a menjar i aigua a una setmana superior o igual a 1 setmana abans dels experiments. Tots els procediments experimentals es van realitzar d'acord amb les directrius de l'Institut Nacional de Salut (publicació NIH núm. 85-23, revisada el 1996) i amb l'aprovació dels Comitès Institucionals de Cura i Ús dels Animals de l'Hospital Central de Cangzhou (aprovació núm. 2017-020-). 01). Totes les cirurgies es van realitzar sota anestèsia i es va fer tot el possible per minimitzar el patiment.
Lligadura i punció cecal (CLP).Es va realitzar CLP en ratolins per crear un model de sèpsia murina, tal com es va descriure anteriorment (12). Després de l'anestesia per inhalació d'isoflurà (induït al 3 per cent i mantingut al 0,5 per cent), es va tallar una incisió de la línia mitjana d'1 cm. El cec exposat (a 1 cm de distància de l'extrem) es va lligar amb dues puncions amb una agulla de calibre 23. El cec va extreure suaument una petita quantitat de femta i es va col·locar de nou a la seva posició anatòmica. La paret abdominal es va suturar en capes amb una trena de seda de 3 0. Després del procediment, es va injectar per via subcutània 1 ml de solució salina 0,9 per cent. Els ratolins només tenien accés gratuït a aigua. Els ratolins model simulats es van operar de la mateixa manera que el model CLP sense CLP.
Disseny experimental. Els ratolins (n=6 per a cirurgia simulada i CLP) es van assignar aleatòriament a set grups: grup simulat, grup CLP, adenovirus (Ad)-proteïna fluorescent verda (GFP) més grup CLP, grup Ad-miR-214 més grup CLP , grup anti-miR-214 més CLP, inhibidor de PTEN més grup CLP i Ad-miR-214 més inhibidor de PTEN més grup CLP. Els ratolins del grup Sham van ser exposats al mateix procediment però sense lligament i punció del cec. Els ratolins dels altres grups van rebre lligament i perforació cecal. Tots els ratolins van ser anestesiats ràpidament per inhalació d'isoflurà per recollir sang, orina ironyómostres 24 h després de l'últim tractament.
Ad-miR-214, anti-miR-214 o Ad-GFP mediat per adenovirustransferència de gens in vivo i injecció d'inhibidors de PTEN. Ad-miR-214, anti-miR-214 o Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) es va lliurar a la cavitat abdominal dels ratolins 4 dies abans del CLP. Breument, els ratolins van ser anestesiats per inhalació d'isoflurà. Es va administrar un catèter que contenia 200 µl d'adenovirus (2x1011 pfu, que expressava miR-214, anti-miR-214 o Ad-GFP) a ratolins normals mitjançant injecció intraperitoneal. L'inhibidor de PTEN (VO-OHpic, intraperitoneal, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) es va administrar a ratolins CLP que havien rebut anti-miR-214 mitjançant injecció intraperitoneal a una dosi única de 10 µg/kg 30 min abans de l'administració d'adenovirus. .
Avaluació de la funció renal. Es van recollir mostres de sang del cor de ratolins, seguida de centrifugació (a temperatura ambient durant 15 min a 3, 000 xg) per recollir sèrum. Els nivells sèrics de nitrogen ureic en sang (BUN) i creatinina sèrica (Cr) es van determinar mitjançant un analitzador automàtic Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). Es va utilitzar ELISA per analitzar els nivells delesió renalmolècula-1 (KIM-1; cat. núm. RKM100; R&D Systems, Inc.) i lipocalina associada a la gelatinasa de neutròfils (NGAL; cat. núm. DY3508; R&D Systems, Inc.) en mostres d'orina.
Assaig de la citocina d'inflamació sèrica.El sèrum TNF- (núm. cat. H052) i IL-6 (núm. cat. H007) es van examinar mitjançant kits ELISA comercials (Institut de Bioenginyeria de Nanjing Jiancheng) segons les instruccions del fabricant.Mesura de marcadors d'estrès oxidatiu. El kit d'assaig corresponent (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Xina) es va utilitzar per mesurar els nivells de malondialdehid (MDA) i provar l'activitat de la superòxid dismutasa (SOD) d'acord amb les instruccions del fabricant.
Puntuació histologia i lesió tubular. Tots els ratolins van ser sotmesos aronyóperfusió sota anestèsia 24 h després de CLP. ElronyóLes mostres es van fixar en un 4% de paraformaldehid durant 72 h a 4˚C. Les mostres de teixit es van deshidratar en una sèrie graduada de solucions d'etanol, incrustades en parafina i tallades en seccions de 4 µm. Les seccions (4 µm) es van tallar amb un micròtom i les seccions de teixit es van tenyir amb hematoxilina (5 min) i eosina (1 min) a temperatura ambient per a l'examen histològic. Les diapositives es van avaluar i classificar mitjançant un microscopi (BX51, Olympus Corporation).Renalstissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 per cent (13).
Microscòpia electrònica de transmissió (TEM).Frescronyonses van rentar amb solució salina tamponada amb fosfat i es van tallar en cubs d'1 mm i es van fixar seqüencialment en glutaraldehid al 2, 5 per cent durant 24 h a 4 °C. Les seccions es van submergir en tetròxid d'osmi a l'1 per cent durant 2 h a 4 °C, es van deshidratar en etanol graduat i es van incrustar en epoxiresina. Finalment, les seccions ultrafines (60 nm) es van tacar per doble amb acetat d'uranil i citrat de plom a 20 °C durant 60 min. L'observació es va realitzar en un microscopi electrònic de transmissió (Tecnai; Hitachi, Ltd.) a 80 kV mitjançant la pel·lícula de microscòpia electrònica 4489 (base gruixuda ESTAR; Kodak).
Immunohistoquímica (IHC).FrescronyóEls teixits es van fixar en paraformaldehid al 4% (durant 72 h a 4 °C) i es van incrustar en parafina. Les mostres es van tallar en seccions de 4 µm de gruix i es van desparafinar en xileno. Després de rentar les seccions de teixit amb PBS, es van bullir en tampó de citrat 10 mM (pH 6.0) durant 4 min per a la recuperació d'antigen i després es van bloquejar amb sèrum de cabra al 10 per cent en PBS a temperatura ambient. durant 1 h. L'anticòs primari (anti-LC3B; 1:400; cat. núm. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) es va afegir d'acord amb les instruccions i es va incubar a 4 °C durant 12 h. L'anticòs secundari (HRP anticonill de cabra; 1:2, 000; núm. cat. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) es va afegir i es va incubar a temperatura ambient durant 10 min. Es va afegir DAB (100 µl) i es va tacar durant 5 min amb la tinció observada amb un microscopi de llum (model CX31-P; Olympus Corporation). La intensitat de la tinció positiva, que semblava marró, es va determinar mitjançant el programari d'anàlisi d'imatges Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). Es va calcular la densitat òptica integral (IOD) per representar la intensitat. Els valors de IOD augmentaven a mesura que augmentava l'expressió de proteïnes.
Transcripció inversa-quantitativa(RT-q) PCR. Es va extreure l'ARN totalteixit renaldesprés de la inducció del model mitjançant el reactiu TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Segons les instruccions del kit de transcripció inversa TaqMan (núm. cat. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), l'ARN es va transcriure inversament a l'ADNc. Es van utilitzar les següents condicions de termociclatge (miR-214): desnaturalització inicial a 95 °C durant 5 min; seguits de 40 cicles de desnaturalització a 95 °C durant 30 segons, recuit a 60 °C durant 30 segons i allargament a 72 °C durant 30 segons. La RT-qPCR es va realitzar mitjançant un sistema de detecció de seqüències ABI Prism 7500 (PerkinElmer, Inc.) i un kit estàndard SYBR Green PCR (Toyobo Life Science). L'U6 es va utilitzar com a control intern per a miR-214. Les seqüències d'encebadors eren les següents: miR-214, endavant, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' i inversa, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, endavant, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' i enrere, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Aquests experiments es van repetir sis vegades. Els resultats es van analitzar mitjançant el mètode 2-ΔΔCq (14). Els nivells d'expressió d'ARNm de LC3, p62, PTEN, AKT i mTOR es van avaluar mitjançant RT-qPCR. Amb l'actina com a referència interna d'aquests gens, es va utilitzar el 2-ΔΔCq per mesurar l'expressió relativa dels gens diana. Les seqüències d'imprimació que es mostren a la taula I van ser sintetitzades per Sangon Biotech Co., Ltd.
Western blotting. Ronyóel teixit es va barrejar amb el lisat RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology) per fer l'homogeneïtat i es va aturar la lisi quan no es va observar cap teixit visible. Les mostres es van centrifugar a 13,000 xg durant 10 min a -4˚C i es va recuperar el sobrenedant per a l'anàlisi de Western blot. En resum, es van determinar les concentracions de proteïnes mitjançant el kit d'assaig de proteïnes micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Les mostres de proteïnes (80 µg per mostra) es van sotmetre a separar mitjançant la reducció d'un 12% d'electroforesi en gel de poliacrilamida de dodecil sulfat de sodi i després es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè a 4 °C durant la nit. Les proteïnes separades es van transferir a membranes de PVDF. Després del bloqueig en un 5% de llet desnatada a temperatura ambient durant 2 h, les membranes es van incubar durant la nit (a 4 °C) amb anticossos primaris. Es van utilitzar els anticossos primaris següents (tots Cell Signaling Technology, Inc.): cadena lleugera 3B (1:1,000; núm. cat. 4412), p62 (1:1,000; cat. . núm. 4412), Anti-PTEN (1:1,000; cat. núm. 9188), antifosforilat (p)-AKT (Ser473) (1:1,000; cat. . núm. 4060), anti-AKT (1:1,000; cat. núm. 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cat. núm. .5536), anti-mTOR (1:1,000; cat. núm. 2972) i -actina (1:2,000; cat. núm. 4970). Després del rentat, les membranes es van incubar (a temperatura ambient durant 2 h) amb els anticossos secundaris anti-conill conjugats amb HRP (1:3, 000; cat. núm. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Les bandes de proteïnes es van detectar amb Immobilon Western (MilliporeSigma) i es van analitzar mitjançant el programari Total-Lab TL120 (Dinàmica no lineal, 2.01). L'expressió de proteïnes es va normalitzar a -actina.
Anàlisi estadística. L'anàlisi estadística es va realitzar amb GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Totes les dades es van presentar com a mitjanes ± desviació estàndard o mitjanes (intervals interquartils) per a variables contínues, depenent de les seves distribucions. Les característiques i els resultats inicials es van comparar mitjançant ANOVA unidireccional seguit de la prova posthoc de Tukey o la prova de Kruskal-Wallis seguida de la prova de Dunn segons correspongui. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultats
Punt de temps 24 h després de CLP. Estudis anteriors han informat (6,15,16) que l'anàlisi bioquímica (és a dir, LC3 i p62) revela que el flux d'autofàgia es suprimeix amb la progressió de la sèpsia després de 6-8 h de CLP. En el present estudi, el nombre d'autolisosomes en elronyódels ratolins tractats amb CLP van augmentar en les 24 hores posteriors a la cirurgia. A més, l'anàlisi dels marcadors delesió renalva demostrar aixòfunció renales va danyar més greument 24 h després de CLP. Per tant, es va triar el punt de temps 24 h després de CLP per als experiments següents.
Efecte regulador sobre miR-214 en teixits renals. L'anàlisi RT-qPCR es va utilitzar per detectar l'expressió miR-214 en ratolins tractats amb CLP. Es va trobar que l'expressió de miR-214 estava lleugerament reguladaronyóteixits després de la cirurgia CLP 24 h, en comparació amb el grup simulat (1, 47 vegades, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">ronyóteixit, en comparació amb el grup simulat (tots dos P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE MILLORARÀ LA INSUFICIÈNCIA RENAL/RENAL
Efecte de miR-214 sobre la disfunció renal en ratolins sèptics.Tots els ratolins es van sacrificar per recollir sang, orina ironyómostres 24 h després de la cirurgia CLP. BUN i Cr són indicadors importants de la gravetat derenaldeteriorament (17). A més, NGAL i KIM-1 s'han identificat com a biomarcadors específics delesió renali la seva expressió augmentada s'associa amb la precoçrenallesió tubular en AKI (17). Com es mostra a la figura 2A-D, els nivells de BUN, Cr, KIM-1 i NGAL van augmentar significativament després de la cirurgia CLP en comparació amb el grup simulat. Tanmateix, Ad-miR-214 va disminuir significativament els nivells de BUN, Cr, KIM-1 i NGAL en comparació amb el grup CLP (tots P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">funció renalparàmetres. Tanmateix, després del pretractament amb inhibidor de PTEN, es van millorar els efectes de protecció d'Ad-miR-214. Els resultats mostren que miR-214 atenua la disfunció renal en ratolins sèptics.
Efecte de miR-214 sobre la inflamació renal i l'estrès oxidatiu.Com es mostra a les figures 3A i B, CLP va elevar significativament els nivells de TNF- i IL-6, mentre que Ad-miR-214 va disminuir significativament els nivells d'aquests marcadors. En comparació amb el
Efecte de miR-214 sobre l'autofàgia renal en ratolins sèptics.El present estudi va examinar els canvis en LC3 aronyóteixits mitjançant tinció IHC. Com es mostra a la figura 6, la intensitat LC3 de la tinció positiva va augmentar significativament en el grup CLP en comparació amb el grup simulat (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 activa la via AKT/mTOR per inhibirautofàgia silenciant PTEN en teixits renals.L'efecte del CLP sobre l'autofàgia aronyóEls teixits es van investigar avaluant els nivells de LC3-II/I i p62. La via de senyalització PTEN/AKT/mTOR té un paper important en l'autofàgia (18). Per investigar l'efecte de miR-214 en la via PTEN-AKT/mTOR, es van analitzar els nivells de proteïnes de LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR i PTEN mitjançant western blotting i RT- Anàlisi de qPCR. Com es mostra a la figura 7A-C, la modificació d'aquestes proteïnes es produeix ràpidament, amb un augment de la taxa de LC3-II/LC3-I i una reducció dels nivells de p62 (ambdues P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">ronyó tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Aquests resultats van mostrar que l'autofàgia va ser induïda per CLP i la sobreexpressió de miR-214 podria inhibir-la parcialment.
Com es mostra a la figura 7A i D-F, el nivell d'expressió de PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">ronyó tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Aquestes troballes suggereixen que CLP indueixronyóautofàgia tissular mitjançant la inhibició de la via AKT/mTOR. Ad-miR-214 va activar la via AKT/mTOR silenciant PTENronyóteixits. Tanmateix, en comparació amb el grup CLP, l'anti-miR-214 no va inhibir significativament l'expressió de mTOR. Per tant, RT-qPCR es va utilitzar més per determinar l'expressió de l'ARNm de gens relacionats amb la via de senyalització PTEN/AKT/mTOR. Segons els resultats de RT-qPCR (Fig. 8), en comparació amb el grup Sham, els nivells d'expressió d'ARNm de p62, LC3 i PTEN van augmentar notablement, mentre que l'expressió d'ARNm d'AKT i mTOR es va reduir en el grup CLP. En comparació amb el grup CLP, l'Ad-miR-214, PTEN
els grups inhibidor i Ad-miR-214 més inhibidor de PTEN van mostrar una disminució de l'expressió d'ARNm de LC3 i PTEN, però va augmentar l'expressió d'ARNm de p62, AKT i mTOR (tots els P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Així, l'efecte de p62 sobre l'autofàgia es pot produir a nivell transcripcional més que no a nivell post-transcripcional. Els resultats actuals van demostrar que miR-214 va regular a la baixa l'expressió de PTEN i va activar la via de senyalització AKT/mTOR.
Discussió
El present estudi va trobar que l'autofàgia excessiva era perjudicialfunció renalen ratolins sèptics. Estudis anteriors han demostrat que miR-214 s'associa amb un augment de la proliferació, metàstasi, invasió i funciona com a oncogen per a cèl·lules i teixits (19-22). Els estudis informen que miR-214 té un paper protector contra l'AKI mitjançant l'apoptosi atenuant, l'estrès oxidatiu i els factors inflamatoris que disminueixen (21,23). El present estudi va examinar més els mecanismes subjacents a l'efecte protector de miR-214 sobre l'IRA induïda per la sèpsia centrant-se en la possible implicació de miR-214 en la modulació de l'autofàgia. Els resultats van mostrar que l'estrès oxidatiu es va produir a laronyódesprés de l'administració de la cirurgia CLP. Mentrestant, l'activació de l'autofàgia es produeix alronyó.LC3 II/I elevat i la reducció de p62 a laronyóes va observar després del tractament amb cirurgia CLP. Com era d'esperar, la sobreexpressió de miR-214 es va atenuar significativamentronyólesions patològiques ironyódisfunció causada per sèpsia. Tanmateix, la inhibició de miR-214 va mostrar una tendència oposada a la renoprotecció. A més, l'efecte de protecció d'Ad-miR-214 es va millorar amb l'inhibidor de PTEN.
En una sèpticaronyó, la inflamació excessiva va acompanyada d'augments massius en la producció de ROS i un gran nombre de ROS desencadena canvis en l'estructura mitocondrial i perjudica la funció mitocondrial, cosa que fa que el cos entri en un cercle viciós que agreuja.ronyódany (24,25). Per tant, l'estrès oxidatiu pot ser un dels principals mecanismes patològics de l'IRA induïda per la sèpsia. El present estudi va proporcionar més proves que demostren un estrès oxidatiu excessiu, que es va indicar per l'augment de la producció de MDA i la reducció de l'activitat de SOD en elronyóteixits després de la cirurgia CLP. A més, es va trobar que la sobreexpressió de miR-214 podria protegirronyócontra la lesió oxidativa induïda per CLP, que està implicada en la inhibició autofàgica. Això és coherent amb els estudis anteriors que miR-214 protegeix diverses cèl·lules i teixits contra l'estrès oxidatiu (26,27).
L'autofàgia serveix com una "espasa de doble tall" en el desenvolupament de la sèpsia: l'autofàgia basal pot exercir efectes protectors eliminant les proteïnes oxidatives tòxiques, però l'autofàgia excessiva pot conduir a la mort cel·lular autofàgica sota estrès greu, com l'erupció de ROS (28,29) . S'ha demostrat que l'autofàgia s'activa inicialment en la sèpsia, seguida d'una fase posterior de disfunció a causa de la mort cel·lular autofàgica (30), que agreuja la lesió oxidativa induïda per la sèpsia. En el present estudi, l'inhibidor de PTEN o la sobreexpressió de miR-214 va mostrar una renoprotecció antioxidant en ratolins tractats amb CLP. Tanmateix, la inhibició de miR-214 va mostrar una tendència oposada a la renoprotecció antioxidant. Així que pot provocar una autofàgia excessiva o inadequadadany renal; tots dos són inadaptats i, finalment, provoquen la mort cel·lular. Per tant, mantenir nivells moderats d'autofàgia és la clau per atenuar la lesió oxidativa en estat sèptic.
CISTANCHE MILLORARÀ EL DOLOR RENAL/RENAL
L'evidència acumulada ha indicat que miR-214 inhibeix l'autofàgia en diverses cèl·lules i teixits (31-33). En el present estudi, es va trobar que la sobreexpressió de miR-214 inhibeix l'autofàgia induïda per CLP enteixits renals,tal com indiquen els canvis en els marcadors proteics, com ara LC3-II/I i p62. A més, els resultats van demostrar que la sobreexpressió de miR-214 va atenuar la lesió oxidativa induïda per CLP mitjançant la inhibició de l'autofàgia excessiva. El present estudi també va investigar els mecanismes moleculars pels quals modula miR-214ronyóautofàgia en AKI induïda per sèpsia. PTEN/AKT/mTOR és una via de senyalització important que regularonyóautofàgia (34, 35) i que té un paper clau en l'IRA induïda per la sèpsia, i PTEN és un inhibidor negatiu de la via de senyalització PI3K/AKT/mTOR. Estudis anteriors van informar que miR-214 pot regular l'autofàgia mitjançant la via de senyalització PI3K/AKT/mTOR en diversos models (36-38). Ma et al (39) van trobar que miR-214 pot regular a la baixa l'autofàgia als ronyons diabètics. Per tant, es va plantejar la hipòtesi que els efectes de miR-214 sobre l'AKI induïda per CLP podrien estar implicats en la regulació de la via PTEN / AKT / mTOR. En particular, els resultats del present estudi van mostrar que la cirurgia CLP va elevar significativament els nivells de PTEN, però va disminuir els nivells de p-AKT i p-mTOR, cosa que indica que la cirurgia CLP va inactivar la via AKT/mTOR. A més, la sobreexpressió de miR-214 va activar la via AKT/mTOR mitjançant el silenciament de PTEN en l'autofàgia induïda per CLP enronyóteixits. Tanmateix, l'anti-miR-214 no va inhibir significativament l'expressió de mTOR en les anàlisis de western blot. Així, RT-qPCR es va utilitzar més per determinar l'expressió de l'ARNm de gens relacionats amb la via de senyalització PTEN/AKT/mTOR. El present estudi va identificar que miR-214 va regular a la baixa l'expressió de PTEN i va activar la via de senyalització AKT/mTOR per inhibir l'autofàgia. Tanmateix, s'han de fer estudis exhaustius addicionals per obtenir detalls addicionals relacionats amb el mecanisme deronyóautofàgia en estat sèptic.
Per concloure, els resultats del present estudi van suggerir que miR-214 va tenir un paper protector contra la sèpsia induïda.lesió renalreduint l'estrès oxidatiu i inhibint l'autofàgia mitjançant la regulació de la via PTEN/AKT/mTOR. Les troballes actuals suggereixen que miR-214 pot ser un objectiu terapèutic potencial per a l'IRA induïda per la sèpsia. Tanmateix, el present estudi va utilitzar ratolins de 6 a 8 setmanes, per la qual cosa es necessita més investigació sobre el mecanisme de miR-214 en ratolins adults.